Name: Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprende a determinar el contenido de glucógeno en cianobacterias mediante hidrólisis enzimática selectiva. Este método sencillo y sensible facilita estudios de fisiología, genética molecular e ingeniería metabólica.

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Los autores reconocen a Nordic Energy Research (AquaFEED, proyecto nº 24), Innovationfonden Denmark (Pant Power, proyecto nº 12-131844) y Villum Fonden (proyecto nº 13363)

1. Preparación <ol><li> Cultivos de cianobacterias <ol><li> Cultivar Synechocystis sp. PCC 6803 a 30 ° C en medio BG11 líquido 8 , con un suministro constante de aire suplementado con CO 2 al 1% (v / v). Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 50 μmol fotón / m 2 / s. </li><li> Cultivar Synechococcus sp. PCC 7002 en medio A + líquido 23 (se puede utilizar también medio BG11), con un suministro constante de aire suplementado con CO 2 al 1% (v / v). La temperatura debe ser de 37 ° C. Iluminar los cultivos continuamente con luz a una densidad de flujo de fotones fotosintéticos de 150 μmol fotón / m 2 / s. </li><li> Medir la densidad óptica (DO) del cultivo a 730 nm usando una cubeta con un trayecto de luz de 1 cm. Si el valor de OD es superior a 0,8, haga las diluciones apropiadas para obtener mediciones de DO que sean proporcionales aE concentración de células. NOTA: Los protocolos presentados a continuación son adecuados para cultivos líquidos, con una densidad celular que corresponde a un valor de DO 730nm de 2 o superior. Cuando se desean cultivos en fase de crecimiento exponencial, que normalmente tienen un valor de 730 nm OD por debajo de 1, se concentra la densidad celular mediante centrifugación y resuspensión en un tampón o medio para alcanzar un valor de 730 nm OD de 2 o superior. </li></ol></li><li> Tampones y reactivos <ol><li> Hacer un tampón Tris-HCl 50 mM a pH 8. </li><li> Hacer tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5. </li><li> Hacer una solución madre de 8 U / mL de amiloglucosidasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5. </li><li> Hacer una solución madre de 2 U / mL de α-amilasa en tampón de acetato de sodio 50 mM, pH 5. </li><li> Utilizando agua destilada, soluciones patrón de manglucosa en concentraciones que oscilan entre 0 y 100 μg / mL. </li><li> Prepare el reactivo GOD-POD del kit de ensayo de D-glucosa (formato GODPOD), fSiguiendo las instrucciones del fabricante. </li></ol></li></ol> 2. Determinación del peso seco de la célula (opcional) <ol><li> Transferir 2 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 2,0 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante. </li><li> Resuspender el gránulo en 1 mL de agua y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 5 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 0,5 ml de agua. </li><li> Transfiera la suspensión a una bandeja de aluminio previamente pesada. Transferir la bandeja a un horno de secado a 105 ° C para el secado durante la noche (aproximadamente 18 h). CRÍTICO: Es importante que la bandeja se manipule con fórceps para evitar la transferencia de material de los dedos. Se seca una bandeja de aluminio pre-pesada vacía bajo las mismas condiciones para determinar cualquier pérdida de peso de las bandejas durante el secado. </li><li> Después del secado, retirar la bandeja del horno y permitir que se equilibre a temperatura ambienteOns durante 5 min antes de pesarlo con una precisión de 0.0001 g. NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógeno en una base de peso seco de celda. </li></ol> 3. Lisis de Células Cianobacterianas <ol><li> Transferir 1 ml de un cultivo o una resuspensión celular (ver paso 1.1) a un tubo de 1,5 ml y centrifugar a 6000 xg ya 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante. </li><li> Resuspender el gránulo en 1 mL de Tris-HCl 50 mM, pH 8, y centrifugar a 6.000 xg y 4 ° C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y resuspenda el sedimento celular en 1 mL del tampón Tris-HCl. Repita el proceso. </li><li> Resuspender completamente el sedimento en 500 μl de tampón Tris-HCl 50 mM, pH 8. CRÍTICO: Resuspender bien el sedimento para una lisis celular eficiente. Mantenga la resuspensión en hielo. </li><li> Lyse las células resuspendidas a 4 ° C mediante la realización de 30 ciclos de ultrasonicación, cada ciclo que consiste en 30 s a una frecuencia de 20 kHz con la amplitud máxima,Seguido por 90 s sin. NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechococcus sp. PCC 7002. <ol><li> Alternativamente, transfiera la resuspensión de la célula a un tubo de tapa roscada y añada perlas de óxido de circonio al tubo, siguiendo las instrucciones del fabricante. Colocar el tubo en un homogeneizador de tejidos y lisar las células a 4 ° C mediante la realización de 2 ciclos de batido, cada ciclo que consiste en 5 min en el ajuste de frecuencia de 5. NOTA: Este método puede lisar eficientemente Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002. </li></ol></li><li> Centrifugar el tubo que contiene el lisado durante 10 min a 6.000 xg y 4 ° C. NOTA: El pellet debe consistir principalmente en desechos de celda grande. Si hay un número significativo de células intactas, repita el paso 3.4. Mantenga el sobrenadante sobre hielo. </li><li> Determine la concentración de proteína usando un kit comercial de ensayo de proteína BCA. NOTA: El valor puede usarse para normalizar el contenido de glucógenoSobre una base de contenido proteico. </li></ol> 4. Precipitación de glicógeno <ol><li> Eliminar la clorofila a del lisado celular mezclando 900 μl de etanol al 96% (v / v) y 100 μl del sobrenadante de la etapa 3.5 en un tubo de tapa roscada de 1,5 ml. Después de cerrar la tapa, calentar el tubo a 90 ° C durante 10 min utilizando un bloque de calefacción de laboratorio estándar. </li><li> Incubar el tubo en hielo durante 30 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 20.000 xg y 4 ° C durante 30 min y retirar cuidadosamente el sobrenadante; El gránulo contiene glicógeno. Secar ligeramente el gránulo en el aire para eliminar el exceso de etanol. CRÍTICO: Se debe evitar el secado excesivo del gránulo, de lo contrario resulta difícil solubilizar en el paso 5.1. </li><li> OPCIONAL: Mida la absorbancia del sobrenadante obtenido en el paso 4.3 a 664 nm para determinar el contenido de clorofila a . Utilizar un coeficiente de absorción de 84,6 L / g / cm 24 . NOTA: El valor se puede utilizar para normalizarE el contenido de glucógeno. </li></ol> 5. Hidrólisis enzimática y determinación de glicógeno <ol><li> Solubilizar el sedimento obtenido en el paso 4.3 en 100 μl de acetato sódico 50 mM, pH 5, y añadir 50 μl de 8 U / ml de amiloglucosidasa y 50 μl de α-amilasa 2 U / mL. Mezclar bien estos materiales utilizando un vórtice. NOTA: No se recomienda la mezcla por pipeteado porque el gránulo de glucógeno es viscoso. </li><li> Incubar la mezcla a 60 ° C en un bloque de calentamiento durante 2 h para permitir la digestión de glucógeno en moléculas de glucosa. </li><li> Centrifugar la muestra a 10.000 xg durante 5 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 ml. </li></ol> 6. Determinación del contenido total de glucosa utilizando el reactivo GOD-POD <ol><li> Mida la concentración de glucosa en el sobrenadante obtenido en el paso 5.3 usando el reactivo GOD-POD. Transferir 100 μl del sobrenadante del paso 5.3 a un pocillo en una placa de 96 pocillos. Como control negativo,Use 100 μl de acetato de sodio 50 mM, pH 5. Para generar una curva de calibración, también mida las soluciones patrón de glucosa. </li><li> Añadir 150 μl de reactivo GOD-POD a cada muestra y mezclar rápidamente por pipeteo. </li><li> Incubar la placa estáticamente a 25 ° C durante 30 min. Registre el valor de absorbancia a 510 nm usando un lector de placas. </li><li> Calcular la concentración de glucosa usando una curva de calibración obtenida de los estándares de glucosa. NOTA: La concentración de glucógeno en el lisado celular se expresa como la concentración de glucosa (μg / ml). </li></ol>

