Name: Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprende a aislar y cultivar células del epitelio pigmentario de la retina de ratón manteniendo sus propiedades originales. Este protocolo sencillo permite adquirir habilidades de disección esenciales para investigación ocular.

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Este estudio fue financiado en parte por The BrightFocus Foundation (para DS).

Procedimientos que involucran animales sujetos han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en Universidad de Pittsburgh
1. Preparar soluciones
<ol><li>Preparar medio de cultivo por suplir Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), glucosa alta con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina, 2,5 mM L-glutamina y aminoácidos no esenciales de 1 MEM x. Precaliente los medios en la incubadora de 37 ° C antes de usar.</li>
	<li>Preparar solución de trabajo de 2% (peso/vol) dispase II:<ol>
<li>Preparar una solución stock de dispase II de 100 mg/mL disolver 30 mg de dispase II en 300 μL tampón HEPES solución salina (50 mM HEPES KOH de pH 7.4, 150 mM NaCl). Este volumen es de 3 a 4 ratones, puede ser escalado para arriba o abajo basado en el número de ratones para el experimento). Esta acción puede guardarse durante al menos 1 semana a 4 ° C.</li>
		<li>Preparar la solución de trabajo de 2% dispase agregando 300 μL de 100 mg/mL valores II dispase a 1,2 mL de DMEM estéril, glucosa alta y la solución de filtración con filtro 0,22 μm. Este paso debe realizarse en el gabinete bajo condiciones estériles de flujo laminar. Caliente previamente el preparado dispase II en incubadora de 37 ° C antes de usar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. obtención de los ojos de ratón
<ol><li>Eutanasia el ratón utilizando cualquier método aprobado y colóquela sobre una almohadilla absorbente.</li>
	<li>Guantes, coloque el pulgar y el dedo índice alrededor del ojo y presione suavemente la piel para proptose del globo ocular.</li>
	<li>Inserte la punta de la tijera angulada entre la piel y el globo ocular y corte cuidadosamente el ojo. Para evitar la contaminación, sumergir brevemente el ojo en etanol al 70%.</li>
	<li>Inmediatamente colocar el ojo en el tampón fosfato salino (PBS) en una placa Petri.</li>
	<li>Repita los pasos 2.2-2.4 para quitar el segundo ojo.</li>
</ol>3. disección de ojo
<ol><li>Retire con cuidado el tejido conectivo del ojo con el microscopio de disección. Esto puede hacerse en PBS o en la caja de Petri seca.<ol>
<li>Utilice pinzas de sutura para levantar los tejidos conectivos del globo ocular y recorto con unas tijeras de Vannas. No corte la esclera debido a que es prácticamente imposible obtener las ojeras posteriores intactas si se corta la esclera.</li>
		<li>Después de limpiar el tejido conectivo, mantener los globos oculares resultantes en PBS para el siguiente paso de lavado. Nota: Los siguientes pasos deben realizarse en el gabinete bajo condiciones estériles de flujo laminar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar los ojos dos veces en precalentado a 37 ° C DMEM (glucosa alta). Cuidadosamente transfiera los globos oculares en el C ° 37 con DMEM (glucosa alta) con unas pinzas. Aspire los ojos medio y la transferencia a medio fresco en un plato nuevo.</li>
	<li>Aspirar el medio DMEM (glucosa alta) e incubar los ojos en la solución de trabajo de II dispase 2% (peso/vol) precalentado por 45 min en la incubadora de 37 ° C. Nota: En todos los pasos siguientes, colocar y manipular ojos u ojeras en el medio de crecimiento, que protegen el tejido y proporcionan un buen medio para la disección.</li>
	<li>Retirar la solución II dispase y lavar los ojos dos veces en un medio de aspirar el medio antiguo y agregando el nuevo medio de crecimiento con 37 ° C (Figura 1a). Nota: Después de disociación por dispase II, los globos oculares se convierten en suaves.</li>
	<li>Sujete el ojo con pinzas y haga una incisión alrededor de la ora serrata, de cada ojo con unas tijeras de Vannas bajo el microscopio de disección coloca en el flujo laminar gabinete.<ol>
<li>Mantener el globo ocular en la solución, retire con cuidado la córnea anterior ampliando el corte alrededor de la circunferencia de la serrata de ora y tirando la córnea anterior después de que la corte ha sido completado.</li>
