Induktion einer Harnröhrenstriktur mit anschließender Urethroplastik der Wangenschleimhauttransplantation im Rattenmodell

Summary

Im vorliegenden Protokoll wurde eine Harnröhrenstrikturinduktion bei Wistar-Ratten entwickelt, gefolgt von einer Harnröhrenrekonstruktion mit einem bukkalen Schleimhauttransplantat. Es wurden ein retrogrades Urethrogramm und eine Laser-Doppler-Beurteilung durchgeführt, um die Harnröhrenrekonstruktion (nach Strikturbildung) und die Transplantatplatzierung zu validieren.

Abstract

Die Harnröhrenrekonstruktion ist ein wichtiges Fachgebiet der Urologen. Die Wangenschleimhaut gilt als die beste Option, wenn eine Harnröhrentransplantation erforderlich ist, obwohl sie in einigen Fällen ungeeignet ist oder optimiert werden muss, um eine bestimmte Striktur zu reparieren. Daher ist die Entwicklung innovativer Verfahren und die Bewertung ihres vermeintlichen Erfolgs in experimentellen Modellen von entscheidender Bedeutung, um dem klinischen Bedarf gerecht zu werden. Zu diesem Zweck wird in dieser Studie ein Protokoll beschrieben, in dem eine Harnröhrenstriktur durch Elektrokauter bei Wistar-Ratten induziert wurde. Die Harnröhrenrekonstruktion wurde 1 Woche später mit einem bukkalen Schleimhauttransplantat durchgeführt, das aus der Unterlippe entnommen und in ventraler Onlay-Manier platziert wurde. Ein retrogrades Urethrogramm zeigte eine signifikante Verbesserung des Harnröhrendurchmessers nach Urethroplastik im Vergleich zum jeweiligen Wert nach Strikturinduktion. Zusätzlich wurde die Transplantatplatzierung mittels Blutperfusionsanalyse mittels Laserdoppler beurteilt. Erwartungsgemäß entsprach ein dunkelblauer Bereich dem nicht vaskularisierten Wangenschleimhauttransplantat. Dieses Verfahren kann den normalen pathophysiologischen Prozess der Harnröhrenverletzung und Gewebemodulation sowie die Harnröhrenrekonstruktion mit einem Wangenschleimhauttransplantat reproduzierbar simulieren und als Grundlage für zukünftige Forschungen auf der Grundlage von Tissue Engineering oder Harnröhrentransplantaten dienen.

Introduction

Die Harnröhrenrekonstruktion ist eine große Herausforderung für urologische Chirurgen bei der Behandlung von Harnröhrenverletzungen bei Strikturen, Traumata oder angeborenen Defekten¹. Mit kurativer Absicht ist die Urethroplastik für die meisten Patienten die Behandlung der Wahl, bei langen (>2 cm) und vorderen Harnröhrendefekten, die eine Form der Substitutions-Urethroplastik erfordern². Viele Gewebe wurden als Harnröhrenersatz verwendet, darunter vollständige oder gespaltene Hauttransplantate von genitalen oder extragenitalen Bereichen, der Blasenwandschleimhaut oder der weit verbreiteten Wangenschleimhaut². Wangenschleimhauttransplantate haben mehrere Vorteile, wie z. B. die Herkunft aus einer feuchten und haarlosen Umgebung, die einfache Ernte, die Resistenz gegen Infektionen, ein dickes Epithel, eine geringere Wahrscheinlichkeit der Bildung von Pseudodivertikeln und eine dünne Lamina, die eine frühe Aufnahme und Inoskulation ermöglicht³. Im Gegensatz zu Lappen haben Transplantate keine Blutversorgung, abhängig vom Gefäßbett des Empfängers, um zu überleben⁴.

Tiermodelle von Transplantaten oder Lappen wurden in großem Umfang verwendet, um chirurgische Techniken zu entwickeln oder zu verfeinern, die Gewebephysiologie, die zugrunde liegenden Mechanismen und Ursachen des Versagens zu untersuchen und zu verstehen und innovative Behandlungsstrategien zu bewerten ^5,6. Obwohl größere Tiere die technische Ausführung erleichtern, sind Nagetiere, insbesondere Ratten und Mäuse, einfacher zu handhaben und zu warten, resistent gegen Krankheiten, kostengünstiger und, was noch wichtiger ist, mit den Werkzeugen zur Untersuchung molekularer Mechanismen, die für die Erprobung innovativer Therapien von entscheidender Bedeutung sind ^5,6. Mehrere Modelle von Lappen und Transplantaten wurden bei Ratten beschrieben, die verschiedene Gewebe verwendeten, nämlich Haut, Knochen, Muskeln⁶, Gefäße⁵ und sogar solide Organe⁷. Es gibt jedoch nur wenige Untersuchungen in Mausmodellen zu Transplantaten für die Harnröhrenrekonstruktion oder das Tissue Engineering.