<ol><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Entner-Doudoroff+pathway+is+an+overlooked+glycolytic+route+in+cyanobacteria+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Entner-Doudoroff pathway is an overlooked glycolytic route in cyanobacteria and plants.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (19), 5441-5446 (2016).</li>
<li>Yang, C., Hua, Q., Shimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1096717602902260">Metabolic flux analysis in Synechocystis using isotope distribution from C-13-labeled glucose.</a> Metab Eng. 4 (3), 202-216 (2002).</li>
<li>Pelroy, R. A., Levine, G. A., Bassham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+light-dark+CO2+fixation+and+glucose+assimilation+by+Aphanocapsa+6714%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of light-dark CO2 fixation and glucose assimilation by Aphanocapsa 6714.</a> J Bacteriol. 128, 633-643 (1976).</li>
<li>You, L., Berla, B., He, L., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C-MFA+delineates+the+photomixotrophic+metabolism+of+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+under+light-+and+carbon-sufficient+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">13C-MFA delineates the photomixotrophic metabolism of Synechocystis. sp. PCC 6803 under light- and carbon-sufficient conditions.</a> Biotechnol J. 9, 684-692 (2014).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+photosynthetic+mannitol+biosynthesis+from+CO2+in+a+cyanobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering of photosynthetic mannitol biosynthesis from CO2 in a cyanobacterium.</a> Metab Eng. 21, 60-70 (2014).</li>
<li>Möllers, K. B., Cannella, D., Jørgensen, H., Frigaard, N. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanobacterial+biomass+as+carbohydrate+and+nutrient+feedstock+for+bioethanol+production+by+yeast+fermentation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Biofuels%22%5BJournal%5D)">Cyanobacterial biomass as carbohydrate and nutrient feedstock for bioethanol production by yeast fermentation.</a> Biotechnol Biofuels. 7, 64(2014).</li>
<li>Angermayr, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://aem.asm.org/content/82/14/4180.long">Culturing Synechocystis. sp. strain PCC 6803 with N2 and CO 2 in a diel regime reveals multiphase glycogen dynamics with low maintenance costs.</a> Appl Environ Microbiol. 82, 4180-4189 (2016).</li>
<li>de Porcellinis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Non-coding+RNA+Ncr0700%2FPmgR1+is+required+for+photomixotrophic+growth+and+the+regulation+of+glycogen+accumulation+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Non-coding RNA Ncr0700/PmgR1 is required for photomixotrophic growth and the regulation of glycogen accumulation in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Plant Cell Physiol. 57 (10), 2091-2103 (2016).</li>
<li>Sakuragi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Tocopherol+plays+a+role+in+photosynthesis+and+macronutrient+homeostasis+of+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803+that+is+independent+of+its+antioxidant+function%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">alpha-Tocopherol plays a role in photosynthesis and macronutrient homeostasis of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 that is independent of its antioxidant function.</a> Plant Physiol. 141, 508-521 (2006).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+regulation+of+sugar+catabolic+pathways+in+the+cyanobacterium+Synechocystis.+sp.+PCC+6803+by+the+group+2+sigma+factor+sigE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Positive regulation of sugar catabolic pathways in the cyanobacterium Synechocystis. sp. PCC 6803 by the group 2 sigma factor sigE.</a> J Biol Chem. 280, 30653-30659 (2005).</li>
<li>Yamauchi, Y., Kaniya, Y., Kaneko, Y., Hihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+the+cyAbrB+transcriptional+regulator+pair+Sll0822+and+Sll0359+in+Synechocystis+sp.+strain+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of the cyAbrB transcriptional regulator pair Sll0822 and Sll0359 in Synechocystis sp. strain PCC 6803.</a> J Bacteriol. 193, 3702-3709 (2011).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K., Hamilton, J., Rebers, P., Smith, F. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60111a017">Colorimetric method for determination of sugars and related substances.</a> Anal Chem. 28, 350-356 (1956).</li>
<li>Osanai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+group+2+%7Bsigma%7D+factor+SigE+widely+activates+expressions+of+sugar+catabolic+genes+in+Synechocystis+species+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of group 2 {sigma} factor SigE widely activates expressions of sugar catabolic genes in Synechocystis species PCC 6803.</a> J Biol Chem. 286, 30962-30971 (2011).</li>
<li>Miao, X., Wu, Q., Wu, G., Zhao, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+accumulation+in+salt-stressed+cells+of+agp+gene+deletion-mutant+in+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Letters%22%5BJournal%5D)">Sucrose accumulation in salt-stressed cells of agp gene deletion-mutant in cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> FEMS Microbiol Letters. 218, 71-77 (2003).</li>
<li>Hagemann, M., Erdmann, N. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/242624484_Activation_and_pathway_of_glucosylglycerol_synthesis_in_the_cyanobacterium_Synechocystis_sp_PCC_6803">Activation and pathway of glucosylglycerol synthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803.</a> Microbiology. 140, 1427-1431 (1994).</li>
