iClip - transcriptoma en todo el mapeo de la proteína-ARN interacciones con la Resolución de nucleótidos individuales

El objetivo general del siguiente experimento es obtener un mapa de transcriptoma de los sitios de unión de una proteína de unión al ARN con una resolución de nucleótidos individuales. Esto se logra mediante la irradiación UV de células vivas para entrecruzar covalentemente proteínas y ARN in vivo como segundo paso. La proteína de unión al ARN se inmunopurifica en condiciones estrictas para recuperar los fragmentos de ARN reticulados.

A continuación, la transcripción inversa genera CDNAs que a menudo se truncan en el péptido adjunto, lo que preserva la información sobre la posición del enlace cruzado dentro del ARN. Se obtienen resultados que muestran todos los sitios de unión dentro del transcriptoma en función de la secuenciación de alto rendimiento de la biblioteca de ADNc. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología del ARN, como cómo la interacción de diferentes proteínas ónicas de ARN regula el procesamiento del ARN. La principal ventaja de esta técnica es que aumentamos tanto el rendimiento como la resolución de nuestros mapas de transcriptoma de las interacciones proteína-ARN, para comenzar el procedimiento de reticulación UV de células de cultivo de tejidos.

Retire el medio de una placa de 10 centímetros de células sanadoras. Agregue seis mililitros de PBS helado y coloque los platos sobre hielo. Un plato es suficiente para tres experimentos.

Retire la tapa e irradie las células. Una vez a 254 nanómetros con 150 milijulios por centímetro cuadrado, recoja las células raspándolas de las placas con un elevador de celdas, transfiera dos mililitros de suspensión celular a cada uno de los tres microtubos para granular las células. Gíralos a máxima velocidad durante 10 segundos a cuatro grados centígrados.

A continuación, retire el broche supinado, congele los gránulos de celda en hielo seco y almacene hasta menos 80 grados centígrados hasta su uso. Agregue 100 microlitros de proteína, una perla de dina por experimento a un micro tubo nuevo. Si trabaja con anticuerpos de ratón o cabra, use perlas de proteína G dyna.

Lave las perlas dos veces con tampón de lisis, que se puede encontrar en el protocolo escrito adjunto. Vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lisis con dos a 10 microgramos de anticuerpo. Gire el tubo a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos.

A continuación, lave las perlas tres veces con 900 microlitros de tampón de lisis y déjelas en el último lavado hasta que esté listo para continuar. A la inmunoprecipitación del palacio de células de Thor en hielo. Resus suspendido en un mililitro de tampón de lisis y transfiéralo a un microtubo de 1,5 mililitros.

Prepare una dilución de uno a 500 de ARN. Luego agregue 10 microlitros junto con dos microlitros de ADN turbo a la celda. Lisado. Incubar las muestras durante exactamente tres minutos a 37 grados centígrados, agitando a 1.100 rotaciones por minuto, transferir inmediatamente al hielo.

A continuación, gire las muestras a cuatro grados centígrados y 22.000 veces la gravedad durante 20 minutos para limpiar el lisado, recoja cuidadosamente el nadante de SUP, dejando unos 50 microlitros de lisado con el gránulo para inmunoprecipitar las perlas. Retire el tampón de lavado, luego agregue los lisados celulares preparados. Rotar las muestras durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Deseche el agente SUP y lave las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón con alto contenido de sal, que se puede encontrar en el protocolo escrito adjunto. Por último, lavar las perlas dos veces con 900 microlitros de tampón de lavado. A continuación, proceda a desfosforilar y añadir un enlazador a los tres extremos primos del ARN.

Para etiquetar el ARN, cinco extremos principales trabajan detrás de un escudo de plexiglás. Retire el supinato del último lavado de la reacción de ligadura del enlazador y vuelva a suspender las perlas en ocho microlitros de mezcla PNK caliente. Incubar durante cinco minutos a 37 grados centígrados.

Retire la mezcla caliente de PNK y reutilice. Suspenda las cuentas en 20 microlitros de un búfer de carga de una vez la página nueva. A continuación, incubar la muestra en una termomezcladora a 70 grados centígrados durante 10 minutos.

Coloque inmediatamente la muestra en un imán para precipitar las cuentas vacías. Cargue las muestras en una página de cuatro a 12%new. Gel Biss según las instrucciones del fabricante.

