Name: Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Descubre cómo el replisoma se comporta tras colisionar con la ARN polimerasa en dirección head-on. Este método analiza el reinicio de la replicación mediado por Mfd tras el bloqueo del tenedor de replicación.

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Estamos especialmente agradecidos a Seth Darst para proporcionar proteínas RNAP y MFD y vectores de expresión. También estamos gracias Sergei Borukhov para proporcionar Greb y Zhang Dan de apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud (MOD) y por Marie-Josee Kravis y Henry Fellowship de la Universidad Rockefeller (RTP).

Este método se utilizó en la investigación publicada en <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content-nw/full/327/5965/590/F3">Pomerantz y O'Donnell, Ciencia 327, 590 a 592 (2010)</a> . 1. Montaje de un complejo RNAP elongación detenido se llevó a cabo de la siguiente manera: 500 nM concentración final de E. RNAP coli σ 70 SE se mezcló con la concentración de 5 nM final de una plantilla de ADN biotinilado 3,6 kb que contenía el promotor T7A1 en 100 l de tampón A (20 mM Tris-Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10% de glicerol) por 10 min a 37 ° C. 100 mM de APU y 40 mM de cada uno de GTP, ATP, CTP y se añadieron durante 10 min a 37 ° C. 2. Inmovilización del complejo RNAP elongación detenido en perlas de estreptavidina se realizó de la siguiente manera: 200 l de bolas recubiertas de estreptavidina magnética (Invitrogen) se añadieron a la reacción anterior por 10 min a temperatura ambiente. 3. Purificación del inmovilizado complejo detuvo elongación RNAP se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se lavaron 5 veces con 0,9 ml de un buffer que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg / ml de heparina, y 20 mg / ml ssDNA (Se retiró el sobrenadante después de cada paso de lavado por separación magnética.) A continuación, el bolas se lavaron dos veces con 0,9 ml de tampón A. 4. Formación de un tenedor de replicación aguas abajo con respecto a la cabeza de RNAP se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se resuspendieron en 100 l de New England Biolabs buffer 4 y 10 unidades de Sap I (New England Biolabs) se añadió durante 10 min a 37 ° C. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A y se resuspendió en 50 l de tampón T4 rápida reacción de ligación (New England Biolabs). 2 l de ligasa rápida T4 (New England Biolabs) se añadió junto con la concentración nM 6 final de la pre-templado de ADN horquilla (RP10, RP22, RP25) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las bolas se lavaron 3 veces con 0,9 ml de tampón A. 5. Asamblea de la replisoma y la iniciación de la síntesis del filamento principal en el tenedor de replicación se llevó a cabo de la siguiente manera: 448 pmol de DnaB (como hexamer) se incubó con las perlas de 150 l de tampón A (20 mM Tris-glicerol Cl (pH 7,5), 8 mM MgCl 2, 0,5 mM EDTA, 5 mM DTT, 10%) durante 30 s en 23 ° C. 4,9 pmol de Pol III * (Pol III HE menos β), 15 pmol de β, 2 mM de ATP, y 60 M cada uno de dGTP y dATP se han añadido a un volumen de 200 l y se incubaron en un 5 minutos a 37 ° C. La replicación se inició en la adición de 10 mg SSB y 24 mM de cada uno de dATP y dTTP, junto con [α-32P] dTTP y [α-32P] dCTP (actividad específica, 3,000-5,000 cpm / pmol) hasta un volumen final de 250 l. Reacciones se terminaron después de 10 minutos después de añadir 12 l de 500 mM EDTA. 6. Purificación y concentración de la radio-etiquetados de ADN se realizó de la siguiente manera: Las perlas (desde arriba) se hierve después de la reacción se terminó con el fin de eliminar el ADN de las cuentas. Cualquier ADN residual que queda unido a las cuentas fue eliminado por el tratamiento de las cuentas con proteinasa K en un volumen de 10 ul por 30 min a 50 ° C. Las cuentas fueron hervidos y luego se retiró el sobrenadante por separación magnética. El sobrenadante combinado que contiene el ADN fue purificado utilizando el kit Qiagen PCR de limpieza. Purificada de radio-etiquetados de ADN fueron analizadas en un gel de agarosa alcalinas. * Replicación en la ausencia de una cabeza de RNAP detuvo complejo de elongación se realizó el anterior, sin embargo, σ 70 fue omitido. Los resultados representativos: Colisión de la replisoma con una cabeza de RNAP usualmente resulta en dos productos de 2,5 kb y 3,6 kb de longitud. El producto de 2,5 kb representa la longitud del ADN a partir de el tenedor a la RNAP se detuvo y los resultados de replisoma estancamiento en colisión con la RNAP. El producto representa 3,6 kb de longitud completa de ADN y los resultados de cualquiera de ocupación incompleta del promotor por RNAP o parcial replisoma la lectura a través de la RNAP de frente. Un buen resultado o precisa demuestra que aproximadamente el 50% de larga duración en el ADN que se produce. Sin embargo, en algunos casos menos de ocupación del promotor por RNAP se produce y un mayor porcentaje de larga duración en el ADN se observa desde una población mayor de replisomes no encuentro un RNAP de frente. Replicación en la ausencia de un resultado RNAP se detuvo en un solo cuerpo entero de ADN (3,6 kb). <img src="/files/ftp_upload/1919/1919fig1.jpg" alt="Figura 1"> Figura. 1 El replisoma se ve impedida por un RNAP de frente. (A) de un montaje experimental. A E. columnai RNAP complejo de elongación detenido fue montado en un ADN biotinilado que contiene el promotor T7A1 como se describió previamente (9). En pocas palabras, un complejo de elongación detenido se formó 20 bps abajo del promotor mediante la incubación de holoenzima RNAP con el ADN biotinilado durante 10 minutos seguido por la adición de Apu, GTP, ATP, CTP y por un período de 10 min. Cuentas de estreptavidina se añadieron durante 10 minutos después, las perlas se lavaron cinco veces cada uno con 0,9 ml de solución tampón que contiene 0,75 M NaCl, 200 mg de heparina / ml, y 100 nm de una sola hebra de ADN para eliminar inestable ADN RNAP complejos y el exceso de PNT . El ADN fue digerido con Sapi, se lavan, y se liga a una horquilla de ADN antes de recocido. Las bolas se lavaron una vez más antes de la asamblea de los replisoma. El promotor se encuentra a 2,5 kb del tenedor y se orienta a la transcripción directa hacia el tenedor. (B) DnaB se añade entonces la replisoma fue ensamblado y replicación se inició ya sea en presencia (carril 2) o ausencia (carril 1) de un de frente RNAP.