<li>Nobles, D. R., Romanovicz, D. K., Brown, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+in+cyanobacteria.+Origin+of+vascular+plant+cellulose+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose in cyanobacteria. Origin of vascular plant cellulose synthase.</a> Plant Physiol. 127, 529-542 (2001).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+production+of+extracellular+type-I+cellulose+by+the+cyanobacterium+Synechococcus+sp.+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">High-yield production of extracellular type-I cellulose by the cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7002.</a> Cell Discovery. 1, 15004(2015).</li>
<li>Kawano, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulose+accumulation+and+a+cellulose+synthase+gene+are+responsible+for+cell+aggregation+in+the+cyanobacterium+Thermosynechococcus+vulcanus+RKN%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cellulose accumulation and a cellulose synthase gene are responsible for cell aggregation in the cyanobacterium Thermosynechococcus vulcanus RKN.</a> Plant Cell Physiol. 52, 957-966 (2011).</li>
<li>Angermayr, S. A., Gorchs Rovira, A., Hellingwerf, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+cyanobacteria+for+the+synthesis+of+commodity+products%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of cyanobacteria for the synthesis of commodity products.</a> Trends Biotechnol. 33, 352-361 (2015).</li>
<li>Zhang, B., Dhital, S., Gidley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+and+antagonistic+effects+of+%CE%B1-amylase+and+amyloglucosidase+on+starch+digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synergistic and antagonistic effects of α-amylase and amyloglucosidase on starch digestion.</a> Biomacromolecules. 14, 1945-1954 (2013).</li>
<li>Harholt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARABINAN+DEFICIENT+1+is+a+putative+arabinosyltransferase+involved+in+biosynthesis+of+pectic+arabinan+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">ARABINAN DEFICIENT 1 is a putative arabinosyltransferase involved in biosynthesis of pectic arabinan in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 140, 49-58 (2006).</li>
<li>Fernando, C. D., Soysa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+enzymatic+colorimetric+assay+for+determination+of+hydrogen+peroxide+%28H2O2%29+scavenging+activity+of+plant+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Optimized enzymatic colorimetric assay for determination of hydrogen peroxide (H2O2) scavenging activity of plant extracts.</a> MethodsX. 2, 283-291 (2015).</li>
<li>Jacobsen, J. H., Rosgaard, L., Sakuragi, Y., Frigaard, N. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+plasmid+construction+for+generation+of+knock-out+mutants+in+cyanobacteria%3A+studies+of+glycogen+metabolism+in+Synechococcus+sp+PCC+7002%5BTitle%5D)+AND+%22Photosynth+Res%22%5BJournal%5D)">One-step plasmid construction for generation of knock-out mutants in cyanobacteria: studies of glycogen metabolism in Synechococcus sp PCC 7002.</a> Photosynth Res. 107 (2), 215-221 (2011).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687987480361">Chlorophylls and carotenoids: Pigments of photosynthetic biomembranes.</a> Methods Enzymol. 148, 350-382 (1987).</li>
<li>López, C. V. G., del Carmen Cerón García, M., Fernández, F. G. A., Bustos, C. S., Chisti, Y., Sevilla, J. M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+measurements+of+microalgal+and+cyanobacterial+biomass%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technol%22%5BJournal%5D)">Protein measurements of microalgal and cyanobacterial biomass.</a> Bioresource Technol. 101, 7587-7591 (2010).</li>
<li>Hasunuma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+metabolic+profiling+of+cyanobacterial+glycogen+biosynthesis+under+conditions+of+nitrate+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic metabolic profiling of cyanobacterial glycogen biosynthesis under conditions of nitrate depletion.</a> J Exp Bot. 64, 2943-2954 (2013).</li>
<li>Díaz-Troya, S., López-Maury, L., Sánchez-Riego, A. M., Roldán, M., Florencio, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+glycogen+biosynthesis+in+the+cyanobacterium+Synechocystis+sp.+PCC+6803%3A+Analysis+of+the+AGP+and+glycogen+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of glycogen biosynthesis in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803: Analysis of the AGP and glycogen synthases.</a> Molecular Plant. 7, 87-100 (2014).</li>
<li>Parrott, L. M., Slater, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA%2C+RNA+and+protein+composition+of+the+cyanobacterium+Anacystis+nidulans+grown+in+light-+and+carbon+dioxide-limited+chemostats%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The DNA, RNA and protein composition of the cyanobacterium Anacystis nidulans grown in light- and carbon dioxide-limited chemostats.</a> Arch Microbiol. 127, 53-58 (1980).</li>
<li>Hihara, Y., Kamei, A., Kanehisa, M., Kaplan, A., Ikeuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+microarray+analysis+of+cyanobacterial+gene+expression+during+acclimation+to+high+light%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA microarray analysis of cyanobacterial gene expression during acclimation to high light.</a> Plant Cell. 13, 793-806 (2001).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los pasos críticos dentro del protocolo son la precipitación del glucógeno y la resuspensión. Después de la centrifugación después de la precipitación con etanol, el glucógeno forma una pastilla translúcida que se adhiere flojamente a las paredes de los tubos de microcentrífuga. Por lo tanto, cuando se retira el sobrenadante, se debe prestar especial atención para no quitar el gránulo. El gránulo de glucógeno es pegajoso, y la solubilización puede ser difícil si se seca. Obsérvese que la solubilización completa del grán...