Nichtsdestotrotz hängen Fortschritte in der translationalen Wissenschaft von Tiermodellen ab, die Krankheiten nachahmen. Bisher wurde das lokale pathophysiologische Milieu nicht berücksichtigt, da die Harnröhrenrekonstruktion unmittelbar nach der Striktur durchgeführt wird. Ziel dieser Studie ist es, eine Harnröhrenrekonstruktion unter Verwendung eines bukkalen Mukosatransplantats in einer lokalen pathophysiologischen Umgebung durchzuführen. Mit diesem Ziel wurde die Harnröhrenstriktur 1 Woche vor ihrer Rekonstruktion induziert. Dieses experimentelle Modell, das an Ratten durchgeführt wird, ermöglicht es, innovative Therapien zu testen und ihre molekularen Mechanismen und klinischen Vorteile in Zukunft zu untersuchen.

Protocol

Alle tierärztlichen Eingriffe wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU durchgeführt. Die Verfahren wurden von der institutionellen Tierschutzbehörde genehmigt, die von der DGAV, der zuständigen portugiesischen Behörde für Tierschutz, lizenziert ist (Lizenznummer 0421/000/000/2021). Für die vorliegende Studie wurden männliche Wistar Han IGS (Crl:WI(Han)-Ratten (400-500 g) im Alter von 12-14 Wochen verwendet. Die Tiere stammten aus einer kommerziellen Quelle (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung von Lösungen

1. Anästhesielösung
   1. Eine 3-ml-Spritze mit 2,3 ml Medetomidin (1 mg/ml; 0,715 mg/kg Körpergewicht) füllen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   2. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit 1,55 ml Fentanyl (0,05 mg/ml; 0,02 mg/kg Körpergewicht) und füllen Sie sie in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen um.
   3. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit 6,15 ml Midazolam (5 mg/ml; 9,5 mg/kg Körpergewicht) und geben Sie sie in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wodurch eine 10-ml-Anästhesielösung entsteht.
   4. Beschriften Sie das Röhrchen und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Diese Anästhesiekombination (Medetomidin, Fentanyl und Midazolam) bietet ein chirurgisches Anästhesiefenster von bis zu 3 Stunden. Die Verabreichung von Atipamezol und Flumazenil kann die Wirkung rückgängig machen.
2. Anti-sedierende Lösung
   1. Eine 1-ml-Spritze mit 0,7 ml Atipamezol (5 mg/ml; 3,72 mg/kg Körpergewicht) füllen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   2. Füllen Sie eine 10-ml-Spritze mit 9,3 ml Flumazenil (0,1 mg/ml; 1,56 mg/kg Körpergewicht) und geben Sie sie in dasselbe 15-ml-Zentrifugenröhrchen, wodurch eine 10-ml-Antisedierungslösung entsteht.
   3. Beschriften Sie das Röhrchen und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln.
3. Postoperative Analgesie-Lösungen
   1. Eine 1-ml-Spritze mit 0,5 ml Carprofen (50 mg/ml; 5 mg/kg Körpergewicht) füllen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   2. 9,5 ml NaCl-Lösung (0,9 %) hinzufügen, um eine 10-ml-Carprofen-Lösung zu erhalten.
   3. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 1 ml Buprenorphin (0,3 mg/ml; 0,01-0,05 mg/kg Körpergewicht) und geben Sie sie in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen.
   4. 9 ml NaCl-Lösung (0,9 %) zugeben, um eine 10-ml-Buprenorphinlösung zu erhalten.
   5. Beschriften Sie die Röhrchen und lagern Sie sie bei 4 °C im Dunkeln.
4. Perioperatives Antibiotikum
   1. Eine 2,5-ml-Spritze mit 2,5 ml Enrofloxacin (25 mg/ml; 10 mg/kg Körpergewicht) füllen und in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführen.
   2. 7,5 ml NaCl-Lösung (0,9 %) zugeben, um eine 10-ml-Enrofloxacin-Lösung zu erhalten.
   3. Beschriften Sie das Röhrchen und lagern Sie es bei 4 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: Die Details aller Reagenzien zur Herstellung der oben genannten Lösungen sind in der Materialtabelle aufgeführt.

