Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

El objetivo general de este procedimiento es determinar el contenido de glucógeno en las cianobacterias mediante una hidrólisis selectiva y un ensayo basados en enzimas. Este método puede ayudar a responder una pregunta clave en el campo de las cianobacterias, como la fisiología, la genética molecular y la bioingeniería de diferentes cepas de cianobacterias que se están investigando. La principal ventaja de esta técnica es que está adaptada a pequeña escala, es fácil de realizar y es muy sensible y específica para el glucógeno.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las cianobacterias, también se puede aplicar a otros microorganismos que acumulan glucógeno o almidón, como E. Coli, levadura, microalgas y varios microorganismos heterótrofos y fototróficos. Comience este protocolo con la preparación de cultivos de cianobacterias como se describe en el protocolo de texto. Transfiera un mililitro de cultivo de cianobacterias o suspensión celular a un tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugar a 6.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante antes de volver a suspender el pellet en un mililitro de Tris-HCL de 50 milimolares pH ocho. Centrifugar el pellet resuspendido como antes.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular por segunda vez en el tampón Tris-HCL. Centrifugar los tubos como antes y desechar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender completamente el pellet en 500 microlitros de tampón Tris-HCL de 50 milimolares pH ocho.

Es crucial tener el pellet bien suspendido para una lisis eficiente. Mantenga la resuspensión en hielo. Lisar las células resuspendidas a cuatro grados centígrados mediante 30 ciclos de ultrasonidos, cada uno de los cuales consta de 30 segundos a una frecuencia de 20 kilohercios con una amplitud máxima, seguidos de 90 segundos sin ella.

Centrifugar el tubo que contiene el lisado a 6.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el pellet debe ser principalmente restos de células grandes, y el sobrenadante se utiliza para un análisis posterior. En este punto, determine la concentración de proteínas utilizando el kit de ensayo de proteínas.

Eliminar la clorofila a del lisado celular mezclando 900 microlitros de etanol y 100 microlitros del sobrenadante obtenido en un tubo de rosca de 1,5 mililitros. Después de cerrar la tapa, caliente el tubo a 90 grados centígrados durante 10 minutos, utilizando un bloque calefactor de laboratorio estándar. Luego, incuba el tubo en hielo durante 30 minutos.

A continuación, centrifuga el tubo a 20.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante. El pellet contiene glucógeno.

Seque ligeramente el pellet al aire para eliminar el exceso de etanol. No seque excesivamente el pellet para evitar dificultades para disolverlo. Mida la absorbancia a 666 nanómetros del sobrenadante obtenido para determinar el contenido de clorofila a.

El valor se puede utilizar para normalizar el contenido de glucógeno. Disolver el pellet en 100 microlitros de acetato de sodio de 50 milimolares pH cinco. Mezcle bien estos materiales, usando un vórtice.

No se recomienda mezclar por pipeteo porque la mezcla es viscosa. Añadir también 50 microlitros de ocho unidades por mililitro de amiloglucosidasa y 50 microlitros de dos unidades por mililitro de alfa-amilasa. A continuación, incube la mezcla a 60 grados centígrados en un bloque calefactor durante dos horas para permitir la digestión del glucógeno en moléculas de glucosa.

Después de la incubación, centrifugar la muestra a 20.000 veces g durante cinco minutos y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Mida la concentración de glucosa en el sobrenadante después de la hidrólisis enzimática, utilizando el reactivo GOD-POD. Transfiera 100 microlitros del sobrenadante de la etapa de precipitación de glucógeno a un pocillo en una placa de 96 pocillos.

Como control negativo, use 100 microlitros de acetato de sodio de 50 milimolares pH cinco. Para generar la curva de calibración, mida también las soluciones estándar de glucosa. Añada 150 microlitros de reactivo GOD-POD a cada muestra y mezcle rápidamente mediante pipeteo.

Incubar la placa a 25 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, registre el valor de absorbancia a 510 nanómetros, utilizando un lector de placas. Calcular la cantidad de glucógeno como equivalente de glucosa, utilizando una curva de calibración obtenida a partir de los patrones de glucosa.

Aquí se muestra el contenido de glucógeno en synechocystis. Las dos cepas mutantes, delta pmg A y delta pmg R, que se sabe que hiperacumulan glucógeno, se compararon con la cepa de tipo salvaje. Como era de esperar, las cepas mutantes mostraron niveles elevados de glucógeno.

Por el contrario, un mutante que carece de glucógeno sintasa no acumuló glucógeno. Las cepas utilizadas aquí han sido diseñadas para producir manitol. En particular, el mutante glucógeno sintasa produjo más manitol que la cepa de control, lo que sugiere que el carbohidrato sintetizado por la fotosíntesis se redirige al manitol en la cepa mutante que carece de la capacidad de sintetizar glucógeno.

Después de ver este vídeo, debería ser capaz de determinar cuantitativamente el contenido de glucógeno en las cianobacterias en cinco horas. Al realizar este procedimiento, es importante recordar resuspender completamente las células y solubilizar los gránulos de glucógeno para obtener resultados confiables. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de actividad enzimática metabólica, utilizando los lisados celulares restantes para responder a preguntas adicionales, como cómo se regula el metabolismo de los carbohidratos en las cianobacterias.