Induzione della stenosi uretrale seguita da uretroplastica dell'innesto della mucosa buccale in un modello di ratto

Summary

Nel presente protocollo, è stata sviluppata un'induzione della stenosi uretrale nei ratti Wistar, seguita da una ricostruzione uretrale con un innesto di mucosa vestibolare. Sono stati eseguiti un uretrogramma retrogrado e una valutazione laser Doppler, convalidando la ricostruzione uretrale (dopo la formazione della stenosi) e il posizionamento dell'innesto.

Abstract

La ricostruzione uretrale è un'importante area di competenza per gli urologi. La mucosa vestibolare è considerata l'opzione migliore quando è necessario l'innesto uretrale, anche se in alcuni casi è inappropriata o deve essere ottimizzata per riparare una determinata stenosi. Pertanto, lo sviluppo di procedure innovative e la valutazione del loro presunto successo in modelli sperimentali è fondamentale per soddisfare le esigenze cliniche. Con questo obiettivo, questo studio descrive un protocollo in cui la stenosi uretrale è stata indotta dall'elettrocauterizzazione nei ratti Wistar. La ricostruzione uretrale è stata eseguita 1 settimana dopo con un innesto di mucosa vestibolare, prelevato dal labbro inferiore e posizionato in modo onlay ventrale. Un uretrogramma ha mostrato un miglioramento significativo del diametro uretrale dopo l'uretroplastica rispetto al rispettivo valore dopo l'induzione della stenosi. Inoltre, il posizionamento dell'innesto è stato valutato mediante analisi di perfusione sanguigna utilizzando laser Doppler. Come previsto, un'area blu scuro corrispondeva all'innesto di mucosa buccale non vascolarizzata. Questa procedura può simulare con successo il normale processo fisiopatologico di lesione uretrale e modulazione tissutale, nonché la ricostruzione uretrale utilizzando un innesto di mucosa vestibolare in modo riproducibile e fungere da base per la ricerca futura basata sull'ingegneria tissutale o sugli innesti uretrali.

Introduction

La ricostruzione uretrale è una delle principali sfide per i chirurghi urologici nella gestione delle lesioni uretrali nel contesto di stenosi, traumi o difetti congeniti¹. Con intento curativo, l'uretroplastica è il trattamento di scelta per la maggior parte dei pazienti, con difetti uretrali lunghi (>2 cm) e anteriori che richiedono una qualche forma di uretroplastica sostitutiva². Molti tessuti sono stati utilizzati come sostituti uretrali, tra cui innesti cutanei a pieno spessore o a spessore diviso di aree genitali o extragenitali, mucosa della parete vescicale o della mucosa vestibolare diffusa². Gli innesti di mucosa buccale presentano diversi vantaggi, come la provenire da un ambiente umido e glabro, la facilità di raccolta, la resistenza alle infezioni, un epitelio spesso, una ridotta probabilità di formazione di pseudo-diverticolo e una lamina sottile, che consente l'imbibizione e l'inosculazione precoce³. A differenza dei lembi, gli innesti non hanno afflusso di sangue, a seconda del letto vascolare del ricevente per sopravvivere⁴.

I modelli animali di innesti o lembi sono stati ampiamente utilizzati per sviluppare o perfezionare tecniche chirurgiche, studiare e comprendere la fisiologia dei tessuti, i meccanismi sottostanti e le cause di fallimento e valutare strategie di trattamento innovative ^5,6. Sebbene gli animali più grandi facilitino l'esecuzione tecnica, i roditori, in particolare ratti e topi, sono più facili da maneggiare e mantenere, resistenti alle malattie, più convenienti e, soprattutto, con gli strumenti per studiare i meccanismi molecolari, cruciali per testare terapie innovative ^5,6. Diversi modelli di lembi e innesti sono stati descritti nei ratti utilizzando diversi tessuti, vale a dire pelle, ossa, muscoli^{6, vasi} 5 e persino organi solidi⁷. Tuttavia, c'è scarsa ricerca nei modelli murini sugli innesti per la ricostruzione uretrale o l'ingegneria tissutale.