2. Chirurgische Induktion der Harnröhrenstriktur

HINWEIS: Die chirurgischen Eingriffe wurden mit einem Stereomikroskop (10x) durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor dem Gebrauch: Skalpellklinge (Nummer 11), spitze Pinzette, Federschere, chirurgische Pinzette, ophthalmischer Nadelhalter, chirurgische Schere und einen Nadelhalter. Verwenden Sie sterile Wattebäusche, um das Operationsfeld zu reinigen.
2. Befüllen Sie die Spritze mit der Anästhesielösung, bevor Sie die Ratte halten.
3. Halten Sie das Tier mit einem Schlauch oder einem Handtuch fest und heben Sie den Schwanz an, um den Hinterleib freizulegen.
4. Halten Sie das Tier fest und führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Anästhesielösung durch (hergestellt in Schritt 1.1).
5. Testen Sie die Pedalrückzugsreflexe der Ratte, um die Anästhesie zu beurteilen.
6. Tragen Sie schützendes Augengel auf beide Augen des Tieres auf. Es wird eine subkutane Injektion der Antibiotikalösung (hergestellt in Schritt 1.1) mit 10 mg/kg Körpergewicht durchgeführt.
7. Legen Sie die Ratte in die dorsale Dekubitusposition auf ein beheiztes Pad und verwenden Sie ein Dissektionsmikroskop mit 10- oder 20-facher Vergrößerung, um den chirurgischen Eingriff durchzuführen.
8. Reinigen Sie den Penis und die umgebende Bauchhaut mit Povidon-Jod (100 mg/ml).
9. Ziehen Sie die Vorhaut manuell zurück und platzieren Sie eine oberflächliche Haltenaht (7.0-Naht; siehe Materialtabelle) in der dorsalen Seite der Peniseichel, um den Penis zu traktieren, wobei der Nadelhalter an Ort und Stelle bleibt, um den Penis zurückgezogen zu halten.
10. Legen Sie einen 22 G Venenkatheter zur Katheterisierung mit einem Gleitgel in die Harnröhre.
11. Führen Sie mit einer chirurgischen Skalpellklinge (Nummer 11) einen 1 cm langen ventralen Schnitt in der Penishaut durch.
12. Sezieren Sie mit der spitzen Zange und der Federschere die Penisgewebeschichten, bis die Harnröhre in der Mitte des Schaftes freigelegt wird.
13. Mit einem Elektrokautergerät (siehe Materialtabelle) einen Strom mit 10 W für 1 s in den lateralen Aspekten der Harnröhre (an einer Stelle auf jeder Seite) ventral auf Höhe des Penismittelschaftes anlegen.
14. Verschließen Sie den Schnitt mit einem resorbierbaren Lauffaden 6,0 (siehe Materialtabelle).
15. Entfernen Sie den Harnröhrenkatheter. Entfernen Sie die Penistraktionsnaht.
16. Führen Sie die subkutane Injektion von Analgesie durch: Carprofen mit 5 mg/kg Körpergewicht und Buprenorphin mit 0,03 mg/kg Körpergewicht.
17. Die Spritze wird mit der Antisedativlösung (hergestellt in Schritt 1.2) beladen und mit dem Tier im ventralen Dekubitus die lose Haut umgespannt, um eine subkutane Injektion der Antisedativlösung zu verabreichen.

3. Chirurgischer Ablauf der Urethroplastik mit einem Wangenschleimhauttransplantat

HINWEIS: Die chirurgischen Eingriffe wurden mit einem Stereomikroskop (10x) durchgeführt (siehe Materialtabelle).

1. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente, die für diesen Eingriff benötigt werden: eine spitze Pinzette, eine Federschere, einen ophthalmologischen Nadelhalter, eine chirurgische Schere, einen Nadelhalter, drei Moskitopinzetten und eine Skalpellklinge (Nummer 11). Verwenden Sie kleine Schwämme, um das Operationsfeld zu reinigen.
2. Verabreichen Sie das Anästhetikum, das Antibiotikum, die Fixierung und platzieren Sie das Tier wie zuvor beschrieben (Schritte 2.2-2.8).
3. Reinigen Sie die Wangenschleimhaut der Unterlippe, des Penis und der umgebenden Bauchhaut mit Povidon-Jod (100 mg/ml).
4. Platzieren Sie drei Nähte (7,0 Nähte) in der Unterlippe, an beiden Seiten und in der Mitte, und lassen Sie jeweils eine Mücke in der Unterlippe, um die Unterlippe zurückzuziehen und die innere Schleimhaut freizulegen.
5. Entnehmen Sie mit einer Federschere und einer spitzen Pinzette ein Transplantat mit einem Durchmesser von 4 mm aus der inneren Wangenschleimhaut der Unterlippe und legen Sie es in einen kleinen Behälter mit steriler Kochsalzlösung (0,9 % NaCl).
6. Tragen Sie die Kompression im Spenderbereich mit einem Schwamm zur Blutstillung auf.
7. Entfernen Sie die zuvor gelegten Stagnähte der Unterlippe.
8. Entblößen Sie den Penis wie zuvor beschrieben (Schritt 2.9).
9. Legen Sie einen 22 G Venenkatheter zur Katheterisierung mit einem Gleitgel in die Harnröhre.
10. Führen Sie mit einer Federschere einen umlaufenden, subkoronalen Schnitt durch und enthandschuhen Sie den Penis bis zur Basis.
11. Mit der spitzen Pinzette und der Federschere die restlichen Schichten sezieren und die Harnröhre freilegen.
12. Führen Sie mit einer chirurgischen Skalpellklinge (Nummer 11) und einer Federschere einen ventralen Längsschnitt durch, der 3 mm distal des koronalen Sulcus in einer Verlängerung von 4 mm beginnt und die Harnröhre auf Höhe der zuvor eingeleiteten Striktur (Schritt 2) teilt.
13. Platzieren Sie zwei Nähte aus 7,0-Material, eine auf jeder Seite des Spatels, und lassen Sie eine Mücke in jeder Stechmücke, um die Harnröhre zurückzuziehen.
14. Platzieren Sie zwei nicht resorbierbare 7.0-Nähte, eine an jedem Ende des Spatels.
15. Platzieren Sie das Wangenschleimhauttransplantat in einer ventralen Onlay-Manier, wobei die Schleimhautseite zum Harnröhrenlumen zeigt.
16. Führen Sie eine der Nähte durch das Transplantatende und führen Sie eine halbe Ellipse mit einer laufenden Naht durch.
17. Wiederholen Sie Schritt 3.15 und Schritt 3.16 mit der anderen Naht auf der anderen Seite des Transplantats.
18. Entfernen Sie den Harnröhrenkatheter. Positionieren Sie die Penishaut neu.
19. Verschließen Sie den umlaufenden, subkoronalen Schnitt mit einer resorbierbaren unterbrochenen Naht von 6,0.
20. Entfernen Sie die Penistraktionsnaht.
21. Verabreichen Sie die Analgesie, gefolgt von der antisedativen Lösung, wie in den Schritten 2.16-2.17 beschrieben.

4. Postoperative Überwachung

1. Beobachten Sie die Ratten drei- bis viermal pro Stunde, um ihre Erholung von der Narkose zu bestätigen. Überwachen Sie die Atmung und beurteilen Sie die Pedal- und Augenreflexe.
2. Subkutan injizieren Sie 48 Stunden lang alle 12 Stunden eine Analgesie.
   HINWEIS: Carprofen wurde in einer Dosierung von 1 ml/500 mg Körpergewicht und Buprenorphin in einer Dosierung von 0,5 ml/500 mg Körpergewicht verabreicht (siehe Materialtabelle).
3. Nach jedem Eingriff 48 Stunden lang weiche Nahrung und Wasser nach Belieben bereitstellen.
4. Überwachen Sie die Ratten täglich nach der Operation und registrieren Sie ihren Gesundheitszustand und das Aussehen der Operationsstelle. Zu den bewerteten Anzeichen gehören Gesichtsausdruck, Lautäußerung, Aktivitätszustand, Anzeichen von Schmerzen, Nahrungs- und Getränkeaufnahme, Blasenentleerung und Blutung.

5. Beurteilung der Blutperfusion

HINWEIS: Der Blutfluss wird unmittelbar vor der Strikturinduktion, unmittelbar vor der Urethroplastik und unmittelbar nach der Urethroplastik gemessen.

1. Führen Sie eine Laser-Doppler-Perfusionsbildgebung durch.
   1. Betäuben Sie die Ratten mit der Anästhesielösung (Schritt 1.1).
   2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf ein 37 °C heißes Heizkissen mit Penistraktion, wie in Schritt 2.9 beschrieben.
   3. Starten Sie den Laser-Doppler-Perfusions-Imager (siehe Materialtabelle), um Daten zu erhalten. Stellen Sie den Interessenbereich ein, der vom Laserstrahl gelesen werden soll.
   4. Tragen Sie die antisedierende Lösung (Schritt 1.2) auf, um die Anästhesie rückgängig zu machen.
   5. Zeichnen Sie mit der Bildanalysesoftware die Region of Interest (ROI) um den Bereich des Penis herum und registrieren Sie die Flusswerte im Laufe der Zeit.