Las cianobacterias se acumulan glucógeno como el principal almacén de carbohidratos de carbono de CO 2 fijado a la luz a través de la fotosíntesis. El glucógeno es un glicano que consiste en glucano enlazado con α-1,4 lineal con ramificaciones creadas por enlaces glucosilo unidos por α-1,6. La biosíntesis de glicógeno en cianobacterias comienza con la conversión de glucosa-6-fosfato en ADP-glucosa a través de la acción secuencial de fosfoglucomutasa y ADP-glucosa pirofosforilasa. El resto de glucosa en ADP-glucosa se transfiere al extremo no reductor del esqueleto de α-1,4-glucano de glucógeno por una o más glucógeno sintasas (GlgA). Posteriormente, las enzimas ramificadoras introducen el enlace glucosilo unido a 1,6, que se extiende adicionalmente para generar la partícula de glicógeno. En la oscuridad, el glucógeno se descompone por glucógeno fosforilasa, enzimas desramificantes de glucógeno, α-glucanotransferasa y malto-dextrina fosforilasa en glucosa fosforilada y glucosa libre. Estos int de alimentaciónO las vías catabólicas, incluida la vía oxidativa de pentosa fosfato, la vía de Embden-Meyerhof-Parnas (glicólisis) y la vía de Entner-Doudoroff 1 , 2 , 3 , 4 . El metabolismo del glicógeno en las cianobacterias ha despertado un interés creciente en los últimos años debido a la posibilidad de que las cianobacterias se conviertan en fábricas de células microbianas impulsadas por la luz solar para producir productos químicos y combustibles. El metabolismo del glicógeno podría modificarse para aumentar el rendimiento de los productos, porque el glicógeno es el grupo de carbono flexible más grande de estas bacterias. Un ejemplo es la cianobacteria Synechococcus sp. PCC 7002, que ha sido genéticamente modificado para producir manitol; La interrupción genética de la síntesis de glucógeno aumenta el rendimiento de manitol 3 veces 5 . Otro ejemplo es la producción de bioetanol a partir de wildt cargado con glucógenoYpe Synechococcus sp. PCC 7002 6 . El contenido de glucógeno de células de tipo salvaje puede ser hasta 60% del peso seco de la célula durante la inanición de nitrógeno 6 . Nuestra comprensión del metabolismo del glucógeno y la regulación también se ha expandido en los últimos años. Aunque se sabe que el glucógeno se acumula a la luz y se cataboliza en la oscuridad, la cinética detallada del metabolismo del glucógeno durante el ciclo de diel fue revelada recientemente en Synechocystis sp. PCC 6803 7 . Además, se han identificado varios genes que afectan a la acumulación de glucógeno. Un ejemplo notable es el descubrimiento de que la supuesta histidina quinasa PmgA y el ARN no codificante PmgR1 forman una cascada reguladora y controlan la acumulación de glucógeno. De manera interesante, los mutantes de deleción pmgA y pmgR1 acumulan el doble de glucógeno que la cepa de tipo salvaje de Synechocystis sp. PCC 68038 , 9 . Se sabe también que otros elementos reguladores afectan la acumulación de glucógeno, incluyendo el factor sigma E alternativo y el factor transcripcional CyAbrB2 10 , 11 . Como el interés en la regulación del glucógeno y el metabolismo crecen, un protocolo detallado que describe la determinación del contenido de glucógeno está garantizado. En la literatura se utilizan varios métodos. La hidrólisis ácida seguida por la determinación del contenido de monosacárido mediante cromatografía líquida de intercambio aniónico de alta presión acoplada con un detector amperométrico pulsado o determinación espectrométrica después de tratamientos con ácido y fenol son métodos ampliamente utilizados para aproximar el contenido de glucógeno 9 , 10 , 12 , 13 . Sin embargo, un cromatógrafo líquido de intercambio aniónico de alta presiónC es muy cara y no discrimina la glucosa derivada del glucógeno de la derivada de otros glicoconjugados que contienen glucosa, tales como la sacarosa 14 , el glucosilglicerol 15 y la celulosa 16 , 17 , 18 , que se sabe que se acumulan en algunas especies de cianobacterias. El método ácido-fenol se puede realizar utilizando equipo de laboratorio estándar. Sin embargo, utiliza reactivos altamente tóxicos y no distingue glucosa derivada de diferentes glicoconjugados, ni distingue glucosa de otros monosacáridos que constituyen materiales celulares, como glicolípidos, lipopolisacáridos y matrices extracelulares 12 . En particular, el ensayo ácido-fenol caliente se utiliza a menudo para la determinación del contenido total de hidratos de carbono más que para la determinación específica del contenido de glucosa 12 . Enzymatic hyLa hidrólisis de glicógeno a glucosa por α-amiloglucosidasa seguida por la detección de glucosa a través de un ensayo acoplado a enzima genera una lectura colorimétrica que es altamente sensible y específica a glucosa derivada de glucógeno. La especificidad puede mejorarse adicionalmente con la precipitación preferencial de glucógeno a partir de lisados ​​celulares por etanol 5 , 8 , 19 . Aquí, describimos un protocolo detallado para un ensayo basado en enzimas del contenido de glucógeno en dos de las especies de cianobacterias más estudiadas, Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, en el tipo salvaje y cepas mutantes. Con el fin de garantizar la hidrólisis eficiente, un cóctel de α-amilasa y α-amiloglucosidasa se utiliza [ 8] . La alpha - amilasa que actúa endo hidroliza los enlaces alpha - 1,4 en diversos glucanos en dextrinas, que se hidrolizan adicionalmente tO de glucosa mediante la α-amiloglucosidasa exoactiva 20 . Los efectos sinérgicos de estas enzimas son bien conocidos, y estas enzimas se utilizan rutinariamente para la hidrólisis selectiva del almidón, que es un glucano α-ligado como el glucógeno, sin afectar a otros glicoconjugantes, como la celulosa, en la biomasa vegetal 21 . La glucosa liberada se detecta cuantitativamente después de un ensayo acoplado a enzima que consiste en glucosa oxidasa, que cataliza la reducción de oxígeno en peróxido de hidrógeno y la oxidación de glucosa en lactona y peroxidasa, lo que produce un colorante quinoneimina rosado a partir de peróxido de hidrógeno, Un compuesto fenólico y 4-aminoantipirina 22 .