Ciononostante, i progressi della scienza traslazionale dipendono da modelli animali che imitano la malattia. Finora, l'ambiente fisiopatologico locale non è stato affrontato, poiché la ricostruzione uretrale viene eseguita immediatamente dopo la sua stenosi. In questo studio, questo studio si propone di eseguire una ricostruzione uretrale utilizzando un innesto di mucosa vestibolare in un ambiente fisiopatologico locale. Con questo obiettivo, la stenosi uretrale è stata indotta 1 settimana prima della sua ricostruzione. Questo modello sperimentale, eseguito sui ratti, permette di testare terapie innovative e di studiarne in futuro i meccanismi molecolari e i vantaggi clinici.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE. Le procedure sono state approvate dall'Ente istituzionale per il benessere degli animali, autorizzato dalla DGAV, l'autorità portoghese competente per la protezione degli animali (numero di licenza 0421/000/000/2021). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) (400-500 g) a 12-14 settimane di età. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione delle soluzioni

1. Soluzione anestetica
   1. Riempire una siringa da 3 mL con 2,3 mL di medetomidina (1 mg/mL; 0,715 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Riempire una siringa da 3 mL con 1,55 mL di fentanil (0,05 mg/mL; 0,02 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL.
   3. Riempire una siringa da 10 mL con 6,15 mL di midazolam (5 mg/mL; 9,5 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL, ottenendo così una soluzione anestetica da 10 mL.
   4. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
      NOTA: Questa combinazione di anestetici (medetomidina, fentanil e midazolam) fornisce una finestra chirurgica anestetica fino a 3 ore. La somministrazione di atipamezolo e flumazenil può invertire l'effetto.
2. Soluzione anti-sedativa
   1. Riempire una siringa da 1 mL con 0,7 mL di atipamezolo (5 mg/mL; 3,72 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Riempire una siringa da 10 mL con 9,3 mL di flumazenil (0,1 mg/mL; 1,56 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL, ottenendo così una soluzione antisedativa da 10 mL.
   3. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
3. Soluzioni per l'analgesia postoperatoria
   1. Riempire una siringa da 1 mL con 0,5 mL di carprofene (50 mg/mL; 5 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungere 9,5 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di 10 mL di carprofene.
   3. Riempire una siringa da 1 mL con 1 mL di buprenorfina (0,3 mg/mL; 0,01-0,05 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   4. Aggiungere 9 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di buprenorfina da 10 mL.
   5. Etichettare le provette e conservarle al buio a 4 °C.
4. Antibiotico perioperatorio
   1. Riempire una siringa da 2,5 mL con 2,5 mL di enrofloxacina (25 mg/mL; 10 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungere 7,5 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di enrofloxacina da 10 mL.
   3. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
      NOTA: I dettagli di tutti i reagenti per preparare le soluzioni di cui sopra sono elencati nella Tabella dei materiali.

2. Induzione chirurgica della stenosi uretrale

NOTA: Le procedure chirurgiche sono state eseguite utilizzando uno stereomicroscopio (10x) (vedi Tabella dei materiali).

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso: lama del bisturi (numero 11), pinza appuntita, forbici a molla, pinza chirurgica, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche e un porta aghi. Utilizzare batuffoli di cotone sterili per pulire il campo operatorio.
2. Caricare la siringa con la soluzione anestetica prima di tenere in braccio il ratto.
3. Trattieni l'animale usando un tubo o un asciugamano e solleva la coda per esporre l'addome.
4. Tenere l'animale trattenuto ed eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione anestetica (preparata al punto 1.1).
5. Testare i riflessi di ritiro del pedale del ratto per valutare l'anestesia.
6. Applicare il gel protettivo per gli occhi in entrambi gli occhi dell'animale. Eseguire un'iniezione sottocutanea della soluzione antibiotica (preparata al punto 1.1), a 10 mg/kg di peso corporeo.
7. Posizionare il ratto in posizione di decubito dorsale su un cuscinetto riscaldato e utilizzare un microscopio da dissezione con ingrandimento 10x o 20x per eseguire la procedura chirurgica.
8. Pulire il pene e la pelle addominale circostante con iodio povidone (100 mg/ml).
9. Ritrarre manualmente il prepuzio e posizionare una sutura superficiale (sutura 7.0; vedere la tabella dei materiali) nella faccia dorsale del glande del pene per applicare trazione al pene, lasciando il supporto dell'ago in posizione per mantenere il pene retratto.
10. Posizionare un catetere venoso da 22 G nell'uretra per il cateterismo utilizzando un gel lubrificante.
11. Utilizzando una lama di bisturi chirurgico (numero 11), eseguire un'incisione ventrale longitudinale di 1 cm nella pelle del pene.
12. Usando la pinza appuntita e le forbici a molla, sezionare gli strati di tessuto del pene fino a esporre l'uretra a livello dell'asta centrale.
13. Con un dispositivo di elettrocauterizzazione (vedi Tabella dei materiali), applicare una corrente con 10 W, per 1 s, negli aspetti laterali dell'uretra (in un punto su ciascun lato), ventralmente a livello dell'asta mediana del pene.
14. Chiudere l'incisione con una sutura da corsa riassorbibile 6.0 (vedi Tabella dei materiali).
15. Rimuovere il catetere uretrale. Rimuovere la sutura di trazione del pene.
16. Eseguire l'iniezione sottocutanea di analgesia: Carprofene a 5 mg/kg di peso corporeo e buprenorfina a 0,03 mg/kg di peso corporeo.
17. Caricare la siringa con la soluzione antisedativa (preparata al punto 1.2) e, con l'animale in decubito ventrale, tendere la pelle flaccida per somministrare un'iniezione sottocutanea della soluzione antisedativa.