6. Röntgenuntersuchung

HINWEIS: Die Bestätigung der Strikturinduktion und der Strikturauflösung nach Urethroplastik wird mit einem retrograden Urethrogramm bestätigt. Diese Beurteilung wird 1 Woche nach der Strikturinduktion (vor der Urethroplastik) und 2 Wochen nach der Urethroplastik durchgeführt.

1. Führen Sie ein retrogrades Urethrogramm mit einem Monoplan-Angiographiesystem durch (siehe Materialtabelle).
   1. Betäuben Sie die Ratten mit der Anästhesielösung.
   2. Legen Sie das Tier auf die Angiographie-Matratze in einen schrägen Dekubitus rechts mit Penistraktion, wie in Schritt 2.9 beschrieben.
   3. Fokussieren Sie den Kegelstrahl auf den Beckenbereich des Tieres, einschließlich des Penis.
   4. Legen Sie einen 22 G Venenkatheter 2 mm in die distale Harnröhre ein.
   5. Beginnen Sie mit der Instillation von 1 ml Jod-Röntgenkontrastmittel (1:1-Verhältnis von 623 mg/ml Ipromidlösung und 0,9 % NaCl) in die Harnröhre.
   6. Führen Sie gleichzeitig eine einfache Röntgenaufnahme durch, um den Röntgenkontrast zu identifizieren, der das Harnröhrenlumen erfüllt, und beurteilen Sie den Harnröhrendurchmesser.
   7. Nach Abschluss der Bildgebung wird die Anästhesie mit der antisedativen Lösung rückgängig gemacht.

7. Euthanasie

HINWEIS: Die Euthanasie wird 3 Wochen nach der Urethroplastik (4 Wochen nach der Strikturinduktion) unmittelbar nach der letzten Perfusionsuntersuchung durchgeführt.

1. Füllen Sie eine 2,5-ml-Spritze mit 2 ml/kg Pentobarbital-Natrium (400 mg/ml).
2. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Lösung durch, um das Tier einzuschläfern.

Representative Results

Insgesamt wurden 12 männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 400-500 g und einem Alter von 12-14 Wochen zur Induktion der Harnröhrenstriktur verwendet. 1 Woche später wurde ein retrogrades Urethrogramm (RUG1) durchgeführt⁸, das den Erfolg der Technik bestätigte. Der Harnröhrendurchmesser wurde in Millimetern auf Höhe der Strikturinduktion gemessen. Danach wurde eine Urethroplastik mit einem Wangenschleimhauttransplantat in der ventralen Fläche der Rattenharnröhre durchgeführt. Dieselben Ratten wurden 14 Tage nach der Urethroplastik einem zweiten retrograden Urethrogramm (RUG2) unterzogen, und der Harnröhrendurchmesser wurde in Millimetern auf Höhe der Transplantatplatzierung gemessen. Die mittleren Durchmesser von RUG1 und RUG2 betrugen 1,04 mm bzw. 1,52 mm und zeigten eine signifikante Verbesserung (p < 0,0001) der Harnröhrenpermeabilität (Abbildung 1), was den Erfolg des chirurgischen Eingriffs und die gute Konsistenz zwischen den Messungen bestätigt.

Die lokale Perfusion wurde auch unmittelbar vor und nach der Urethroplastik mittels Laser-Doppler als nicht-invasive Methode zur Überwachung der mikrozirkulatorischen Umgebung des Gewebes untersucht. Die Gewebedurchblutung wird in farbkodierten Bildern dargestellt, wobei eine geringe oder keine Durchblutung dunkelblau und die höchsten Durchblutungswerte rot sind. Die mittleren Flusswerte werden mit der Bildverarbeitungssoftware Moor LDI V5.3 ermittelt (siehe Materialtabelle).

Unter Berücksichtigung der Variabilität der Rattenpopulation wurden 35 männliche Wistar-Ratten verwendet. Der mittlere Blutfluss vor und unmittelbar nach der Urethroplastik betrug 603,4 bzw. 137,6 beliebige Einheiten (A.E.). Erwartungsgemäß entspricht der Bereich, der eine signifikante Reduktion (p < 0,0001) des lokalen Blutflusses (in blau) aufweist, dem nicht vaskularisierten Transplantat (Abbildung 2).