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</ol>

Lavar el complejo de elongación detenido vinculado a las perlas con elevado de sal es fundamental a fin de eliminar cualquier inestable o no específicamente obligado moléculas RNAP. RNAP tiene una afinidad muy alta para las estructuras de plantilla-primer tipo de ADN. Por lo tanto, es necesario eliminar este tipo no específico de ADN RNAP complejos con el fin de realizar la replicación de la cartilla de plantilla. La concentración de la radio-etiquetados de ADN utilizando el kit Qiagen de purificación de PCR también es fundamental a fin de obtener una alta relación señal que la radiactividad que se puede observar en el gel.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads M-270</td><td>Invitrogen</td><td>653.05</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569S</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa T4 Rápida</td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificación de PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

reinicie directa de un tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de arn head-on

Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase

Los estudios in vivo sugieren que las horquillas de replicación se detiene debido a los encuentros con la cabeza-en los complejos de transcripción. Sin embargo, el destino de los replisoma y la RNA polimerasa (RNAP), tras una colisión frontal se desconoce. Aquí, nos encontramos con que la E. coli puestos replisoma en colisión con la cabeza-en complejo de transcripción, pero en lugar de colapsarse, el tenedor de replicación sigue siendo muy estable y, finalmente, se reanuda la elongación después de desplazar la RNAP a partir del ADN. También encontramos que el factor de acoplamiento de transcripción de reparación, MFD, promueve reiniciar directo del tenedor después de la colisión, al facilitar el desplazamiento de la RNAP. Estos resultados demuestran la estabilidad intrínseca del aparato de reproducción y un nuevo papel para la vía de reparación transcripción de acoplamiento en la promoción de la replicación pasado un bloque de RNAP.

El destino de la replisoma después de un choque con la cabeza-en la RNA polimerasa (RNAP) es desconocida. Nos encontramos con que los puestos replisoma en colisión con un RNAP de frente, pero se reanuda después de desplazar el alargamiento de la RNAP a partir del ADN. Mfd promueve reinicie la replicación, facilitando el desplazamiento de la RNAP después de la colisión.

Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

Los estudios in vivo sugieren que las horquillas de replicación se detienen debido a encuentros con complejos de transcripción frontales. No obstante, el destino del replisoma y del ARN...

