Name: -Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Aprenda a clasificar espermatides de ratón mediante citometría de flujo para obtener cuatro poblaciones puras sin contaminación cruzada. Este método computacional facilita el estudio molecular de la espermiogénesis y la remodelación de la cromatina.

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Los autores desean agradecer al Dr. Leonid Volkov y Éric Bouchard por su asesoramiento técnico en relación con la microscopía de epifluorescencia. Apoyo financiero Financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (subvención # MOP-93781) de GB

Cuidado de los animales estaba en conformidad con el cuidado de los animales y el uso comité de la Universidad de Sherbrooke. 1. Preparación del tubo <ol><li> El día antes de la clasificación de células, añadir 1-2 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) a 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo, y a 15 ml y 50 ml tubos cónicos de polipropileno. Paso crítico: Asegúrese de que todos los tubos utilizados en el protocolo es revestido. Nota: recubrimiento FBS evita que las células germinales se pegue a las paredes del tubo. </li><li> Poco a poco la mezcla de O / N por inversión a 4 ° C para revestir usando los tubos de manera uniforme un rotador. </li><li> El día siguiente, eliminar FBS a partir de tubos recubiertos por decantación. <ol><li> * Paso crítico: Asegúrese de que los 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo y los 15 y 50 ml tubos utilizados para la preparación de células (protocolo de los pasos 2.1 a 2.11) están completamente vacíos de FBS para evitar Fanning (es decir, la desviación imprecisa de las corrientes laterales). Utilice una pipeta P200 para eliminar las FBS. <br/&gt; Nota: Residual FBS en los tubos antes de la clasificación puede conducir a una pérdida de las células o la contaminación de otros tubos utilizados durante la clasificación de células, </li><li> Deja un pequeño volumen residual de FBS (alrededor de 100 a 200 l) en el 5 ml de polipropileno ronda tubos de fondo utilizados para la recolección de células purificadas. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de la célula <ol><li> Sacrificar uno ratón macho bajo anestesia usando O 2 / isoflurano (inducción al 5% después se mantuvo a 2%), seguido por asfixia con CO2. </li><li> Impuestos Especiales y desencapsulan ambos testículos y picar con pequeñas tijeras en 500 l de tampón de clasificación en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Células germinales rasantes de túbulos seminíferos de suave pipeteo hacia arriba y abajo en el tubo de 1,5 ml, primero con un tronco de 100-1.000 l punta, y luego con una punta de 100-1.000 l intacta. </li><li> Retirar los escombros y matas por el paso uno de filtración usando un filtro de células de 40 micras y recoger filtrado en los 50 ml prev tubo cónicoiamente recubierto con FBS en el paso 1. </li><li> Lavar el filtro una vez con tampón de clasificación hasta un volumen total de 3 ml y la transferencia de filtrado en el tubo cónico de 15 ml previamente recubierto en el paso 1. </li><li> Añadir 16 l de EDTA 50 mM pH 8 por mililitro de suspensión celular (48 l para 3 ml) para obtener una concentración final de EDTA 0,8 mM. </li><li> Para fijar las células germinales, se añade lentamente 3 volúmenes de etanol al 100% enfriado con hielo utilizando una pipeta de 10 ml con agitación suave (vórtice a baja velocidad), que producirá una suspensión lechosa. Paso crítico: añadiendo lentamente etanol es crucial e importante para preservar la integridad de la preparación celular. Hemos observado que la adición rápida de etanol provoca la lisis celular que resulta en una disminución importante de la clasificación eficiencia. Para obtener una suspensión de células 3 ml, se deben añadir 9 ml de etanol en aproximadamente 1 min. </li><li> Se incuban las células en hielo durante 15 min con mezcla ocasional por inversión. </li><li> Suspensión de células Centrifugar a 800 xg durante 5 min y retirar la claraflotante. </li><li> Resuspender