		<li>Retire la cápsula de lente y el epitelio asociado iris pigmentado tirando suavemente de la ojera con pinza dentada (Figura 1b, 1C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar las ojeras posteriores resultantes en el medio de crecimiento por 20 min a 37 ° C para facilitar la separación de la retina neural del RPE.</li>
	<li>El cilindro posterior a cortar 4 pétalos con el microscopio de disección colocada en el flujo laminar gabinete. Los cortes deben ser lo suficientemente largo para aplanar la ojera, pero suficientemente corto como para mantener los pétalos conectados (figura 1 d).<ol>
<li>Aplane el cilindro y extraiga la retina neural tirando muy suavemente con unas pinzas mientras mantiene el resto de complejo de RPE-coroides esclerótica con otro fórceps (Figura 1e). Empezar a tirar de los bordes en lugar del centro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferencia de todos los tejidos en cuartos en una nueva placa de cultivo estéril con medio de cultivo con 37 ° C.</li>
</ol>4. aislamiento de las células RPE primarias
<ol><li>Sosteniendo un pétalo del complejo EPR-coroides esclerótica en cuartos con pinzas de la multa estupenda, retire suavemente las hojas intactas de RPE de la membrana basal subyacente (membrana de Bruch) utilizando un cuchillo media luna microquirúrgica con el microscopio de disección colocado en el flujo laminar del gabinete (figura 1f).<ol>
<li>Transferencia de las hojas RPE en el nuevo plato de cultivo estériles conteniendo medio de cultivo utilizando una micropipeta P200. Remisión de hojas RPE, mojar las puntas de pipetas con medio de cultivo mediante pipeteo varias veces para evitar que el tejido se pegue dentro de la punta. RPE es claramente distinguible de la coroides: RPE parece más pardusco, mientras que la coroides es más oscuro y parece pegajosa y esponjosa.</li>
		<li>También utilizar la digestión enzimática y disociación suave sin fórceps para separar el RPE de la coroides14.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar las hojas RPE 2 - 3 veces usando precalentado 37 ° C medio de cultivo en la placa de cultivo estéril. Después de cada paso de lavado, recoger cuidadosamente las hojas RPE evitando otros tejidos tales como desechos de retina o coroides. Al final del último lavado recoger las hojas RPE con una micropipeta de P200 y colocarlos en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Nota: No es necesario centrifugar las hojas RPE: van sedimentos por gravedad dentro de 1 minuto.</li>
	<li>Retire el medio de crecimiento extra usando una micropipeta P200. Resuspender las células en medio fresco precalentado y triturate suavemente utilizando una micropipeta P200. Evitar formación de burbujas. Una suspensión unicelular es ideal, pero también evitar demasiado trituración, de lo contrario las células RPE no son capaces de sobrevivir. Recomendamos muy suavemente trituración para 40 - 50 veces.</li>
</ol>5. cultivo de células RPE
<ol><li>Las células en una placa de cultivo de la placa.<ol>
<li>Si aplicaciones posteriores de las células RPE requieren retención de su polaridad, placa RPE células de 2 ratones en una inserción de membrana poliéster 12 mm cargado en placas 12-bien. Las celdas de alta densidad de la galjanoplastia es deseada porque en ese caso las células RPE son capaces de mantener las propiedades originales, como el hexagonal de la forma y la pigmentación.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No mover la placa o cambiar el medio de crecimiento de las primeras 72 h de cultivo. Después de 3 días, reemplazar el viejo medio con medio fresco crecimiento precalentado. Después de cambia el medio de cultivo cada dos días. Una vez las células RPE confluency, reducir la FBS en medio del crecimiento a 2%. Nota: Las células se pueden dividir con tripsina 0.25%. Sin embargo, después de dividir las células pueden perder su forma hexagonal y pigmentación en los pasos posteriores. No se recomienda dividir las células, pero si es necesaria para las aplicaciones posteriores de la cultura, tenga en cuenta que las células primarias no pueden ser pasadas por tiempo indefinido: se sabe que se distinguen después de 5 a 7 pasos.</li>
</ol>