El objetivo general de este procedimiento es observar el destino de la zona de Repli y de la ARN polimerasa o RNAP tras una colisión frontal. Esto se logra primero ensamblando el complejo de transcripción en ADN biotinilado e inmovilizándolo en tabletas y perlas Stripp, lo que dará lugar al complejo de elongación de RNAP detenido. El segundo paso del procedimiento consiste en ligar el ADN horquilla previamente preparado al complejo de elongación de RNAP para formar una horquilla de replicación aguas abajo de la RNAP en colisión frontal.El tercer paso del procedimiento consiste en armar la zona de replicación e iniciar la síntesis de la hebra conductora en la horquilla de replicación. El paso final del procedimiento es aislar el ADN de las perlas magnéticas y purificar el ADN mediante una columna de limpieza para PCR. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran que el roso se detiene tras colisionar con el complejo de transcripción en orientación opuesta, mediante un gel alcalino de agarosa de los productos de ADN purificados marcados con radioisótopos.Hola, soy Richard Pomerance del laboratorio de Mike O'Donnell en la Universidad Rockefeller. Hoy les mostraré el procedimiento para realizar una colisión del ribosoma con una ARN polimerasa en orientación frontal en fase sólida. Utilizo este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo el proceso de replicación se ve afectado por los complejos de transcripción a lo largo del ADN.Así que comencemos. Para iniciar esta mezcla de protocolo, combine la enzima RNAP holo con una plantilla de ADN de 3,6 KB biotinilada que contenga el promotor T siete A uno en 100 microlitros de tampón a, e incube la mezcla durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación de 10 minutos, agregue ribonucleótidos: adenosina trifosfato, citidina fosfato y uridina adenínica, lo que limitará la síntesis de ARN a 20 nucleótidos.Incube la solución durante 10 minutos adicionales a 37 grados Celsius para inmovilizar el complejo de elongación de RN ape detenido sobre perlas. Añada la solución a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Deje que la mezcla incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.Purifique el complejo de elongación de ARN polimerasa inmovilizado y detenido lavando las perlas con 0,9 mililitros de tampón de alto contenido salino. Para eliminar complejos no específicos de ARN-ADN-PAR después de cada lavado, retire el sobrenadante mediante separación magnética. Este lavado debe repetirse cinco veces.Luego, las perlas deben lavarse dos veces más con 0,9 mililitros de tampón A. Después del lavado final, se puede ensamblar la horquilla de replicación aguas abajo para formar una horquilla de replicación aguas abajo del RNAP frontal, suspendiendo la tira magnética con perlas evidentes unidas al complejo de elongación de RNAP detenido en 100 microlitros de tampón cuatro de New England Biolabs. A continuación, añada 10 unidades de fosfatasa alcalina de camarón o SAP uno, e incube la muestra durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lave las perlas tres veces con 0,9 mililitros de tampón A. Luego, re suspenda las perlas en 50 microlitros de tampón de reacción de ligación rápida T cuatro.Añada dos microlitros de ligasa rápida T4 y ADN horquilla previamente preparado, incube la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave las perlas tres veces más con 0,9 mililitros de tampón A, mezcle el hexámero, la helicasa DNAB con las perlas de estreptavidina magnética y las perlas que están unidas al complejo de elongación de RNAP detenido y a la horquilla de replicación descendente. Prepare la solución en 150 microlitros de tampón A e incúbele durante 30 segundos a 23 grados Celsius.Tras la breve incubación de 32 °C durante 23 grados Celsius. En la pinza de la polimerasa tres beta, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcado con DGTP y alfa P 32 marcado con DATP hasta un volumen de 200 µL. Incube la muestra durante cinco minutos a 37 °C.Inicie la replicación añadiendo la proteína de unión al ADN de cadena sencilla, DCTP y DTTP. Añada también DTTP y DCTP marcados con alfa P 32 hasta un volumen final de 250 microlitros. Después de 10 minutos, detenga las reacciones añadiendo 12 microlitros de EDTA 0,5 molar.A continuación, hierva las perlas de strp din para liberar el ADN de las perlas. Elimine cualquier ADN residual tratando las perlas con proteinasa K durante 30 minutos a 50 grados Celsius. Hierva nuevamente las perlas y retire el sobrenadante mediante separación magnética.Purifique el sobrenadante combinado que contiene el ADN utilizando el kit de purificación de PCR Kyogen. Finalmente, analice los productos de ADN marcados con radioisótopos purificados en un gel alcalino aros. La colisión de la zona con una ARN polimerasa (RNAP) frontal generalmente produce dos fragmentos de 2,5 KB y 3,6 KB de longitud. El producto de 2,5 KB representa la longitud del ADN desde la horquilla hasta la RNAP detenida.Esto se debe a la detención de la réplica al colisionar con la ARN polimerasa. El producto de 3,6 KB representa ADN de longitud completa y se genera bien por ocupación incompleta del promotor por la ARN polimerasa o bien por lectura parcial de la réplica a través de la ARN polimerasa en orientación frontal. Un buen resultado demuestra que se produce aproximadamente el 50 % de ADN de longitud completa.Sin embargo, en algunos casos, ocurre una menor ocupación del promotor por la ARN polimerasa y se observa un porcentaje más alto de ADN de longitud completa. Esto se debe a que una mayor población de zonas de replicación no encuentra una ARN polimerasa que se replique de frente; en ausencia de una ARN polimerasa detenida, el resultado es únicamente ADN de longitud completa. Acabamos de mostrarle cómo realizar la replicación y la fase sólida en presencia de un complejo de elongación de ARN polimerasa detenido, unido al ADN. Al realizar este procedimiento, es importante lavar el complejo de transcripción detenido con una solución de alta salinidad para eliminar el exceso de ARN polimerasa, que se une no específicamente al ADN e inhibe la replicación.Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Investigación