3. Procedura chirurgica di uretroplastica con innesto di mucosa vestibolare

NOTA: Le procedure chirurgiche sono state eseguite utilizzando uno stereomicroscopio (10x) (vedi Tabella dei materiali).

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari per questo intervento: pinza appuntita, forbici a molla, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche, porta aghi, tre pinze per zanzare e una lama per bisturi (numero 11). Utilizzare piccole spugne per pulire il campo operatorio.
2. Somministrare l'anestetico, l'antibiotico, il trattenimento e posizionare l'animale come descritto in precedenza (passaggi 2.2-2.8).
3. Pulire la mucosa buccale del labbro inferiore, il pene e la pelle addominale circostante con iodio povidone (100 mg/ml).
4. Posizionare tre punti di sutura (7.0 suture) nel labbro inferiore, su entrambi i lati e al centro, e lasciare una zanzara in ciascuno di essi per ritrarre il labbro inferiore ed esporre la mucosa interna.
5. Utilizzando forbici a molla e pinze appuntite, prelevare un innesto di 4 mm di diametro della mucosa buccale interna del labbro inferiore e posizionarlo in un piccolo recipiente con soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl).
6. Applicare la compressione nell'area donatrice con una spugna per l'emostasi.
7. Rimuovere i punti di sutura del labbro inferiore.
8. Esporre il pene come descritto in precedenza (passaggio 2.9).
9. Posizionare un catetere venoso da 22 G nell'uretra per il cateterismo utilizzando un gel lubrificante.
10. Usando le forbici a molla, eseguire un'incisione circonferenziale sub-coronale e deglove il pene alla base.
11. Usando la pinza appuntita e le forbici a molla, sezionare gli strati rimanenti ed esporre l'uretra.
12. Utilizzando una lama di bisturi chirurgico (numero 11) e forbici a molla, eseguire un'incisione ventrale longitudinale, partendo da 3 mm distale al solco coronale in un'estensione di 4 mm, spatolando l'uretra a livello della stenosi precedentemente indotta (fase 2).
13. Posizionare due suture di materiale 7.0, una su ciascun lato della spatolazione, e lasciare una zanzara in ciascuna di esse per ritrarre l'uretra.
14. Posizionare due punti di sutura 7.0 non assorbibili, uno a ciascuna estremità della spatola.
15. Posizionare l'innesto di mucosa vestibolare in modo onlay ventrale con il lato della mucosa rivolto verso il lume uretrale.
16. Passare una delle suture attraverso l'estremità dell'innesto ed eseguire una mezza ellisse con una sutura corrente.
17. Ripetere i passaggi 3.15 e 3.16 con l'altra sutura sull'altro lato dell'innesto.
18. Rimuovere il catetere uretrale. Riposizionare la pelle del pene.
19. Chiudere l'incisione circonferenziale sub-coronale con una sutura interrotta riassorbibile 6.0.
20. Rimuovere la sutura di trazione del pene.
21. Somministrare l'analgesia seguita dalla soluzione antisedativa, come descritto nei passaggi 2.16-2.17.