<table><tbody><tr><td>QSonica Sonicators Q700</td><td>Qsonica, LLC</td><td>NA</td><td>QSonica</td></tr><tr><td>SpectraMax 190 Lector de microplacas&nbsp;</td><td>Molecular Devices</td><td>NA</td><td>Eliza</td></tr><tr>lector de placas<td>Bullet Blender Storm Next</td><td>Advance</td><td>BBY24M-CE</td><td>Batidor de perlas</td></tr><tr><td>Ultrospec 3100 pro Espectrofotómetro UV/Visible</td><td>Amersham Biosciences</td><td>NA</td><td>Espectrofotómetro</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merck</td><td>1-00317</td><td>Adecuación de</td></tr><tr><td>pH Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32319</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Amicoglicosidasa (Rhizopus sp.)</td><td>Megazyme</td><td>E-AMGPU</td><td>Enzima para la despolimerización de glucógeno</td></tr><tr><td>&alfa;-amilasa, termoestable (Bacillus licheniformis)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3176</td><td>Enzima para la despolimerización de glucógeno</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Merch</td><td>8337</td><td>Estándar para el ensayo de glucosa</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein kit de ensayo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>23225</td><td>Para la determinación de concentraciones de proteínas</td></tr><tr><td>Bandejas de secado de aluminio, desechables</td><td>VWR</td><td>611-1362</td><td>Para la determinación del peso seco de las células Kit de</td></tr><tr><td>ensayo D-Glucosa (formato GODPOD)</td><td>Megazyme</td><td>K-GLUC</td><td>Para la determinación de las concentraciones de glucosa</td></tr><tr><td>Panes de óxido de circonio, 0,15 mm</td><td>Siguiente Advance</td><td>ZrOB015</td><td>Perlas para la lisis celular en un Tubos Bullet Blendar Storm</td></tr><tr><td>RINO Next</td><td>Advance</td><td>NA</td><td>Tubos para lisis celular en un Bullet Blendar Storm</td></tr></tbody></table>

determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Las cianobacterias acumulan glucógeno como almacenamiento intracelular de carbono y energía durante la fotosíntesis. Los recientes avances en la investigación han puesto de relieve los complejos mecanismos del metabolismo del glucógeno, incluyendo el ciclo diel de biosíntesis y catabolismo, la regulación redox, y la participación de ARN no codificante. Al mismo tiempo, se están haciendo esfuerzos para redirigir el carbono del glicógeno a productos deseables en cianobacterias modificadas genéticamente para mejorar los rendimientos del producto. Se utilizan varios métodos para determinar los contenidos de glucógeno en las cianobacterias, con precisión variable y complejidades técnicas. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para la determinación fiable del contenido de glucógeno en cianobacterias que se puede realizar en un laboratorio estándar de ciencias de la vida. El protocolo implica la precipitación selectiva de glicógeno a partir del lisado celular y la despolimerización enzimática de glucógeno para generar monómeros de glucosa, que son detectados por un buey de glucosaIdase-peroxidasa (GOD-POD). El método se ha aplicado a Synechocystis sp. PCC 6803 y Synechococcus sp. PCC 7002, dos especies de cianobacterias modelo que se utilizan ampliamente en la ingeniería metabólica. Además, el método mostró con éxito diferencias en los contenidos de glucógeno entre el tipo salvaje y mutantes defectuosos en elementos reguladores o genes biosintéticos de glicógeno.