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Biología

DT40, un sistema vertebrado modelo genético, proporciona una poderosa herramienta para analizar la función de proteínas. Aquí se describe un método sencillo que permite el análisis cualitativo de los parámetros que influyen en la síntesis de ADN durante la fase S en células DT40 en el nivel de moléculas individuales.

Visualización de la replicación del ADN en el DT40 modelo de sistema de vertebrados que utilizan la técnica de fibra de ADN

Describimos aquí un sistema que utiliza un bloque de proteínas in vivo reversible y específico del sitio para detener y colapsar las horquillas de replicación en Escherichia coli. El establecimiento del bloque de replicación se evalúa mediante microscopía de fluorescencia y se utiliza electroforesis en gel de agarosa en 2 dimensiones neutro-neutro para visualizar los intermedios de replicación.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

Aquí, describimos el procedimiento para analizar la progresión de la replicación a través de repeticiones patógenas propensas a la estructura utilizando electroforesis en gel bidimensional.

Análisis electroforético de la replicación a través de repeticiones de ADN propensas a la estructura dentro del episoma humano basado en SV40

Esta técnica demuestra una forma eficiente de preparación defectuosa replicación retroviral acciones que codifica un oncogén humano, y, posteriormente, utilizado para la inducción de la enfermedad mieloproliferativa en el modelo de ratón.

La producción de replicación defectuosa Retrovirus por transfección transitoria de células 293T

Este protocolo demuestra un sencillo de una sola molécula de la técnica de microscopía de fluorescencia para la visualización de la replicación del ADN por replisomes individuales en tiempo real.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

Se describe un método para observar la replicación en tiempo real de las moléculas individuales de ADN mediada por proteínas del sistema de replicación del bacteriófago.

La observación directa de ADN Enzimas Replicar El uso de un ADN de una sola molécula de estiramiento de ensayo

Visualizar la localización del ARN en Xenopus Los ovocitos

Un método para entregar morfolinos directamente en el pez cebra en otocyst 24hpf se ha desarrollado. Con microinyección de morfolinos en el lumen de la vesícula ótica y la electroporación para llevar a cabo la penetración, hemos sido capaces de evitar el efecto de morfolinos en el cerebro y obtener efectos específicos en el oído interno.

Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

Este método describe un alto rendimiento in vitro síntesis de ARNm con caperuza y sin caperuza a partir de un plásmido linealizado que contiene el Gaussia gen luciferasa (GLuc). El ARN se purifica y una fracción del ARN sin caperuza se caperuza enzimáticamente utilizando el Vaccinia enzima de capping viral. En el paso final, el ARNm se transfecta en células HeLa y los sobrenadantes del cultivo celular se analizan para determinar la actividad de luciferasa.

En la transcripción in vitro y la nivelación de mRNA de luciferasa Gaussia Seguido por transfección de células HeLa

Mediante la combinación de los métodos de montaje de ARN...

ARN<em&gt; In situ</emHibridación&gt; Los embriones en todo el montaje y la histología de células Adaptado para elasmobranquios marinos

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