suavemente las células germinales fijos en 2 ml de tampón de clasificación. </li><li> Añadir 4 l de tinte de ADN SYTO16 (solución 1 mM en DMSO) y se incuba durante al menos 30 min (protegido de la luz). Nota: Los mejores resultados de clasificación se obtienen utilizando SYTO16 ya que es un tinte de ADN permeable que se incorpora fácilmente en los núcleos altamente compactadas de espermátidas. </li></ol> Clasificador 3. Cell Set Up Se utiliza 20-parámetro clasificador celular BDFACSAria III Aquí, un 4-láser (rojo 405 nm - violeta, 488 nm - azul, 561 nm - - amarillo-verde, 633 nm): Nota. El software BD FACSDiva 6.1.3 se utiliza para visualizar y analizar los datos. Los ajustes pueden variar en función del tipo de clasificador utilizado. <ol><li> Esterilizar el clasificador FACS mediante la ejecución de 70% de etanol como fluido envolvente durante el procedimiento de fluidos de apagado (menú &quot;citómetro&quot; en el software) antes de la clasificación. Seleccione &quot;citómetro&quot; en la barra de herramientas del software y elija &quot;sh neumáticoutdown &quot;. Siga los pasos mencionados por los procesos. </li><li> Preparar y filtrar 1x PBS con un filtro de 0,22 micras para eliminar cualquier cristal y contaminantes. Llenar el depósito de la vaina a la línea de soldadura superior en el interior del tanque. </li><li> Inicie el software e ingrese. Inicie el clasificador FACS para calentar el láser durante al menos 30 minutos antes de la clasificación. Ejecutar dos procesos de inicio de fluidos para eliminar el etanol a partir de los fluidos. Seleccione &quot;citómetro&quot; en la barra de herramientas del software y elija &quot;arranque neumático&quot;. Siga los pasos mencionados por los procesos. Nota: Esto restaura fluidos con fluido envolvente normal (1x PBS). </li><li> Limpie el bloque de clasificación y las placas de deflexión con agua destilada y secar a fondo. Sonicar una boquilla de 100 micras colocó en un tubo de agua destilada durante 2 min en un baño de sonicación. Limpie la boquilla a fondo. </li><li> Inserte la boquilla de 100 micras en la celda de flujo y gire la palanca de la boquilla de bloqueo de las agujas del reloj a la 12posición h. Ajuste la presión de funda a 20 psi. </li><li> Encienda la corriente y ajustar la amplitud de obtener valores objetivo para la frecuencia (alrededor de 30), la gota 1 (alrededor de 150) y Gap (alrededor de 12) y establecer un patrón breakoff gotita estable (gotas pocos satélite). Apague la atenuación. </li><li> Asegúrese de que la corriente es recta y golpea el centro del aspirador de residuos cambiando el ángulo del bloque tipo. Nota: Una boquilla de 130 micras, con 10 psi también se ensayó y no se encontró ninguna diferencia obvia. </li><li> Establecer retraso láser a 0 para el -77,39 azul, para el rojo, 37,33 para el violeta y -39.85 por los láseres de color amarillo-verde. </li><li> Establecer zonas de escala a 1,14 para el 1.0 azul, para el rojo, 0,75 para el violeta y 0,96 para los láseres de color amarillo-verde. </li><li> El uso de un Ordenar de prueba (en la ventana de &quot;Side Stream&quot; del software), asegúrese de que las corrientes laterales no están Fanning. En la ventana &quot;Side Stream&quot;, ajuste los controles deslizantes de tensión de cada corriente lateral para que lleguen al middle de tubo de recogida de prueba. Si la corriente de centro no es apretado, ajustar el 2º, 3º y 4 º ajustes de caída para limitar la corriente central. </li><li> Inicie el programa de instalación citómetro y Seguimiento (CS &amp; T) aplicación en el (menú &quot;citómetro&quot;) de software. </li><li> Utilice la configuración y el seguimiento de cuentas de citómetro a 1 gota por cada 350 l para automatizar la caracterización y el seguimiento de la actuación citómetro siguiendo las instrucciones del fabricante. </li><li> Salga de la aplicación CS &amp; T. Aplicar configuración de CS &amp; T, asegúrese de que los parámetros de la corriente todavía permiten un patrón breakoff gotita estable, y encienda el botón de Sweet Spot como se