Reinicie directa de un Tenedor replicación en punto muerto por una polimerasa de ARN Head-On
29 de abril de 2010
El destino de la replisoma después de un choque con la cabeza-en la RNA polimerasa (RNAP) es desconocida. Nos encontramos con que los puestos replisoma en colisión con un RNAP de frente, pero se reanuda después de desplazar el alargamiento de la RNAP a partir del ADN. Mfd promueve reinicie la replicación, facilitando el desplazamiento de la RNAP después de la colisión.
El objetivo general de este procedimiento es observar el destino de la zona de Repli y de la ARN polimerasa o RNAP tras una colisión frontal. Esto se logra primero ensamblando el complejo de transcripción en ADN biotinilado e inmovilizándolo en tabletas y perlas Stripp, lo que dará lugar al complejo de elongación de RNAP detenido. El segundo paso del procedimiento consiste en ligar el ADN horquilla previamente preparado al complejo de elongación de RNAP para formar una horquilla de replicación aguas abajo de la RNAP en colisión frontal.
El tercer paso del procedimiento consiste en ensamblar la zona de replicación e iniciar la síntesis de la hebra conductora en la horquilla de replicación. El paso final del procedimiento es aislar el ADN de las perlas magnéticas y purificar el ADN mediante una columna de limpieza para PCR. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran que la horquilla se detiene al colisionar con el complejo de transcripción en orientación opuesta, mediante un gel alcalino de agarosa de los productos de ADN radiomarcados purificados.
Hola, soy Richard Pomerance del laboratorio de Mike O'Donnell en la Universidad Rockefeller. Hoy les mostraré el procedimiento para realizar una colisión del ribosoma con una ARN polimerasa en orientación frontal en fase sólida. Utilizo este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar cómo el proceso de replicación se ve afectado por los complejos de transcripción a lo largo del ADN.
Así que comencemos. Para iniciar esta mezcla del protocolo, combine la enzima RNAP holo con una plantilla de ADN de 3,6 KB biotinilada que contenga el promotor T siete A uno en 100 microlitros de tampón a, e incube la mezcla durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación de 10 minutos, agregue ribonucleótidos: adenosina trifosfato, citidina fosfato y uridina adenilo, lo que limitará la síntesis de ARN a 20 nucleótidos.
Incube la solución durante 10 minutos adicionales a 37 grados Celsius para inmovilizar el complejo de elongación de RN ape detenido sobre perlas. Añada la solución a perlas magnéticas recubiertas con estreptavidina. Deje que la mezcla incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Purifique el complejo de elongación de ARN polimerasa inmovilizado y detenido lavando las perlas con 0,9 mililitros de tampón de alta salinidad. Para eliminar complejos no específicos de ARN-ADN-ARN polimerasa tras cada lavado, retire el sobrenadante mediante separación magnética. Este lavado debe repetirse cinco veces.
Luego, las perlas deben lavarse dos veces más con 0,9 mililitros de tampón A. Después del lavado final, se puede ensamblar la horquilla de replicación aguas abajo para formar una horquilla de replicación aguas abajo del RNAP frontal, suspendiendo la tira magnética con perlas evidentes unidas al complejo de elongación de RNAP detenido en 100 microlitros de tampón cuatro de New England Biolabs. A continuación, añada 10 unidades de fosfatasa alcalina de camarón o SAP uno, e incube la muestra durante 10 minutos a 37 grados Celsius. Lave las perlas tres veces con 0,9 mililitros de tampón A. Luego, re suspenda las perlas en 50 microlitros de tampón de reacción de ligación rápida T cuatro.
Añada dos microlitros de ligasa T4 rápida y ADN horquilla previamente preparado, incube la solución durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, lave las perlas tres veces más con 0,9 mililitros de tampón A, mezcle el hexámero, la helicasa DNAB con las perlas de estreptavidina magnéticas que están unidas al complejo de elongación de RNAP detenido y la horquilla de replicación descendente. Prepare la solución en 150 microlitros de tampón A e incúbela durante 30 segundos a 23 grados Celsius.
Tras la breve incubación de 32 segundos a 23 grados Celsius. En la pinza de la polimerasa tres beta, A-T-P-D-G-T-P-D-A-T-P alfa P 32 marcado con DGTP y alfa P 32 marcado con DATP hasta un volumen de 200 microlitros. Incube la muestra durante cinco minutos a 37 grados Celsius.