4. Monitoraggio postoperatorio

1. Osserva i ratti tre o quattro volte ogni ora, confermando il loro recupero dall'anestesia. Monitora la respirazione e valuta i riflessi dei pedali e degli occhi.
2. Iniettare analgesia per via sottocutanea ogni 12 ore per 48 ore.
   NOTA: Il carprofene è stato somministrato a 1 ml/500 mg di peso corporeo e la buprenorfina è stata somministrata a 0,5 ml/500 mg di peso corporeo (vedere Tabella dei materiali).
3. Somministrare cibo morbido per 48 ore dopo ogni procedura e acqua ad libitum.
4. Monitorare i ratti quotidianamente dopo l'intervento chirurgico e registrare il loro stato di salute e l'aspetto del sito operatorio. I segni valutati includono l'espressione facciale, la vocalizzazione, lo stato di attività, qualsiasi segno di dolore, l'ingestione di cibo e bevande, lo svuotamento e il sanguinamento.

5. Valutazione della perfusione sanguigna

NOTA: Il flusso sanguigno viene misurato immediatamente prima dell'induzione della stenosi, immediatamente prima dell'uretroplastica e immediatamente dopo l'uretroplastica.

1. Eseguire l'imaging di perfusione laser Doppler.
   1. Anestetizzare i ratti usando la soluzione anestetica (passaggio 1.1).
   2. Mettere il ratto in posizione supina su un termoforo a 37 °C con trazione peniena, come descritto al punto 2.9.
   3. Avviare l'imager di perfusione laser Doppler (vedere la tabella dei materiali) per ottenere i dati. Preimpostare l'area di interesse che deve essere letta dal raggio laser.
   4. Applicare la soluzione antisedativa (passaggio 1.2) per invertire l'anestesia.
   5. Utilizzando il software di analisi delle immagini, disegna la regione di interesse (ROI) intorno all'area del pene e registra i valori di flusso nel tempo.

6. Valutazione radiografica

NOTA: La conferma dell'induzione della stenosi e la risoluzione della stenosi dopo l'uretroplastica sono confermate con un uretrogramma retrogrado. Questa valutazione viene eseguita 1 settimana dopo l'induzione della stenosi (prima dell'uretroplastica) e 2 settimane dopo l'uretroplastica.

1. Eseguire un uretrogramma utilizzando un sistema angiografico monopiano (vedere la tabella dei materiali).
   1. Anestetizzare i ratti usando la soluzione anestetica.
   2. Posizionare l'animale sul materasso dell'angiografia in un decubito obliquo destro, con trazione peniena, come descritto al punto 2.9.
   3. Focalizzare il fascio conico sull'area pelvica dell'animale, compreso il pene.
   4. Posizionare un catetere venoso da 22 G avanzato di 2 mm nell'uretra distale.
   5. Iniziare a instillare 1 mL di mezzo di contrasto radiografico allo iodio (rapporto 1:1 di 623 mg/mL di soluzione di iopromide e 0,9% di NaCl) nell'uretra.
   6. Contemporaneamente, eseguire una radiografia semplice per identificare il contrasto radiografico che soddisfa il lume uretrale e valutare il diametro uretrale.
   7. Al termine dell'imaging, invertire l'anestesia con la soluzione antisedativa.

7. Eutanasia

NOTA: L'eutanasia viene eseguita 3 settimane dopo l'uretroplastica (4 settimane dopo l'induzione della stenosi), immediatamente dopo l'ultima valutazione della perfusione.

1. Riempire una siringa da 2,5 mL con 2 mL/kg di pentobarbital sodico (400 mg/mL).
2. Eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione per l'eutanasia dell'animale.

Representative Results

Un totale di 12 ratti Wistar maschi, del peso di 400-500 g e di 12-14 settimane, sono stati utilizzati per l'induzione della stenosi uretrale. Un uretrogramma retrogrado (RUG1) è stato eseguito 1 settimana dopo⁸, confermando il successo della tecnica. Il diametro uretrale è stato misurato in millimetri a livello dell'induzione della stenosi. Successivamente, è stata eseguita un'uretroplastica con innesto di mucosa vestibolare nella faccia ventrale dell'uretra di ratto. Gli stessi ratti sono stati sottoposti a un secondo uretrogramma (RUG2) 14 giorni dopo l'uretroplastica e il diametro uretrale è stato misurato in millimetri a livello del posizionamento dell'innesto. I diametri medi di RUG1 e RUG2 sono stati rispettivamente di 1,04 mm e 1,52 mm, mostrando un miglioramento significativo (p < 0,0001) della permeabilità uretrale (Figura 1), confermando così il successo dell'intervento chirurgico e la buona coerenza tra le misurazioni.