describe en las instrucciones del fabricante (en la &quot;ventana Breakoff&quot;). </li><li> Optimizar el valor gota Delay usando perlas fluorescentes (véase la Tabla de Materiales). <ol><li> Instale los tubos de recogida en el soporte. Abra la puerta del bloque de tipo. En la ventana &quot;Side Stream&quot;, active la tensión a continuación, seleccione &quot;Prueba de tipo &quot;y haga clic en el botón aspirador cajón para abrir el cajón y tener acceso a los tubos de recogida. </li><li> Optimizar las corrientes laterales así que van hacia el centro del tubo. Ajustar valores y deslizadores, según sea necesario. </li><li> Cierre la puerta del bloque de clase y asegúrese de ajustar el micrómetro para obtener el punto de perlas más brillantes en el centro. Cajón de residuos Deseleccionar, prueba de tipo y la tensión. Retire los tubos de recogida. </li><li> Optimizar el retraso caída de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> En pocas palabras, agitar vigorosamente el vial de cuentas y diluir 1 gota de los granos en 0,5 ml de PBS. </li><li> Usando las instrucciones del fabricante, establecer el retraso gota usando la plantilla experimento de la gota de retardo disponibles en el software. También puede utilizar la función Auto gota retardo para ajustar el retardo de caída. </li><li> Cargar el tubo de perlas fluorescentes y ajustar la velocidad de flujo hasta que la tasa de umbral es de ~ 3.000 a 4.000 acontecimientos / segundo. Establecer la precisión de clasificación para &quot;Inicial&quot; y últimamente a &quot;Sintonía fina&quot; en la ventana &quot;Ordenar diseño&quot;. Seleccione el filtro óptico y clasificar los granos. Ajuste el retardo gota hasta ~ 100% están ordenadas a la izquierda. Nota: Este paso es crítico para asegurarse de que las células de interés especie en una corriente lateral. Las perlas y el filtro óptico se utilizan para lograr cerca de una desviación de gotas 100%. </li></ol></li></ol></li><li> Coloque un filtro ND (densidad neutra) FSC 1.5 en el extremo izquierdo del bloque detector FSC. Establecer la extensión ventana al 2,00 microsegundo y el escalado FSC Área de 1.00 (en la pestaña de &quot;láser&quot; en la ventana &quot;citómetro&quot;). </li><li> Antes de cargar el tubo de la muestra, coloque una línea de filtro de muestra de 50 micras, con el final de la línea de muestreo para evitar la formación de grumos. Para ello, seleccione &quot;Cambiar Filtro de ejemplo&quot; en el menú &quot;citómetro&quot;. </li><li> Prueba de la composición de la muestra de fluido para lograr una buena separación entre avivar sin corriente lateral y para evitar que las células se peguen a la polypropyletubos ne. <ol><li> Cargue el tubo de la muestra, encender las placas de deflexión y seleccione &quot;prueba tipo&quot; con el cajón cerrado. Mira arroyos secundarios si se produce la separación sin demasiado Fanning. Nota: Fanning es probablemente debido a una alta concentración de proteína en el tampón de muestra. </li></ol></li><li> Cargar el tubo de muestra en el instrumento FACS. Seleccionar una muestra de agitación 300 rpm y una temperatura de muestra de 4 ° C. Seleccione &quot;Adquirir de datos&quot; en la &quot;Adquisición Dashboard&quot;. </li><li> Si es necesario, diluir la muestra para lograr una tasa de eventos apropiado para un máximo de 5.000 eventos / seg (con un caudal máximo de 3,0). Estrictamente respetar estos límites con el fin de mantener la pureza de las células clasificadas. </li><li> Para analizar y clasificar las células, optimizar el valor umbral de FSC para eliminar los escombros sin interferir en la población de interés. En escala logarítmica, ajustar el voltaje del detector de tubo fotomultiplicador (PMT) con el filtro de 530/30 a fin de hacerasegurarse de que la señal de fluorescencia de la población total se ajusta dentro de la escala, y la puerta en la población positiva (Figura 1, puerta 1). </li><li> Producir un Forward Scatter-zona (FSC-A) / dispersión lateral del área (SSC-A) parcela de la población positiva SYTO16 y ajustar el FSC-A a