Inicie la replicación añadiendo la proteína de unión al ADN de cadena sencilla, DCTP y DTTP. Añada también DTTP y DCTP marcados con alfa P 32 hasta un volumen final de 250 microlitros. Después de 10 minutos, detenga las reacciones añadiendo 12 microlitros de EDTA 0,5 molar.
A continuación, hierva las perlas de din para liberar el ADN de las perlas. Elimine cualquier residuo de ADN tratando las perlas con proteinasa K durante 30 minutos a 50 grados Celsius. Hierva nuevamente las perlas y retire el sobrenadante mediante separación magnética.
Purifique el sobrenadante combinado que contiene el ADN utilizando el kit de purificación Kyogen PCR. Finalmente, analice los productos de ADN marcados con radioisótopos en un gel alcalino aros. La colisión de la zona con una ARN polimerasa frontal suele dar como resultado dos productos de 2,5 KB y 3,6 KB de longitud. El producto de 2,5 KB representa la longitud del ADN desde la horquilla hasta la ARN polimerasa detenida.
Esto se debe a la detención de la réplica al colisionar con la ARN polimerasa. El producto de 3,6 KB representa ADN de longitud completa y se genera bien por ocupación incompleta del promotor por la ARN polimerasa o bien por lectura parcial de la réplica a través de la ARN polimerasa en orientación frontal. Un buen resultado demuestra que se produce aproximadamente el 50 % de ADN de longitud completa.
Sin embargo, en algunos casos, ocurre una menor ocupación del promotor por la ARN polimerasa y se observa un porcentaje más alto de ADN de longitud completa. Esto se debe a que una población mayor de zonas de replicación no encuentra una ARN polimerasa en sentido opuesto; en ausencia de una ARN polimerasa detenida, el resultado es únicamente ADN de longitud completa. Acabamos de mostrarle cómo realizar la replicación y la fase sólida en presencia de un complejo de elongación de ARN polimerasa detenido, unido al ADN. Al realizar este procedimiento, es importante lavar el complejo de transcripción detenido con una solución de alta salinidad para eliminar el exceso de ARN polimerasa, que se une no específicamente al ADN e inhibe la replicación.
Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.
Descripción general
Este estudio investiga el comportamiento del replisoma cuando encuentra una ARN polimerasa (RNAP) en dirección opuesta. El replisoma se detiene tras la colisión, pero puede reanudar la elongación después de desplazar la RNAP del ADN, un proceso facilitado por Mfd.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Replicación del ADN
- Transcripción
- Interacciones enzimáticas
Antecedentes
- El replisoma es crucial para la replicación del ADN.
- La ARN polimerasa (RNAP) es esencial para la transcripción.
- Las colisiones entre el replisoma y la RNAP pueden interrumpir la replicación.
- Comprender estas interacciones ayuda a elucidar los procesos celulares.
Objetivo del estudio
- Observar el destino del replisoma tras una colisión con la ARN polimerasa.
- Determinar cómo Mfd influye en el reinicio de la replicación.
- Analizar los efectos de la transcripción sobre la dinámica de la replicación del ADN.
Métodos Utilizados
- Ensamblaje de complejos de transcripción sobre ADN biotinilado.
- Inmovilización de complejos de elongación de la ARN polimerasa en perlas magnéticas.
- Formación de horquillas de replicación aguas abajo de la ARN polimerasa.
- Análisis de los productos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa alcalina.
Resultados principales
- El replisoma se detiene al colisionar con la ARN polimerasa.
- La replicación se reanuda tras el desplazamiento de la ARN polimerasa.
- Se observan dos productos de ADN de 2,5 KB y 3,6 KB.
- Los resultados indican que Mfd promueve la reanudación de la replicación.
Conclusiones
- Las colisiones entre el replisoma y la ARN polimerasa pueden resolverse.
- Mfd desempeña un papel importante en la facilitación del reinicio de la replicación.