La perfusione locale è stata valutata anche mediante laser Doppler immediatamente prima e dopo l'uretroplastica come metodo non invasivo per monitorare l'ambiente microcircolatorio tissutale. La perfusione tissutale è mostrata in immagini codificate a colori, dove la perfusione bassa o assente è blu scuro e i livelli di perfusione più alti sono rossi. I valori medi di flusso sono ottenuti utilizzando il software di elaborazione delle immagini Moor LDI V5.3 (vedi Tabella dei materiali).

Considerando la variabilità della popolazione di ratti, sono stati utilizzati 35 ratti Wistar maschi. Il flusso sanguigno medio prima e immediatamente dopo l'uretroplastica era rispettivamente di 603,4 e 137,6 unità arbitrarie (U.A.). Come previsto, l'area che mostra una riduzione significativa (p < 0,0001) del flusso sanguigno locale (in blu) corrisponde all'innesto non vascolarizzato (Figura 2).

In tutti gli animali dello studio è stata riscontrata una buona tolleranza alla procedura anestetica; Tuttavia, i risultati ottenuti in laboratorio (dati non mostrati) hanno rivelato che il tempo di anestesia potrebbe essere critico per consentire il recupero totale dell'animale, preferibilmente non superiore a 45 min. Dopo l'intervento, i ratti erano anche liberi da complicazioni importanti.

Figura 1: Analisi dell'uretrografia (RUG ). (A) Immagini rappresentative di un uretrogramma prima (RUG1) e 14 giorni dopo l'uretroplastica (RUG2). (B) La valutazione quantitativa del diametro espresso in millimetri ha dimostrato un miglioramento significativo 14 giorni dopo l'uretroplastica. Abbreviazioni: RUG1 = Uretrografia retrograda prima dell'uretroplastica; RUG2 = Uretrografia retrograda 14 giorni dopo l'uretroplastica. I cambiamenti tra i gruppi sono stati valutati utilizzando un test t accoppiato a due code (n = 12). Barra della scala: 10 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Analisi laser Doppler. (A) Immagini rappresentative del flusso laser Doppler prima e immediatamente dopo l'uretroplastica. (B) La valutazione quantitativa del flusso sanguigno ha dimostrato una significativa diminuzione della perfusione sanguigna dopo l'uretroplastica. I cambiamenti tra i gruppi sono stati valutati con un test di rango con segno a coppie di Wilcoxon a due code (n = 35). Barra della scala: 0,5 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L'uretroplastica con innesti di mucosa vestibolare è una pietra miliare nella ricostruzione uretrale. Tuttavia, dovrebbero essere sviluppate procedure innovative per ottimizzare quelle già descritte e stabilirne di nuove, come i materiali di ingegneria tissutale e gli innesti biologici, per ridurre le complicanze e la morbilità. Sono state pubblicate diverse procedure per stabilire modelli preclinici e definire le tecniche chirurgiche. Souza et ^al.1 hanno condotto uno studio su 12 conigli neozelandesi. È stata eseguita un'incisione cutanea longitudinale ventrale e l'uretra è stata mobilizzata dalla tunica albuginea, seguita dall'escissione di un segmento dorsale dell'uretra, creando un difetto. Contemporaneamente, un innesto di mucosa buccale è stato prelevato dalla guancia e posizionato come onlay dorsale con una sutura assorbibile 7-0. Nel presente studio vengono utilizzati ratti Wistar maschi. A causa delle dimensioni ridotte, sono tecnicamente più impegnativi, anche se più facili da maneggiare. Per imitare la fisiopatologia delle stenosi uretrali e la fisiologia dei bisogni dell'innesto, in questo modello, è stata precedentemente indotta una malattia simile alla stenosi uretrale, al contrario di un difetto uretrale eseguito contemporaneamente all'urtroplastica. Come Souza et al., sono state utilizzate anche suture per chiudere l'uretra con l'innesto¹. Ciononostante, è stata utilizzata la sutura non assorbibile perché permette l'identificazione della circonferenza dell'innesto in studi successivi, come quelli istologici. Martín-Cano et ^al.9 hanno sviluppato un modello utilizzando ratti Wistar. È stata praticata un'incisione circonferenziale sub-coronale, seguita da un degloving penineo, consentendo una buona esposizione uretrale. L'innesto è stato prelevato dal labbro inferiore, l'uretra è stata aperta attraverso un'incisione longitudinale della linea mediana ventrale e l'innesto è stato posizionato in modo onlay ventrale con suture correnti non assorbibili. Durante la procedura, è stato posizionato un catetere uretrale per mantenere il perno uretrale. Questa tecnica qui descritta utilizza lo stesso approccio del degloving penieno, che consente una buona esposizione dell'uretra e il posizionamento di un catetere per mantenere l'uretra pervio durante la procedura. Tuttavia, Martín-Cano et al. non hanno eseguito alcuna precedente lesione uretrale nella procedura, che potrebbe aver influenzato il prelievo naturale dell'innesto, poiché i tessuti erano più sani.