alrededor de 110 V en la escala lineal y la SSC-A a alrededor de 150 V en escala logarítmica para visualizar todos los eventos excluyendo muy grandes células y agregados de células. </li><li> En la ventana &quot;Ordenar Diseño&quot;, establecer el &quot;modo de ordenación de precisión&quot; a &quot;4 vías pureza&quot; (máscara Rendimiento: 0, Pureza Máscara: 32, Máscara Fase: 0). Seleccione &quot;Continuo&quot; en el menú &quot;Eventos objetivo&quot; para la clasificación continua. </li><li> Añadir poblaciones para ordenar en el campo correspondiente a los tubos (en la ventana &quot;Ordenar Layout&quot;). Coloque las poblaciones con frecuencias más altas en el centro y los que tienen frecuencias más bajas en los extremos. Establecer las placas de voltaje a 2500 V. Durante la clasificación, mantener la recolección de la muestra tUBE en el hielo. </li></ol> 4. Cell Sorting <ol><li> Inmediatamente antes de la clasificación, las células de filtro utilizando un filtro de 50 micras en un 5 ml previamente recubierto de polipropileno ronda tubo inferior. </li><li> Lave el filtro extensamente con 1-2 ml de tampón de clasificación. </li><li> Células germinales Ordenar fijos utilizando un 488 nm láser equipado clasificador de células siguiendo el esquema gating se detalla en la Figura 1. Recoger fracciones purificadas en 5 ml de polipropileno tubos de fondo redondo recubiertas previamente en la sección 1 en el hielo. <ol><li> Asegúrese de que de 100-200 l de FBS se mantiene en los tubos de recogida para evitar la adherencia de las células clasificadas a la pared del tubo. </li><li> Asegúrese de que la concentración de SYTO16 está saturando de evitar las fluctuaciones de fluorescencia durante el período de clasificación. SYTO16 está saturando cuando no hay más variación de intensidad de la tinción de células en el parámetro 488 (tinción de ADN) Alexa Fluor en los gráficos de clasificación. Si es necesario, añadir 1 l deSYTO16 al tubo de clasificación para alcanzar la saturación. </li><li> Mostrar los eventos totales en un gráfico que muestra los siguientes parámetros: número de eventos vs Alexa Fluor 488-A. </li><li> Seleccione las celdas de tinción de ADN positivos con la Puerta 1, como se muestra en la Figura 1. <ol><li> Mostrar las células de la puerta 1 en un gráfico utilizando SSC-A vs FSC-A como parámetros <ol><li> Seleccione las celdas con la puerta 2, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar las células de la puerta 2 en un gráfico usando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccionar celdas con Puerta 5 y 6 en la Puerta Puerta 2 gráfico, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar separado Puerta 5 y 6 en la Puerta de gráficos usando Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccione espermiogénesis pasos 1-9 espermátidas en la Puerta 5 gráfico y espermiogénesis pasos 10-12 espermátidas en la puerta 6 gráficos, como se muestra en la Figura 1. </li></ol></li><li> Monitorlas células de la puerta 1 en un gráfico utilizando FSC-A vs Alexa Fluor 488-A como parámetros <ol><li> Seleccionar las células con la puerta 3 y Puerta 4, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Mostrar separado Puerta 3 y la puerta 4 de gráficos con Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A como parámetros. </li><li> Seleccione espermiogénesis pasos 13-14 espermátidas en el gráfico de la Puerta 3 y espermiogénesis pasos 15-16 espermátidas en el gráfico de la puerta 4, como se muestra en la Figura 1. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Células de espermatogénesis siempre han sido difíciles de estudiar debido a la complejidad del epitelio seminífero, así como el éxito limitado de cultivo in vitro. A través de los años, muchos enfoques para purificar se desarrollaron las células germinales a partir de diversas especies. Utilizando técnicas de sedimentación de purificación de la gravedad con Percoll o gradientes de albúmina de suero bovino por lo general proporcionan un buen rendimiento de células germinales intactas, pero carecen de definición ...