Se añadieron 10 ml de Synechocystis sp. Se cultivaron PCC 6803 en condiciones fotoautótrofas hasta que el valor de DO 730nm alcanzó aproximadamente 0,8. Las células se recogieron y se resuspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 8. El valor de DO 730nm se ajustó a 2-3. El contenido de glucógeno se analizó siguiendo el protocolo descrito anteriormente. El contenido de glucógeno por la OD 730nm fue de 13 ± 1,8 μg / mL / OD 730nm ( N = 1...

Aquí, presentamos un ensayo fiable y fácil para medir el contenido de glucógeno en células de cianobacterias. El procedimiento implica precipitación, despolimerización seleccionable y la detección de residuos de glucosa. Este método es adecuado para cepas de tipo salvaje y genéticamente modificadas y puede facilitar la ingeniería metabólica de las cianobacterias.

Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

El objetivo general de este procedimiento es determinar el contenido de glucógeno en cianobacterias mediante una hidrólisis selectiva basada en enzimas y un ensayo. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de las cianobacterias, como la fisiología, la genética molecular y la bioingeniería de diferentes cepas de cianobacterias bajo estudio. La principal ventaja de esta técnica es que está adaptada a pequeña escala, es fácil de realizar y altamente sensible y específica para el glucógeno.Aunque este método puede proporcionar información sobre cianobacterias, también puede aplicarse a otros microorganismos que acumulan glucógeno o almidón, como E. coli, levaduras, microalgas y diversos microorganismos heterótrofos y fototróficos. Comience este protocolo con la preparación de cultivos de cianobacterias según se describe en el protocolo escrito. Transfiera un mililitro de cultivo de cianobacterias o suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros.Luego, centrifugue a 6.000 × g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante antes de resuspender el precipitado en un mililitro de Tris-HCl 50 milimolares, pH 8. Centrifugue el precipitado resusp

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este video describe un ensayo espectrofotométrico para la estimación de la actividad de la glucógeno sintasa. El método se basa en la reducción de la absorbancia de NADH con el tiempo e indica la actividad de la glucógeno sintasa.