In effetti, la semplice lesione uretrale e la guarigione sono state valutate da altri, come Hofer et ^al.10, che hanno sviluppato un modello di ratto con ratti Wistar costituito da un'incisione circonferenziale sub-coronale, un degloving del pene e un'incisione longitudinale della linea mediana ventrale per ferire l'uretra, seguita dalla chiusura con una sutura corrente. La conclusione è stata che, nelle fasi di infiammazione, proliferazione, maturazione e rimodellamento analoghe alla guarigione cutanea, si verifica la guarigione dell'uretra. Questo non si limita al sito della lesione, ma si applica anche alla stragrande maggioranza del tessuto periuretrale e al corpo spongioso. Tavucku et ^al.11hanno anche descritto un modello di lesione uretrale con ratti Sprague-Dawley, eseguendo un'incisione cutanea ventrale penoscrotale per esporre l'uretra e quindi applicando corrente di elettrocauterizzazione per indurre lesioni uretrali. I loro dati hanno mostrato un aumento del rapporto tra collagene di tipo I e collagene di tipo III, un forte indicatore di fibrosi. Seguendo questa logica, un tessuto danneggiato ha più fibrosi di uno sano e ci si aspetta che i prelievi di innesto non siano uguali in entrambi i tessuti. Supponendo che le uretroplastiche vengano eseguite nei tessuti lesionati, uno dei principali vantaggi di questo modello è che imita meglio il normale processo fisiopatologico. Un altro grande vantaggio è la realizzazione di un uretrogramma retrogrado per confermare l'induzione della stenosi e successivamente per confermare il successo dell'uretroplastica in base al diametro uretrale. Infatti, tutti gli animali hanno avuto un miglioramento del diametro uretrale dopo l'uretroplastica, dimostrando il successo della procedura. Souza et ^al.1hanno anche eseguito l'uretrografia retrograda, ma solo alla fine dello studio. In questo studio e in Tavukcu et ^al.11, sono stati eseguiti entrambi gli uretrogrammi, concludendo l'efficacia della procedura mediante l'analisi dell'uretrogramma. Inoltre, è stata eseguita una valutazione della perfusione, prima e dopo l'uretroplastica, che ha confermato un'area totale non vascolarizzata (blu) corrispondente all'innesto di mucosa vestibolare.

Tuttavia, ci sono diverse limitazioni legate a questa procedura, come le dimensioni dell'uretra dei ratti che comportano una tecnica chirurgica impegnativa, la durata dell'intervento chirurgico e l'assenza di anestesia volatile. Tuttavia, è importante considerare che, sebbene gli animali più grandi facilitino l'esecuzione tecnica, sono disponibili meno strumenti molecolari rispetto ai roditori, il che può essere un limite allo studio dei meccanismi molecolari alla base di terapie innovative. Un'altra limitazione è l'uso di un unico metodo per indurre la stenosi uretrale, che può essere dovuta a molte altre cause, tra cui traumi, infezioni o difetti congeniti, che possono portare a diversi fenotipi fisiopatologici. Tuttavia, l'elettrocauterizzazione è stata utilizzata poiché consente un approccio semplice, facile e riproducibile con risultati coerenti.