Las espermátidas redondas haploides se diferencian en espermatozoides mediante un proceso llamado espermiogénesis. Esto implica muchos pasos diferentes, incluida la adquisición de un flagelo, la remodelación de la cromatina y el citoesqueleto, la condensación del núcleo, así como la pérdida de la mayor parte del citoplasma. Estos eventos celulares únicos deben estar finamente regulados para producir un gameto funcional maduro con un genoma intacto adecuado para la fertilización. La espermiogénesis difícilmente puede estudiarse in vitro, ya que hasta ahora ningún sistema de cultivo celular fiable ha sido capaz de apoyar la progresión a través de las diferentes etapas del proceso. Además, las técnicas in vitro reales conducen a un rendimiento pobre1,2. In vivo, las transiciones adecuadas a través de los diferentes pasos de la espermiogénesis son cruciales para la integridad funcional natural del gameto masculino. La purificación exitosa de las espermátidas de acuerdo con sus pasos de diferenciación nunca se ha logrado con un nivel de enriquecimiento suficiente para permitir la caracterización molecular de la espermiogénesis. Por ejemplo, la purificación de los pasos clave de la diferenciación espermática sería especialmente útil para estudiar el desarrollo del acrosoma, la formación de la pieza media3, la dinámica de la unión celular4, la dinámica del ARN5, el proceso de remodelación de la cromatina6,7 o la estabilidad genómica8. La purificación de las espermátidas se ha visto obstaculizada por su transformación morfológica progresiva, la falta de biomarcadores externos específicos de la etapa conocida y su forma y tamaño peculiares. 
Aunque la mayoría de las células germinales masculinas muestran una relación directa entre la tinción de ADN y la ploidía (contenido de ADN), notamos que tal correlación positiva ya no es aplicable a las espermátidas. Esto se debe a nuestra observación temprana de que las secciones de túbulos seminíferos muestran una intensidad variable de tinción de ADN a lo largo de los diferentes pasos de la espermiogénesis. Aunque la tinción del ADN es consistente con su conjunto haploide de cromosomas de los pasos 1 a 7 de la espermiogénesis (espermátidas redondas), observamos un fuerte aumento en la intensidad de la fluorescencia con DAPI o SYTO 16 alrededor del inicio de la reorganización nuclear y la remodelación de la cromatina (paso 8 de la espermiogénesis) alcanzando un pico al inicio de la condensación nuclear (pasos 11-12 de la espermiogénesis). Después de la condensación del núcleo, la intensidad de la tinción del ADN disminuye hasta la espermiación (paso 16 de la espermiogénesis). Supusimos que esto probablemente estaba asociado con la formación de su peculiar transición de estructura de cromatina donde las histonas son reemplazadas por prostaminas. Por lo tanto, desarrollamos un método de citometría de flujo confiable que permite la separación de espermátidas utilizando la variación de la intensidad del ADN de las espermátidas como parámetro de selección principal.
Se describe un enfoque simple de citometría de flujo para separar espermátidas de ratón con alta pureza (95-100%) en función de su contenido aparente de ADN (tinción SYTO16), tamaño y granulosidad. Las espermátidas se dividen en cuatro poblaciones; Espermiogénesis pasos 1-9, 10-12, 13-14 y 15-16. Las espermátidas purificadas son adecuadas para el análisis genético/genómico, así como para aplicaciones proteómicas como se describe en una reciente publicación de nuestro grupo9.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>ABBOT</td><td>05260-05</td><td>Para la anestesia del ratón antes de la eutanasia</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Wisent</td><td>90150</td><td>Para el recubrimiento de tubos</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA BioShop</td><td></td><td>EDT</td><td>Para la clasificación de la preparación de tampones</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H</td><td>Para la clasificación de la preparación de tampones</td></tr><tr><td>100% Etanol</td><td>Les alcools de commerce</td><td>092-09-11N</td><td>Para la fijación celular</td></tr><tr><td>SYTO 16</td><td>Life Technologies</td><td>S7578</td><td>Tinción de ADN</td></tr> 5 <tr><td>ml polipropileno tubos redondos de fondo BD</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Colección de células clasificadas</td></tr><tr><td>15 ml tubos de fondo cónico de polipropileno</td><td>PROgene</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml tubos de fondo cónico de polipropileno</td><td>PROgene</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Vaporizador anestésico TEC4</td><td>Ohmeda 1160526</td><td></td><td>Para la eutanasia de ratón</td>Tanque</tr> de <tr><td>gas CO2</td><td>Praxair</td><td>C799117902</td><td>Para eutanasia</td></tr><tr><td>de ratón O2 tanque de gas</td><td>Praxair</td><td>O254130501</td><td>Para la eutanasia de ratones</td></tr><tr><td>Cámara de gas</td><td></td><td></td> casera <td>para ratones</td></tr><tr><td>40 & micro; m Filtro de celdas Falcon</td><td>Corning Incorporated</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m filtros de línea de muestra</td><td>BD Biosciences</td><td>649049</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice</td><td>Labnet international, inc.</td><td>S0200</td><td>Para la fijación celular</td></tr><tr><td>centrífuga Dynac</td><td>Clay Adams</td><td>101</td><td></td></tr><tr><td>Celltrics 50 &micro; m filters</td><td>Partec</td><td>04-004-2327</td><td></td></tr><tr><td>488 nm clasificador de células con láser</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria III</td><td></td></tr><tr><td>Accudop Fluorescent Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de clasificación: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS</td><td></td><td></td><td>FBS es inactivado por calor. Hacer solución fresca, 0.22 &mu; m filtrado y mantener a 4°C.</td></tr></tbody></table>

