Biorreactores de fibra hueca para En Vivo -como Cultivo de tejidos de mamíferos

El objetivo general de este modelo in vitro es observar la función de las células hepáticas in vitro en un entorno físicamente relevante que tiene compartimentos separados como sinusoides, y como canalículos. Este método puede ayudar a cultivar células en un entorno fisiológicamente relevante. Por ejemplo, para producir respuestas celulares más realistas a la dosificación de fármacos in vitro.

La principal ventaja de esta técnica es que puede ser utilizada por cualquier biólogo celular competente y cabe en una incubadora estándar. Los módulos utilizados en este estudio están hechos de vidrio de borosilicato de un milímetro de espesor y tienen dos puertos laterales. Las fibras de este módulo tienen un área de servicio exterior de 4,95 centímetros cuadrados o aproximadamente de un pozo de una placa de seis pocillos.

Comience siliconando los módulos antes del primer uso. Cubra la superficie interior con Sigmacote y deje secar en una campana extractora. A continuación, autoclave el módulo para aumentar la vida útil del tratamiento.

Con un bisturí, corte fibras de 75 milímetros de largo e inserte tres fibras en cada módulo, dejando aproximadamente siete milímetros de exceso de longitud en cada extremo. A continuación, agregue 0,5 mililitros de pegamento de silicona a un bote de pesaje. A continuación, utilice una punta de pipeta P200 para recoger una pequeña cantidad de silicona y trabaje el pegamento en los extremos del módulo alrededor de las fibras para formar un tapón de tres a cinco milímetros.

Deje secar durante un mínimo de tres horas. Una vez seco, utiliza un bisturí para cortar la silicona de forma que quede a ras de los extremos del módulo de cristal. Por último, envuelva unas cuatro capas de cinta de politetrafluoroetileno alrededor de un puerto lateral.

Antes de la configuración, autoclave todos los componentes esterilizables en autoclave. Luego, mientras trabaja en una campana de flujo laminar, agregue 10 mililitros de etanol al 70% a la botella del depósito y ensamble la botella del depósito, la tapa de la serie Q, el tubo de alimentación, la bomba y el tubo de la bomba. Ahora coloque sin apretar una tapa final sobre el puerto lateral con cinta de PTFE.

Deslice los extremos de los conectores del módulo LS16 sobre los extremos del módulo y el puerto lateral libre y conecte una sección de 14 milímetros de tubo LS13 al conector del módulo más cercano al puerto lateral tapado. Conecte el módulo a la tubería de la bomba orientándola al módulo de modo que el puerto lateral tapado esté más cerca de la bomba. Conecte la línea de permeado y la línea de recontenido a los conectores del módulo y al LS14 del conector Y en la botella del depósito.

Para esterilizar, bombee etanol a través del módulo a 800 microlitros por hora durante un mínimo de 30 minutos. Para lavar el etanol del sistema, primero apague la bomba. A continuación, desconecte el tubo de la bomba del tubo adaptador del módulo.

Sostenga el módulo en alto para drenar el etanol de las fibras y la línea de retención. Retire la tapa del puerto lateral del módulo para drenar el etanol del módulo y de la línea de permeado, luego vuelva a colocar la tapa del puerto lateral. Invierta el flujo de la bomba para drenar el tubular de la bomba y la línea de alimentación de etanol.

Una vez que las líneas estén vacías, apague la bomba y vuelva a conectar el tubo de la bomba al adaptador del módulo. A continuación, desenrosque la botella de etanol de la tapa y reemplácela con una botella que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento celular sin suero. Bombee el medio a través del sistema a 800 microlitros por hora hasta que la línea de retención esté llena de medio.

Sujete el retenido para forzar que el medio penetre a través de las fibras para lavar el módulo. A continuación, lavar durante aproximadamente dos horas. Coseche el tipo de celda de elección de acuerdo con los protocolos estándar.

Vuelva a suspender los gránulos de celdas a cuatro veces diez a seis celdas por mililitro en medios de crecimiento suplementados según sea necesario para el tipo de celda deseado. Apague la bomba y drene el módulo y la tubería como antes. A continuación, desconecte el módulo de los conectores y desconecte las tapas de los extremos del módulo estéril dejando libre un puerto lateral.

A continuación, utilice una aguja de calibre 18 y una jeringa de un mililitro para transferir 500 microlitros de la suspensión de celdas al módulo. Tenga cuidado de evitar la formación de burbujas y de no dañar las fibras. Ahora cubra el puerto lateral con una tapa final.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cuatro horas con un giro manual del módulo de 180 grados cada cinco minutos. Después de la incubación, conecte un puerto de inyección esterilizado con tapa a un puerto lateral del módulo. Retire la otra tapa del extremo del puerto lateral y drene lentamente las celdas inyectando aire en el puerto de inyección adjunto con una aguja de calibre 27 y una jeringa de un mililitro.

Reemplace el puerto de inyección con una tapa final. Llene lentamente el módulo con medios usando el puerto lateral libre y una aguja de calibre 18 con una jeringa de un mililitro. A continuación, retire las tapas de los extremos del módulo y fije el módulo a la tubería mediante los conectores del módulo.

Por último, reemplace la botella de medios de lavado por una que contenga 50 mililitros de medios de crecimiento con suplementos. Bombee el medio de crecimiento a través del sistema a 800 mililitros por hora. Para extraer fibras del módulo para su análisis al final de un experimento, primero desconecte y drene el biorreactor de factor hueco.

A continuación, inserte con cuidado una pequeña cuchilla entre el cristal y la silicona sin dañar la hoja. Gire el módulo para cortar la silicona del vidrio. Gire el módulo sobre la cuchilla para cortar el pegamento de silicona del vidrio.

Con la cuchilla, saque el tapón de silicona desde un extremo, luego agárrelo con pinzas y tire suavemente. Asegúrese de que las fibras vengan limpias con el tapón. Las células se cultivaron durante 48 horas antes de que las fibras se extirparan, se fijaran y los núcleos se tiñeran con DAPI.

Cada una de las siguientes imágenes es una composición de 12 imágenes apiladas para aumentar la profundidad de campo de la imagen resultante. Las áreas de mayor y menor densidad celular se encuentran a lo largo de la fibra en este punto de tiempo. Donde los límites de las fibras están presentes, se indican con una línea discontinua roja.

La barra de escala representa 200 micras. Este histograma muestra densidades celulares que superan y después de un período de proliferación de siete días. El número de células 2D se determinó mediante un hemocitómetro.

El número de celdas del biorreactor de fibra hueca se determinó utilizando el ensayo PicoGreen y una curva estándar producida a partir de células C3A. Aquí se muestran los tiempos de duplicación de la población. Aquí se muestra la viabilidad celular determinada por la exclusión del azul de tripano al final de una proliferación de siete días.

La entrada, el centro y la salida representan regiones dentro del biorreactor de fibra hueca. Esta imagen muestra el consumo de glucosa y la producción de ácido láctico. Los niveles se monitorizaron en la botella del depósito, así como en las salidas de retenido y permeado, y se compararon con el cultivo de rutina y el plástico de cultivo de tejidos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar y ejecutar este sistema de cultivo de biorreactor de fibra hueca.