Per quanto ne sappiamo, questa è la prima procedura di ratto che: (1) imita un ambiente fisiopatologico locale precedente all'innesto inducendo una stenosi uretrale 1 settimana prima del posizionamento dell'innesto di mucosa buccale; (2) conferma la stenosi uretrale e la sua risoluzione mediante uretrografia retrograda; (3) conferma la posizione dell'innesto mediante laser Doppler; e (4) consente un modello sperimentale per ottimizzare l'uso degli innesti e sviluppare nuove strategie terapeutiche basate, ad esempio, su materiali di ingegneria tissutale, in cui potrebbero essere studiati i meccanismi molecolari, con un impatto sulla scienza traslazionale per soddisfare le esigenze cliniche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole	OrionPharma		ANTISEDAN (atipamezole) is indicated for the reversal of the sedative and analgesic effects.
Buprenorphine	RichterPharma		Buprenorphine is a derivative of the opioid alkaloid thebaine that is a more potent (25-40 times) and longer lasting analgesic than morphine.
Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Stereo Microscope	Carl Zeiss Microscopy, Germany		OPMI 1 FC from ZEISS symbolizes quality, precision and reliability. The manual system is easy to use and delivers high fidelity images with the legendary ZEISS optics.
Carprofen	Zoetis		Carprofen is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) of the propionic acid class.
Catheter 22 G. x 1''	B Braun	Introcan Safety	IV Catheter of fluorinated ethylene propylene (FEP) with firmer construction for arterial access.
Enrofloxacin	Bayer		Enrofloxacin is a fluoroquinolone antibiotic.
Fentanyl	Braun	3644960	Fentanyl is a powerful synthetic opioid analgesic.
Flumazenil	Fresenius Kabi		Benzodiazepine antagonist is used for the complete or partial reversal of the sedative effects caused by benzodiazepines.
High temperature cautery	Fiab	F7244	Disposable cautery, sterile, high temperature (1200 °C), 28 mm fine tip.
Instillagel gel	Farco-pharma		Cellulose-based lubricant with local anaesthetic and disinfecting properties.
Iopromide	Bayer		Non-ionic injectable contrast medium, with iodine.
Laser Doppler imaging system (perfusion imager moorLDI2-HIR and dedicated software)	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK	5710	The angiogenesis models uses Laser Doppler imaging to assess blood perfusion in the hind limbs, one of which is ligated surgically. Dedicated measurement and comparison software allows the definition of regions of interest for blood flow assessment on the ischaemic versus non-ischaemic limb to establish a "reperfusion ratio" which can be assessed as often as needed and over a number of days on the same subject.
Lubrithal Eye Gel	Dechra		Eye gel used in animals for prevention of dry eyes during anaesthesia. Lubricating and moisturising action on cornea and conjunctiva.
Male Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) rats	Charles River Laboratories, Spain		Twelve to fourteen-week-old
Metedomidin	Virbac	037/01/07RFVPT	Medetomidine is a synthetic drug used as surgical anesthetic.
Midazolam	Labesfal		Benzodiazepine medication is used for anesthesia and procedural sedation.
Monoplan Angiography System	Philips Medical Systems	Azurion 7 M20	A stationary diagnostic fluoroscopic x-ray system specifically designed to optimize the capability of users to visually and quantitatively evaluate the anatomy and function of blood vessels of the heart, brain and other organs, as well as the lymphatic system.
Mosquito forceps	Henry Schein	102-4346	Hartman-Mosquito Hemostatic Forcep Curved 3-1/2" Stainless Steel
Needle Holder	Henry Schein	100-2570	Needle holder Mayo-Hegar, stainless steel, 14 cm
Ophtalmic Needle Holder	Asico	AE-6143	Needle holder barranquer most delicate without lock
Pentobarbital Sodium	Ecuphar		Pentobarbital Sodium is the sodium salt of pentobarbital used for euthanasia.
Pointed Forceps	Aesculap	BD335R	Microforceps, 0.30 mm tip
Polysorb 6.0	Medtronic (Covidien)	UL-101	Coated Synthetic Absorbable Suture aimed to reduce the inflammatory reaction in tissues, followed by gradual encapsulation of the suture by fibrous connective tissue.
Providone-Iodine	Mylan		Povidone-iodine 10% is an antiseptic drug, used as a disinfectant before and after surgery.
Scalpel Blade nº11	B Braun	BB511	Carbon steel, sterile
Spring Scissor	Henry Schein	600-4826	Surgical scissors 31 castroviejo
Surgical Forceps	Aesculap	BD33R	Microforceps, 0.20mm tip
Surgical Scissor	Aesculap	MA873R	Micro Iris Scissor, curved shrap tips
SurgiPro 7.0	Medtronic (Coviden)	VP-702-X	Non-Absorbable Monofilament Polypropylene Suture indicated for use in general soft tissue ligation.