-paso específica clasificación de ratón espermátidas por citometría de flujo

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

La diferenciación de espermátidas de ratón es uno proceso crítico para la producción de un gameto masculino funcional con un genoma intacto para ser transmitido a la siguiente generación. Hasta ahora, los estudios moleculares de esta transición morfológica se han visto obstaculizados por la falta de un método que permite una separación adecuada de estos pasos importantes de la diferenciación espermátide para análisis posteriores. Los anteriores intentos de la selección adecuada de estas células usando citometría de flujo pueden haber sido difícil debido a un aumento en la fluorescencia peculiar ADN en espermátidas sometidos a remodelación de la cromatina. Sobre la base de esta observación, proporcionamos los detalles de un flujo sencillo citometría de esquema, lo que permite la purificación reproducible de cuatro poblaciones de espermátidas de ratón fijados con etanol, cada uno representando un estado diferente en el proceso de remodelación nuclear. Enriquecimiento de Población se confirma el uso de marcadores de pasos específicos y criterios morfológicos. Las espermátidas purificadas se pueden utilizar para genómico y proteomic analiza.

Estrategia de apertura de puerta se usa con citometría de flujo La Figura 1 representa la estrategia gating utilizado en citometría de flujo para clasificar cuatro poblaciones spermatid altamente puros. Brevemente, las células con tinción de ADN positivo (Alexa Fluor 488-A) se seleccionan en primer lugar con la Puerta 1. Espermátidas de espermiogénesis pasos son seleccionados 1-12 (puerta 2) en un gráfico de p...

Describimos una estrategia de clasificación para espermátidas de ratón utilizando citometría de flujo. Las espermátidas se clasifican en cuatro poblaciones de alta pureza, que incluyen espermatidas redondas (pasos 1-9 de espermiogénesis), de elongación temprana (pasos 10-12 de espermiogénesis), de elongación tardía (pasos 13-14 de espermiogénesis) y elongadas (pasos 15-16 de espermiogénesis). La tinción, el tamaño y la granulosidad del ADN se utilizan como parámetros de selección.

