-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es separar las espermátidas de ratón en cuatro poblaciones distintas, lo que permite el estudio molecular de la espermiogénesis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción en espejo, como cuál es el impacto del modelado cromático en la integridad genómica. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona la separación de los espermatozoides en una población de células puras sin contaminación cruzada.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos variaciones importantes en la intensidad de la tinción de DN durante la remodelación de la cromatina en los parámetros del haplo el día antes de la clasificación celular. Agregue de uno a dos mililitros de FBS inactivado por calor a los tubos cónicos de polipropileno de fondo redondo de cinco mililitros y a los tubos cónicos de polipropileno de 15 y 50 mililitros. A continuación, cubra lentamente los tubos mediante una inversión nocturna a cuatro grados centígrados en un rotador al día siguiente.

Decantar cuidadosamente el FBS con una pipeta P 200 para eliminar cualquier residuo de FBS de los tubos de 15 y 50 mililitros y dejar un pequeño volumen residual de 100 a 200 microlitros de FBS en los tubos de cinco mililitros para recoger las células purificadas el día de la célula. Clasificación, picar las piezas de prueba encapsuladas en 500 microlitros de tampón de clasificación. A continuación, transfiera los fragmentos de tejido a un tubo de 1,5 mililitros utilizando una punta de micropipeta truncada.

Enjuague las células germinales de los túbulos seminíferos con un pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo, seguido de un lavado con una punta intacta. A continuación, utilice un colador de células de 40 micras para eliminar los residuos y los grumos que recogen el filtrado en un tubo cónico de 50 mililitros recubierto de FBS. Lave el filtro una vez con tampón clasificador hasta un volumen total de tres mililitros y transfiera el filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros recubierto de FBS.

Luego agregue 16 microlitros de EDTA por mililitro de suspensión celular a las celdas y use una pipeta de 10 mililitros para fijar lentamente las celdas durante un minuto con tres volúmenes de etanol 100% frío mientras que el vórtice a baja velocidad, la suspensión se volverá lechosa después de la fijación. Incubar las células en hielo durante 15 minutos con inversión ocasional. A continuación, centrifugar la suspensión celular, volver a suspender la paleta en dos mililitros de tampón de clasificación y teñir las células germinales con cuatro microlitros de cyto 16 DNAD inmediatamente antes de clasificar.

Filtre las células a través de un filtro de 50 micras en un tubo de fax recubierto de FBS y lave el filtro abundantemente con uno o dos mililitros de tampón de clasificación. Cargue las células germinales fijas en un clasificador de células equipado con láser de 488 nanómetros. A continuación, muestre el total de eventos con un histograma que represente el número de eventos en el área de Alexa floor 4 88 y controle las células de tinción de ADN positivas.

A continuación, muestre las celdas de esta puerta en un área de dispersión lateral contra un gráfico de área de dispersión frontal y una puerta. Las celdas, como se indica, muestran estas celdas cerradas en un área de dispersión frontal contra un área, parcela y puerta de Alexa piso 4 88. A continuación, las celdas vuelven a mostrar estas puertas en parcelas de área separadas de Alexa piso 4 88 de ancho frente a Alexa piso 4 88.

La espermiogénesis se encuentra en los pasos del uno al nueve y del 10 al 12. Luego, las espermátidas se pueden clasificar para recolectar los pasos 13 a 14 y 15 a 16. Las espermátidas muestran las celdas desde la primera puerta en un área de dispersión frontal contra un gráfico de área y una puerta EXOR 4 88.

Las poblaciones celulares como se indica. A continuación, muestra estas puertas en Alexa individual. Piso 4: 88 ancho contra Alexa, piso 4, 88 área, parcelas y portón.

Los pasos 13 a 14 y 15 a 16 espermatozoides para clasificar. Finalmente, recoja las fracciones purificadas en 100 a 200 microlitros de FBS en tubos individuales de fondo redondo de cinco mililitros recubiertos de FBS en hielo. En estas imágenes se muestra la tinción de las poblaciones golpeadas clasificadas por el flujo.

Los pasos de la espermótida del uno al nueve de la espermátida suelen mostrar núcleos redondos que parecen ovalados en la espermiogénesis. Espermátidas del paso nueve, y que se observan como ganchos alargados en los pasos 10 a 12. Las espermátidas de espermátidas en los pasos 13 a 14 y 15 a 16 exhiben núcleos con una forma similar, pero con una intensidad de tinción de ADN ligeramente diferente, lo que permite identificar estas distintas poblaciones de espermátidas durante su clasificación por citometría de flujo.

Siguiendo el protocolo demostrado, se puede esperar que la pureza de las poblaciones individuales de S experimentadas esté entre el 95 y el 100%Esta técnica se puede completar en seis a ocho horas. Si cada paso se sigue correctamente. Es necesario recordar que siempre se deben mantener las células en hielo durante todo el procedimiento siguiendo este procedimiento para que se puedan obtener distintas poblaciones de espermatozoides, proporcionando una cantidad suficiente de material para el análisis molecular, como la caracterización del dramático proceso de remodelación o para estudiar el impacto genético de esta transición.