Ensayo espectrofotométrico para determinar la actividad de la glucógeno sintasa

En este video, describimos un ensayo espectrofotométrico cualitativo para determinar el grado de ramificación en una muestra de glucógeno con una estructura no caracterizada. La comparación de los máximos de absorbancia de la muestra no caracterizada con los de los polisacáridos con estructuras ramificadas conocidas indica la presencia de ramificación en la muestra no caracterizada.

Ensayo de ramificación de glucógeno para medir el grado de ramificación de glucógeno

Se describe aquí un método bioquímico exacta, reproducible y conveniente para la titulación de glucógeno in vitro. Esta técnica utiliza el kit de ensayo de Abcam glucógeno y se basa en la hidrólisis sucesivas de glucógeno en glucosa y la glucosa titulación por fluorescencia.

Titulación bioquímica de glucógeno<em&gt; In vitro</em

Aquí, presentamos un protocolo para determinar cuantitativamente el contenido de ficobiliproteína en la cianobacteria Synechocystis mediante un método espectrofotométrico. El procedimiento de extracción fue aplicado con éxito a otras cepas de cianobacterias y algas; sin embargo, debido a variaciones en los espectros de absorción del pigmento, es necesario probar las ecuaciones espectrofotométricas para cada cepa individual.

Determinación espectrofotométrica de ficobiliproteína contenido en la cianobacteria Synechocystis

Aquí, se describen los protocolos para el aislamiento de polímeros de carbohidratos liberados por cianobacterias y el aislamiento de sus exoproteomes. Ambos procedimientos incorporan pasos clave para obtener polímeros o proteínas con grados de alta pureza que se pueden utilizar para análisis o aplicaciones adicionales. También se pueden adaptar fácilmente según las necesidades específicas del usuario.

Mirando hacia afuera: Aislamiento de polímeros y proteínas de carbohidratos liberados de cianobacteria

Se presentan técnicas para medir la actividad de enzimas clave del metabolismo del glucógeno, utilizando un espectrofotómetro simple que opera en el rango visible.

Métodos espectrofotométricos para el estudio del metabolismo del glucógeno eucariota

Se determinó una concentración óptima de sacarosa para la extracción de glucógeno hepático mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. La adición de un paso de ebullición de 10 minutos para inhibir las enzimas que degradan el glucógeno resultó beneficiosa.

La extracción de moléculas de glucógeno hepático para la determinación de la estructura del glucógeno

El protocolo actual detalla el aislamiento de los ficobilisomas de las cianobacterias por centrifugación a través de un gradiente de densidad de sacarosa discontinuo. Las fracciones de ficobilisomas intactos se confirman mediante el espectro de emisión fluorescente de 77K y el análisis SDS-PAGE. Las fracciones de ficobilisoma resultantes son adecuadas para la tinción negativa de TEM y el análisis de espectrometría de masas.

Aislamiento y caracterización del ficobilisoma intacto en cianobacterias

En el presente protocolo, la técnica de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE) se utiliza para determinar la distribución de la longitud de la cadena (CLD) y la longitud media de la cadena (ACL) del glucógeno.

Determinación de la distribución de la longitud de la cadena de glucano del glucógeno utilizando el método de electroforesis de carbohidratos asistida por fluoróforos (FACE)

La adsorción de péptidos a los materiales de plástico durante las diluciones en serie tradicionales basadas en puntas puede afectar significativamente la determinación de la potencia y confundir la comprensión de las relaciones estructura-actividad utilizadas para las fases de identificación y optimización de pistas del descubrimiento de fármacos. Aquí se describen los métodos para la dilución en serie acústica automatizada sin contacto de muestras de péptidos.

Automatizado de dispensación acústica para la dilución en serie del péptido Los agonistas de la potencia Ensayos de Determinación

Aprende a determinar el contenido de glucógeno en cianobacterias mediante hidrólisis enzimática selectiva. Este método sencillo y sensible facilita estudios de fisiología, genética molecular e ingeniería metabólica.

Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

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