Eine gute Verträglichkeit des Anästhesieverfahrens wurde bei allen Versuchstieren festgestellt; Frühere Ergebnisse im Labor (Daten nicht gezeigt) zeigten jedoch, dass die Anästhesiezeit entscheidend sein könnte, um eine vollständige Genesung des Tieres zu ermöglichen, vorzugsweise nicht länger als 45 Minuten. Auch postoperativ waren die Ratten frei von größeren Komplikationen.

Abbildung 1: Analyse des retrograden Urethrogramms (RUG). (A) Repräsentative Bilder eines retrograden Urethrogramms vor (RUG1) und 14 Tage nach der Urethroplastik (RUG2). (B) Die quantitative Auswertung des in Millimetern ausgedrückten Durchmessers ergab 14 Tage nach der Urethroplastik eine signifikante Verbesserung. Abkürzungen: RUG1 = Retrogrades Urethrogramm vor der Urethroplastik; RUG2 = Retrogrades Urethrogramm 14 Tage nach der Urethroplastik. Die Veränderungen zwischen den Gruppen wurden mit einem zweiseitigen gepaarten t-Test (n = 12) bewertet. Maßstab: 10 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Laser-Doppler-Analyse. (A) Repräsentative Bilder des Laser-Doppler-Flusses vor und unmittelbar nach der Urethroplastik. (B) Die quantitative Auswertung des Blutflusses ergab eine signifikant verminderte Durchblutung nach Urethroplastik. Die Veränderungen zwischen den Gruppen wurden durch einen zweiseitigen Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed Rank-Test (n = 35) bewertet. Maßstab: 0,5 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Die Urethroplastik mit Wangenschleimhauttransplantaten ist ein wichtiger Eckpfeiler bei der Harnröhrenrekonstruktion. Es sollten jedoch innovative Verfahren entwickelt werden, um die bereits beschriebenen zu optimieren und neue zu etablieren, wie z. B. Tissue-Engineering-Materialien und biologische Transplantate, um Komplikationen und Morbidität zu reduzieren. Es wurden mehrere Verfahren veröffentlicht, um präklinische Modelle zu erstellen und Operationstechniken zu definieren. Souza et ^al.1 führten eine Studie mit 12 neuseeländischen Kaninchen durch. Es wurde ein ventraler Längsschnitt der Haut durchgeführt und die Harnröhre aus der Tunica albuginea mobilisiert, gefolgt von der Exzision eines dorsalen Segments der Harnröhre, wodurch ein Defekt entstand. Gleichzeitig wurde ein Wangenschleimhauttransplantat entnommen und als dorsales Onlay mit einer 7-0 resorbierbaren Naht platziert. In der vorliegenden Studie werden männliche Wistar-Ratten verwendet. Aufgrund der geringeren Größe sind sie technisch anspruchsvoller, obwohl einfacher zu handhaben. Um die Pathophysiologie von Harnröhrenstrikturen und die Physiologie des Transplantats nachzuahmen, wurde in diesem Modell zuvor eine Harnröhrenstriktur-ähnliche Erkrankung induziert, im Gegensatz zu einem Harnröhrendefekt, der gleichzeitig mit der Urethroplastik durchgeführt wurde. Wie bei Souza et al. wurden auch Fäden verwendet, um die Harnröhre mit dem Transplantat zu verschließen¹. Dennoch wurde die nicht resorbierbare Naht verwendet, da diese die Identifizierung des Transplantatumfangs in weiteren, z.B. histologischen Studien ermöglicht. Martín-Cano et ^al.9 entwickelten ein Modell mit Wistar-Ratten. Es wurde ein subkoronaler zirkumferentieller Schnitt gemacht, gefolgt von einem Penis-Degloving, was eine gute Harnröhrenfreilegung ermöglichte. Das Transplantat wurde aus der Unterlippe entnommen, die Harnröhre wurde durch einen longitudinalen ventralen Mittellinienschnitt eröffnet und das Transplantat wurde in ventraler Onlay-Manier mit nicht resorbierbaren laufenden Nähten platziert. Während des Eingriffs wurde ein Harnröhrenkatheter gelegt, um das Harnröhrenpatent zu erhalten. Diese hierin beschriebene Technik verwendet den gleichen Ansatz des Penis-Degloving, der eine gute Exposition der Harnröhre und das Platzieren eines Katheters ermöglicht, um die Harnröhre während des Eingriffs offen zu halten. Martín-Cano et al. führten bei dem Eingriff jedoch keine früheren Harnröhrenverletzungen durch, die die natürliche Transplantatentnahme beeinflusst haben könnten, da das Gewebe gesünder war.