-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

El objetivo general de este procedimiento es separar los espermátidos de ratón en cuatro poblaciones distintas, lo que permite el estudio molecular de la espermiogénesis. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción celular, como cuál es el impacto del remodelado cromatínico en la integridad genómica. La principal ventaja de esta técnica es que permite la separación de espermátidos en poblaciones puras de células sin contaminación cruzada.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando observamos variaciones importantes en la intensidad de tinción de ADN durante la remodelación de la cromatina en parámetros haploides. El día anterior a la clasificación celular, agregue uno a dos mililitros de suero bovino fetal inactivado por calor a tubos cónicos de polipropileno de fondo redondo de cinco mililitros, y tubos cónicos de polipropileno de 15 y 50 mililitros. A continuación, recubra lentamente los tubos mediante inversión durante la noche a cuatro grados Celsius sobre un rotador al día siguiente.Vierta cuidadosamente el suero bovino fetal (FBS) utilizando una pipeta P200 para eliminar cualquier residuo de FBS de los tubos de 15 y 50 mililitros, dejando un pequeño volumen residual de 100 a 200 microlitros de FBS en los tubos de cinco mililitros para la recolección de las células purificadas el día del ordenamiento celular. Pique los fragmentos encapsulados en 500 microlitros de tampón de ordenamiento. Luego, transfiera los fragmentos de tejido a un tubo de 1,5 mililitro utilizando una punta de micropipeta recortada.Lave las células germinales de los túbulos seminíferos con pipeteo suave hacia arriba y hacia abajo, seguido de un lavado con la punta intacta. A continuación, utilice un filtro celular de 40 micrones para eliminar los restos y agregados, recolectando el filtrado en un tubo cónico de 50 mililitros recubierto con FBS. Lave el filtro una vez con tampón de clasificación hasta un volumen total de tres mililitros y transfiera el filtrado a un tubo cónico de 15 mililitros recubierto con FBS.Luego, agregue 16 microlitros de EDTA por mililitro de suspensión celular a las células y utilice una pipeta de 10 mililitros para fijar lentamente las células durante un minuto con tres volúmenes de etanol frío al 100 %, mientras se realiza una agitación suave en vórtex; la suspensión se volverá lechosa tras la fijación. Incube las células en hielo durante 15 minutos con inversiones ocasionales. Luego, centrifugue la suspensión celular, re suspenda el pellet en dos mililitros de tampón de clasificación y tiña las células germinales con cuatro microlitros de Cyto 16 DNAD inmediatamente antes de la clasificación.Filtre las células a través de un filtro de 50 micrones hacia un tubo de frotis recubierto con FBS y lave extensamente el filtro con uno a dos mililitros de tampón de clasificación. Cargue las células germinales fijadas en un citómetro de flujo equipado con láser de 488 nanómetros. A continuación, muestre los eventos totales mediante un histograma que represente el número de eventos frente al área de fluorescencia Alexa 488 y seleccione las células con tinción positiva de ADN.Luego, muestre las células de esta compuerta en un gráfico de área de dispersión lateral contra área de dispersión anterior y realice una compuerta. Como se indica, muestre estas células seleccionadas en un gráfico de área de dispersión anterior contra área Alexa Fluor 488, y realice una compuerta. A continuación, muestre estas compuertas en gráficos separados de ancho Alexa Fluor 488 contra área Alexa Fluor 488.Los pasos de la espermiogénesis uno a nueve y diez a doce. Luego, los espermátidos pueden ser enriquecidos mediante clasificación para recolectar los pasos trece a catorce y quince a dieciséis. Los espermátidos muestran las células del primer enriquecimiento en un gráfico de dispersión hacia adelante frente al área EXOR 4 88 y se realiza el enriquecimiento.Las poblaciones celulares según se indica. Luego muestre estas compuertas en cada Alexa. Ancho del piso 4 88 frente a gráficos de área del piso Alexa 4 88 y compuerta.Los pasos del 13 al 14 y del 15 al 16 son para la clasificación de espermatozoides. Finalmente, recopile las fracciones purificadas en 100 a 200 microlitros de suero bovino fetal (FBS) en tubos redondos de cinco mililitros recubiertos individualmente con FBS y colocados sobre hielo. En estas imágenes se muestra la tinción dappy de las poblaciones clasificadas por flujo. Los espermátidos en las etapas uno a nueve de la espermiogénesis normalmente presentan núcleos de forma redondeada que parecen de forma ovalada durante la espermiogénesis. Los espermátidos en la etapa nueve, y que se observan como ganchos alargados en las etapas 10 a 12. Los espermátidos en las etapas 13 a 14 y 15 a 16 exhiben núcleos con una forma similar, pero con una intensidad ligeramente diferente de tinción de ADN, lo que permite identificar estas poblaciones espermáticas distintas durante su clasificación mediante citometría de flujo.Tras seguir el protocolo descrito, se puede esperar que la pureza de las poblaciones experimentales individuales de S esté entre el 95 y el 100 %. Esta técnica puede completarse en seis a ocho horas, siempre que cada paso se siga correctamente. Es importante recordar mantener siempre las células en hielo durante todo el procedimiento; al seguir este procedimiento, se pueden obtener poblaciones distintas de espermatozoides, proporcionando una cantidad suficiente de material para análisis moleculares, como caracterizar el notable proceso de remodelación de la cromatina o estudiar el impacto genético de esta transición.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un método eficaz para obtener fracciones altamente purificadas meiótica viables de ratón testículos se describe, que combina un refinado protocolo de disociación celular, con la clasificación de células activadas fluorescentes (FACS). Este método aprovecha las diferencias en el contenido de ADN nuclear y la densidad de las fracciones discretas meióticas.