- Comprender estos mecanismos es fundamental para obtener conocimientos sobre la replicación y la transcripción del ADN.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender los conflictos entre replicación y transcripción es fundamental para evaluar la estabilidad genómica en modelos preclínicos, ya que las colisiones no resueltas pueden inducir mutagénesis y afectar la validación de objetivos. La estabilidad intrínseca del replisoma y su capacidad para reanudar la síntesis tras el desplazamiento de la ARN polimerasa proporcionan una base mecanicista para reducir los riesgos asociados a hipótesis sobre la fidelidad de la replicación en sistemas relevantes para enfermedades. Este trabajo destaca cómo factores de reparación acoplados a la transcripción, como Mfd, contribuyen a la confianza predictiva en las vías de mantenimiento del ADN, apoyando decisiones tempranas de descubrimiento en las que la integridad genómica influye en la selección de objetivos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre el estrés por replicación y las vías de mantenimiento del genoma.
- Valor operativo: Clarifica el contexto de las vías para dianas implicadas en la reparación del ADN o la regulación de la transcripción.
- Valor predictivo: Apoya la validación funcional de dianas al vincular la actividad de Mfd con la fidelidad del reinicio de la replicación.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Listo para ensayo: Permite la preparación de sistemas de horquilla de replicación para evaluar los efectos de compuestos sobre los conflictos entre transcripción y replicación.
- Resultado cuantitativo: Genera productos de ADN definidos (2,5 kb detenidos, 3,6 kb de longitud completa) para lecturas mensurables en ensayos bioquímicos.
- Reproducibilidad: Pasos estandarizados de inmovilización y ligación que apoyan formatos de ensayo escalables para la validación de compuestos activos.
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Se relaciona con modelos preclínicos en los que los conflictos entre transcripción y replicación contribuyen a la inestabilidad genómica.
- Continuidad traslacional: Conecta conocimientos mecanicistas obtenidos en sistemas bacterianos con contextos eucariotas mediante factores de reparación conservados.
- Avance ajustado al riesgo: Informa decisiones sobre dianas en las que la fidelidad de la replicación modula el índice terapéutico o los mecanismos de resistencia.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método sitúa la evaluación de la estabilidad de la horquilla de replicación entre la fase inicial de prueba de hipótesis y la optimización de compuestos activos, especialmente al evaluar compuestos que modulan las transacciones de ADN o la dinámica de la cromatina.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa cómo las perturbaciones afectan la persistencia del replisoma y el desplazamiento de la ARN polimerasa durante colisiones frontales.
- Selección: Genera lecturas cuantificables del progreso del tenedor para comparar los efectos de inhibidores o activadores sobre la eficiencia de reinicio.
- Análisis: Utiliza la resolución en geles de agarosa alcalina del ADN radiomarcado para medir productos detenidos frente a productos completos como indicador de la capacidad de reinicio.
- Investigación Traducional: Relaciona el reinicio dependiente de Mfd con homólogos humanos (por ejemplo, CSB) en la validación preclínica de dianas de estabilidad genómica.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para investigar la interacción entre replicación y transcripción en múltiples clases de dianas y contextos genéticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Proporciona una desestimación mecanicista al definir cómo las horquillas de replicación resisten y se recuperan de los obstáculos transcricionales.
- Valor operativo: Ofrece un sistema estandarizado, basado en perlas, para el ensamblaje de horquillas y el análisis de colisiones reproducibles.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones más informadas sobre objetivos en los que la sensibilidad al estrés de replicación predice resultados fenotípicos.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de objetivos de mantenimiento del genoma mediante la cuantificación de la resistencia de las horquillas bajo carga transcripcional.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en enzimología, manipulación de ácidos nucleicos y métodos de detección con radiomarcado.
- Depende de la separación mediante perlas magnéticas, la eficiencia de ligación y la infraestructura para electroforesis en gel alcalino.
- Necesita estandarización entre laboratorios para lograr una inmovilización consistente de la ARN polimerasa y un montaje fiable del horquilla de replicación.
- La adaptación a sistemas eucariotas podría requerir la reconstrucción del replisoma y el uso de moldes cromatinizados.
- Limitación práctica: la duración del ensayo y el uso de radioactividad pueden limitar su implementación de alto rendimiento sin automatización.
Preguntas frecuentes sobre biofarmacia
Chapters in this video
0:00
Title
1:16
Introduction
1:39
Preparation of the Halted RNAP Elongation Complex
3:07
Preparation of the Downstream Replicaton Fork
4:06
Assembly of the Replisome and Initiation of Leading Strand Synthesis at the Replication Fork
5:49
Representative Results for the Direct Restart of a Replication Fork Stalled by a Head-On RNA Polymerase
6:49
Conclusion