In der Tat wurde eine einfache Harnröhrenverletzung und -heilung von anderen untersucht, wie Hofer et ^al.10, die ein Rattenmodell mit Wistar-Ratten entwickelten, das aus einem subkoronalen Umfangsschnitt, einem Penis-Degloving und einem longitudinalen ventralen Mittellinienschnitt bestand, um die Harnröhre zu verletzen, gefolgt von einem Verschluss mit einer laufenden Naht. Die Schlussfolgerung war, dass in Phasen der Entzündung, der Proliferation, der Reifung und des Umbaus analog zur Hautheilung die Heilung der Harnröhre stattfindet. Dies beschränkt sich nicht nur auf die Verletzungsstelle, sondern gilt auch für die überwiegende Mehrheit des periurethralen Gewebes und des Corpus spongiosum. Tavucku et ^al.11beschrieben auch ein Modell der Harnröhrenverletzung mit Sprague-Dawley-Ratten, bei denen ein penoskrotaler ventraler Hautschnitt in der Mittellinie durchgeführt wurde, um die Harnröhre freizulegen, und dann Elektrokauterstrom anlegte, um eine Harnröhrenverletzung zu induzieren. Ihre Daten zeigten ein erhöhtes Verhältnis von Kollagen Typ I zu Kollagen Typ III, ein starker Indikator für Fibrose. Folgt man dieser Logik, weist ein verletztes Gewebe mehr Fibrose auf als ein gesundes, und es wird erwartet, dass die Transplantatentnahmen in beiden Geweben nicht gleich sind. Unter der Annahme, dass Urethroplastiken in verletztem Gewebe durchgeführt werden, besteht ein großer Vorteil dieses Modells darin, dass es den normalen pathophysiologischen Prozess besser nachahmt. Ein weiterer großer Vorteil ist die Realisierung eines retrograden Urethrogramms zur Bestätigung der Strikturinduktion und später zur Bestätigung des Erfolgs der Urethroplastik anhand des Harnröhrendurchmessers. Tatsächlich hatten alle Tiere nach der Urethroplastik einen verbesserten Harnröhrendurchmesser, was den Erfolg des Eingriffs zeigt. Souza et ^al.1führten ebenfalls ein retrogrades Urethrogramm durch, jedoch erst am Ende der Studie. In dieser Studie und in Tavukcu et ^al.11 wurden beide Urethrogramme durchgeführt, die die Wirksamkeit des Verfahrens durch eine Urethrogrammanalyse abschließen. Zusätzlich wurde vor und nach der Urethroplastik eine Perfusionsuntersuchung durchgeführt, die einen gesamten nicht-vaskularisierten (blauen) Bereich bestätigte, der dem Wangenschleimhauttransplantat entsprach.

Dennoch gibt es einige Einschränkungen im Zusammenhang mit diesem Verfahren, wie z. B. die Größe der Harnröhre der Ratten, was zu einer anspruchsvollen Operationstechnik führt, die Operationsdauer und das Fehlen einer flüchtigen Anästhesie. Es ist jedoch wichtig zu bedenken, dass größere Tiere zwar eine einfachere technische Ausführung ermöglichen, aber im Vergleich zu Nagetieren weniger molekulare Werkzeuge zur Verfügung stehen, was die Untersuchung der molekularen Mechanismen hinter innovativen Therapien einschränken kann. Eine weitere Einschränkung ist die Verwendung einer einzigen Methode zur Induktion einer Harnröhrenstriktur, die auf viele andere Ursachen zurückzuführen sein kann, einschließlich Traumata, Infektionen oder angeborene Defekte, die zu unterschiedlichen pathophysiologischen Phänotypen führen können. Es wurde jedoch der Elektrokauter verwendet, da er einen einfachen, leichten und reproduzierbaren Ansatz mit konsistenten Ergebnissen ermöglicht.