Citometría de flujo de purificación de las células de ratón meiótica

Se describe un nuevo protocolo para la preparación mecánica de suspensiones de células testiculares de material de roedor, evitando enzimas y detergentes,. El método es muy simple, rápido, reproducible, y hace que las suspensiones de células de buena calidad, que son adecuados para la clasificación de flujo y la extracción de RNA.

Técnica sencilla y eficaz para la preparación de suspensiones de células testiculares

El método STA-PUT permite la separación de las diferentes poblaciones de células espermatogénica basado en el tamaño y la densidad.

La separación de los tipos de células de espermatogénesis Usando STA-PUT Sedimentación Velocity

La meiosis es el proceso de desarrollo por que los gametos se forman a través de una sola ronda de replicación del ADN y dos series sucesivas de segregación cromosómica. Meiosis mamífera pueden examinarse mediante la utilización de una técnica para preparar extensiones de cromosoma meiótico. Aquí, demostramos un método de preparación de superficie de extensión núcleos de espermatocitos de ratón.

Preparación del cromosoma meiótico se extiende desde ratón espermatocitos

Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.

Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo

El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.

Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón

Aquí se presenta un protocolo para enriquecer los espermacitos de paquiteno, espertáidos redondos y elongafines espermatíides de testículos de ratón adultos utilizando un gradiente discontinuo de densidad de albúmina sérica bovina con equipo de laboratorio estándar.

Enriquecimiento de espermaocitos y espermatídos de los testículos de ratón que utilizan equipos de laboratorio estándar

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Aislamiento de células espermatogénicas murinas usando un tinte de unión de ADN permeable a células violetas-excitado

Este artículo informa una inhibición in vivo de CENP-E a través de cirugía abdominal e inyección testicular de GSK923295, un modelo valioso para la división meiótica masculina. Usando los ensayos de inmunofluorescencia, citometría de flujo y microscopía electrónica de transmisión, mostramos que la inhibición de CENP-E da como resultado una desalineación cromosómica e inestabilidad del genoma en espermatocitos de ratón.

Evaluación funcional de la quinesina-7 CENP-E en espermatocitos mediante inhibición in vivo , inmunofluorescencia y citometría de flujo

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-Paso específica Clasificación de Ratón Espermátidas por Citometría de Flujo

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