Además, cargue cinco microlitros de un marcador de tamaño de proteína preteñido. Haga funcionar el gel durante 50 minutos a 180 voltios. Transfiera los complejos de ARN proteico del gel a una membrana de nitrocelulosa utilizando el aparato de transferencia húmeda NOVA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Después de la transferencia, enjuague la membrana con tampón PBS. Luego envuélvalo en una envoltura de Saran y expóngalo a una película a menos 80 grados centígrados. Realice exposiciones durante 30 minutos, una hora y toda la noche.

A continuación, aísle la región de la membrana de acuerdo con los complejos de ARN proteico de los ARN bajos. Experimenta usando la autorradiografía como mascarilla. Recupera el ARN de la membrana con la digestión de la proteinasa K y la extracción con fenol cloroformo.

Transcriba inversamente el ARN utilizando uno de los cebadores AYP para purificar el CDNA. Mezcle seis microlitros de muestra de CDNA con seis microlitros de tampón de carga de urea dos veces TBE. Justo antes de cargar las muestras en un gel.

Caliente las muestras a 80 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, cargue las muestras en un gel de urea prefabricado al 6% TBE junto con un marcador de bajo peso molecular. Deje que el gel funcione durante 40 minutos a 180 voltios como lo describe el fabricante, usando el tinte superior y las marcas en el soporte de gel de plástico para guiar la escisión.

Corte tres bandas de 120 a 200 nucleótidos, 85 a 120 nucleótidos y 70 a 85 nucleótidos. Tenga en cuenta que el cebador de labios de arco y la secuencia L tres juntas representan 52 nucleótidos de la secuencia de clip. Agrega 400 microlitros de té y tritura la rodaja de gel en trozos pequeños.

Con un émbolo de jeringa de un mililitro, incube las piezas de gel agitándolas a 1.100 rotaciones por minuto durante dos horas a 37 grados centígrados. Coloque dos prefiltros de vidrio de un centímetro en una columna de spinx CoStar. Transfiera la porción líquida de la muestra a la columna de centrifugado durante un minuto a 13.000 rotaciones por minuto en un tubo de 1,5 mililitros.

Añadir 0,5 microlitros de azul glico-glico-y 40 microlitros de acetato de sodio pH 5,5. A continuación, mezcle la muestra. Agregue un mililitro de etanol 100%.

Mezclar de nuevo y precipitar la muestra durante la noche a menos 20 grados centígrados. Finalmente, circularice las moléculas de CD NA para unir la región adaptadora al extremo de los cinco primos. A continuación, relinealice y amplifique por PCR de acuerdo con el protocolo escrito adjunto antes de la secuenciación de la biblioteca de clips oculares, el éxito del experimento se puede monitorear en dos pasos.

El autorradiografo del complejo de ARN de la proteína después de la transferencia de membrana y la imagen en gel de los productos de PCR en la autorradiografía de las muestras de ARN bajo, la radiactividad difusa debe verse por encima del peso molecular de la proteína para muestras de ARN alto. Esta radiactividad se concentra más cerca del peso molecular de la proteína. Cuando no se utiliza ningún anticuerpo en la inmunoprecipitación, no se debe detectar ninguna señal.

Otros controles importantes para la especificidad de la inmunoprecipitación emiten irradiación UVE o utilizan células que no expresan la proteína de interés. La imagen de gel de los productos de PCR debe mostrar un rango de tamaños que corresponda a la fracción de CD NA. Tenga en cuenta que los cebadores de PCR, P tres Celexa y P cinco Celexa introducen 76 nucleótidos adicionales al tamaño del CD NA. Si no se utiliza ningún anticuerpo durante la inmunoprecipitación, no se debe detectar ningún producto de PCR correspondiente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que cada uno de los 64 pasos es crítico y debe realizarse con una precisión del cien por ciento. Los datos de ICL se pueden integrar computacionalmente con ensayos funcionales de transcripción completa. Esto puede, por ejemplo, obtener información sobre la regulación dependiente de la posición del procesamiento del ARN.

Para el análisis de datos computacionales, nos gustaría referirnos a nuestras publicaciones recientes en colaboración con el Instituto Europeo de Bioinformática Nicholas KA y bla zupan de la Universidad de Liana. Y ahora es el momento de que comiences tus propios experimentos. Que te diviertas.