Unseres Wissens ist dies das erste Rattenverfahren, das: (1) eine lokale pathophysiologische Umgebung vor dem Transplantat nachahmt, indem 1 Woche vor der Platzierung des Transplantats eine Harnröhrenstriktur induziert wird; (2) bestätigt die Harnröhrenstriktur und deren Auflösung durch retrogrades Urethrogramm; (3) bestätigt die Transplantatposition durch Laser-Doppler; und (4) ermöglicht ein experimentelles Modell, um die Verwendung von Transplantaten zu optimieren und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die beispielsweise auf Tissue-Engineering-Materialien basieren, in denen molekulare Mechanismen untersucht werden könnten, mit Auswirkungen auf die translationale Wissenschaft, um den klinischen Anforderungen gerecht zu werden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole	OrionPharma		ANTISEDAN (atipamezole) is indicated for the reversal of the sedative and analgesic effects.
Buprenorphine	RichterPharma		Buprenorphine is a derivative of the opioid alkaloid thebaine that is a more potent (25-40 times) and longer lasting analgesic than morphine.
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Stereo Microscope	Carl Zeiss Microscopy, Germany		OPMI 1 FC from ZEISS symbolizes quality, precision and reliability. The manual system is easy to use and delivers high fidelity images with the legendary ZEISS optics.
Carprofen	Zoetis		Carprofen is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) of the propionic acid class.
Catheter 22 G. x 1''	B Braun	Introcan Safety	IV Catheter of fluorinated ethylene propylene (FEP) with firmer construction for arterial access.
Enrofloxacin	Bayer		Enrofloxacin is a fluoroquinolone antibiotic.
Fentanyl	Braun	3644960	Fentanyl is a powerful synthetic opioid analgesic.
Flumazenil	Fresenius Kabi		Benzodiazepine antagonist is used for the complete or partial reversal of the sedative effects caused by benzodiazepines.
High temperature cautery	Fiab	F7244	Disposable cautery, sterile, high temperature (1200 °C), 28 mm fine tip.
Instillagel gel	Farco-pharma		Cellulose-based lubricant with local anaesthetic and disinfecting properties.
Iopromide	Bayer		Non-ionic injectable contrast medium, with iodine.
Laser Doppler imaging system (perfusion imager moorLDI2-HIR and dedicated software)	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK	5710	The angiogenesis models uses Laser Doppler imaging to assess blood perfusion in the hind limbs, one of which is ligated surgically. Dedicated measurement and comparison software allows the definition of regions of interest for blood flow assessment on the ischaemic versus non-ischaemic limb to establish a "reperfusion ratio" which can be assessed as often as needed and over a number of days on the same subject.
Lubrithal Eye Gel	Dechra		Eye gel used in animals for prevention of dry eyes during anaesthesia. Lubricating and moisturising action on cornea and conjunctiva.
Male Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) rats	Charles River Laboratories, Spain		Twelve to fourteen-week-old
Metedomidin	Virbac	037/01/07RFVPT	Medetomidine is a synthetic drug used as surgical anesthetic.
Midazolam	Labesfal		Benzodiazepine medication is used for anesthesia and procedural sedation.
Monoplan Angiography System	Philips Medical Systems	Azurion 7 M20	A stationary diagnostic fluoroscopic x-ray system specifically designed to optimize the capability of users to visually and quantitatively evaluate the anatomy and function of blood vessels of the heart, brain and other organs, as well as the lymphatic system.
Mosquito forceps	Henry Schein	102-4346	Hartman-Mosquito Hemostatic Forcep Curved 3-1/2" Stainless Steel
Needle Holder	Henry Schein	100-2570	Needle holder Mayo-Hegar, stainless steel, 14 cm
Ophtalmic Needle Holder	Asico	AE-6143	Needle holder barranquer most delicate without lock
Pentobarbital Sodium	Ecuphar		Pentobarbital Sodium is the sodium salt of pentobarbital used for euthanasia.
Pointed Forceps	Aesculap	BD335R	Microforceps, 0.30 mm tip
Polysorb 6.0	Medtronic (Covidien)	UL-101	Coated Synthetic Absorbable Suture aimed to reduce the inflammatory reaction in tissues, followed by gradual encapsulation of the suture by fibrous connective tissue.
Providone-Iodine	Mylan		Povidone-iodine 10% is an antiseptic drug, used as a disinfectant before and after surgery.
Scalpel Blade nº11	B Braun	BB511	Carbon steel, sterile
Spring Scissor	Henry Schein	600-4826	Surgical scissors 31 castroviejo
Surgical Forceps	Aesculap	BD33R	Microforceps, 0.20mm tip
Surgical Scissor	Aesculap	MA873R	Micro Iris Scissor, curved shrap tips
SurgiPro 7.0	Medtronic (Coviden)	VP-702-X	Non-Absorbable Monofilament Polypropylene Suture indicated for use in general soft tissue ligation.