Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On

El destino de la replisoma después de un choque con la cabeza-en la RNA polimerasa (RNAP) es desconocida. Nos encontramos con que los puestos replisoma en colisión con un RNAP de frente, pero se reanuda después de desplazar el alargamiento de la RNAP a partir del ADN. Mfd promueve reinicie la replicación, facilitando el desplazamiento de la RNAP después de la colisión.

El objetivo general de este procedimiento es observar el destino de la zona Repli y la ARN polimerasa o RNAP después de una colisión frontal. Esto se logra ensamblando primero el complejo de transcripción en ADN biotinilado e inmovilizándolo en la tableta y las perlas de Stripp, lo que dará como resultado el complejo de elongación de RNAP detenido. El segundo paso del procedimiento es ligar el ADN bifurcado de acicalamiento previo a la necesidad al complejo de elongación del ARNP para formar una horquilla de replicación aguas abajo del ARNP frontal.

El tercer paso del procedimiento es ensamblar la zona de repetición e iniciar la síntesis de la hebra principal en la horquilla de replicación. El paso final del procedimiento es aislar el ADN de las perlas magnéticas y purificar el ADN a través de una columna de limpieza de PCR. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que el roso se detiene al chocar con el complejo de transcripción frontal a través de un agrogel alcalino de los productos de ADN marcados con radio purificados.

Hola, soy Richard Pomerance del laboratorio de Mike O'Donnell en la Universidad Rockefeller. Hoy le mostraré su procedimiento cómo realizar una colisión del ribosoma con una cabeza en la ARN polimerasa en fase sólida. Utilizo este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo el proceso de replicación se ve afectado por los complejos de transcripción a lo largo del ADN.

Así que comencemos. Para comenzar esta mezcla de protocolos, la holoenzima RNAP con una plantilla de ADN biotinilada de 3,6 KB que contiene el promotor T seven A one en 100 microlitros de tampón incuba la mezcla durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación de 10 minutos, agregue los ribonucleótidos adenosina, trifosfato, fosfato de citidina y uridina del alelo de Aden, lo que limitará la síntesis de ARN a 20 nucleótidos.

Incubar la solución durante 10 minutos adicionales a 37 grados centígrados para inmovilizar el complejo de elongación de mono RN detenido en perlas. Agregue la solución a las perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina. Deje incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Purifique el complejo de elongación de RNAP detenido inmovilizado lavando las perlas con 0,9 mililitros de tampón con alto contenido de sal. Para eliminar los complejos R-N-A-P-D-N-A inespecíficos después de cada lavado, elimine el sobrenadante por separación magnética. Este lavado debe repetirse cinco veces.

Luego, las perlas deben lavarse dos veces más con 0.9 mililitros de tampón A. Después del lavado final, la horquilla de replicación aguas abajo se puede ensamblar para formar una horquilla de replicación aguas abajo del cabezal-On RNAP Resus, suspender la tira magnética a perlas evidentes unidas al complejo de elongación RNAP detenido en 100 microlitros de tampón cuatro de New England Biolabs. A continuación, agregue 10 unidades de fosfatasa alcalina de camarón o SAP one, e incube la muestra durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Lave las cuentas tres veces con 0,9 mililitros de tampón A. Luego vuelva a suspender las cuentas en 50 microlitros de tampón de reacción de ligadura rápida T four.

Agregue dos microlitros de ligasa T cuatro rápida y ADN bifurcado prenecesario, incube la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente. Por último, lavar las perlas tres veces más con 0,9 mililitros de hexámero de mezcla tampón A, helicasa de ADN con el estreptococo A magnético y perlas que se unen al complejo de elongación de RNAP detenido y a la horquilla de replicación posterior. Preparar la solución en 150 microlitros de tampón A e incubar durante 30 segundos a 23 grados centígrados.

Después de la breve incubación número 32 a 23 grados centígrados. A la polimerasa tres beta clamp, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcada con DGTP y alfa P 32 marcada con DATP a un volumen de 200 microlitros. Incubar la muestra durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Inicie la replicación mediante la adición de la proteína de unión al ADN monocatenario DCTP y DTTP. También agregue alfa P 32, etiquetado DTTP y DCTP hasta un volumen final de 250 microlitros. Después de 10 minutos, finalice las reacciones agregando 12 microlitros de EDTA 0.5 molar.

A continuación, hierva las cuentas de strp din para liberar el ADN de las cuentas. Elimine cualquier ADN residual tratando las perlas con proteinasa K durante 30 minutos a 50 grados centígrados. Vuelva a hervir las cuentas y retire el sobrenadante por separación magnética.

Purifique el sobrenadante combinado que contiene el ADN utilizando el kit de limpieza de PCR de Kyogen. Por último, analizar los productos de ADN de radiomarcaje purificado en un gel alcalino de aros La colisión de la zona con una cabeza en RNAP suele dar lugar a dos productos de 2,5 KB y 3,6 KB de longitud. El producto de 2,5 KB representa la longitud del ADN desde la bifurcación hasta el ARNP detenido.

Esto se debe a que el repli se detiene al colisionar con el RNAP. El producto de 3,6 KB representa el ADN de longitud completa y es el resultado de una ocupación incompleta del promotor por RNAP o de una lectura parcial de la repetición del ARNP frontal. Un buen resultado demuestra que se produce aproximadamente el 50% de ADN de longitud completa.

Sin embargo, en algunos casos, se produce una menor ocupación del promotor por el RNAP y se observa un mayor porcentaje de ADN de longitud completa. Esto se debe a que una mayor población de zonas repli no encuentra una cabeza en la replicación de RNAP en ausencia de un RNAP detenido da como resultado solo ADN de longitud completa, Acabamos de mostrarle cómo realizar la replicación y la fase sólida en presencia de un complejo de elongación de ARN polimerasa detenido unido al ADN. Al realizar este procedimiento, es importante lavar el complejo de transcripción detenido con alto contenido de sal para eliminar el exceso de ARN polimerasa, que se une de manera inespecífica al ADN e inhibe la replicación.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.