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</ol>

DS ha recibido financiación de Alemania y F. Hoffmann-La Roche, Bayer HealthCare, Suiza de la investigación. Los restantes autores no declaran a intereses financieros que compiten. Este trabajo es apoyado por la investigación para evitar la ceguera (becas sin restricciones el Wilmer Eye Institute y la Universidad de Pittsburgh).  Este trabajo es apoyado también por los fondos de arranque para DS de Oftalmología, Universidad de Pittsburgh.

El protocolo detallado presentado permite confiable establecimiento de cultivos primarios RPE ratón que alcanzan confluencia después de 1 semana y presentan las principales características RPE como forma hexagonal y pigmentación después de 2 semanas. Las células RPE obtenidas pueden ser utilizadas para un número de aplicaciones posteriores tales como vitamina A metabolismo9, fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor10 y ion transporte11, ...

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es una sola capa de células epiteliales polarizadas que se encuentra entre la retina neural y la coroides del ojo. La funcionalidad de las células RPE y la integridad de la monocapa RPE son críticos para la visión porque del RPE desempeña un papel importante en varios procesos como el mantenimiento de la barrera sangre-retiniana externa, transporte de agua e iones entre la retina y el absorción de la coroide, luz, protección contra el estrés oxidativo, el control del metabolismo de los retinoides y fagocitosis de los segmentos externos de los fotorreceptores1,2. La ubicación de la ERP en la parte posterior del ojo, así como su función de barrera evitando fármacos administrados sistémicamente de paso de la sangre al humor vítreo, dificultar estudiar la complejidad de la función la EPR en vivo. Así, hay una gran necesidad para el establecimiento de cultivos de células RPE para el estudio de las células RPE en un ambiente flexible, controlado3,4.
Existe un número de líneas establecidas de células RPE, proporciona una manera fácil y conveniente de obtención y almacenamiento de las células; sin embargo, las células los tienen algunas desventajas en comparación con células primarias2,3,4. En primer lugar, a menudo se caracterizan por cambios en la morfología de la célula. Por ejemplo, ninguna de las líneas celulares existentes fueron encontrada para ser conveniente para un estudio confiable de las propiedades de barrera RPE debido a la pérdida del fenotipo de la polaridad celular y desaparición parcial de ensambladuras apretadas4. Además de la pérdida de polaridad y conexiones adecuadas de célula a célula, las líneas de células RPE rápidamente pierden su pigmentación debido a la ausencia de las enzimas clave de la melanogénesis en el RPE adulto5. La pigmentación puede ser restaurada, pero el análisis integral del mecanismo de la pigmentación que incluiría una combinación de microscopía electrónica de transmisión, ensayos de química y análisis de expresión genética para confirmar la presencia de melanina nunca ha se han realizado6. Una limitación más es que las líneas de células RPE tienen vida extendido (a veces - la inmortalidad) y bajo ciertas condiciones pueden transformarse en renovado células madre multipotentes que separar del sustrato y forma flotante colonias7, 8. esta limitación hace que sea imposible utilizar las líneas de células para trasplante de experimentos3.
Teniendo en cuenta las desventajas de las líneas establecidas de células RPE, cultivos primarios de células RPE obtenidos de tejidos frescos podrían servir como un modelo biológicamente más relevante para el estudio del RPE. Las células RPE primarias han sido utilizadas no sólo para estudiar las funciones específicas de RPE como metabolismo de la vitamina A9, fagocitosis de los segmentos externo de fotorreceptor10 y ion transporte11, sino también para estudiar biología celular básica tales como epiteliales polaridad de la célula2 , homeostasis lisosomal y autofagia12,13.
En los últimos años ha habido un número de publicaciones sobre el establecimiento de cultivos primarios de RPE, que indica un creciente interés en esta área de investigación3,14,15. Numerosos protocolos para células RPE humanas y no humanas RPE células como las células RPE de bovina y porcinas fueron publicados16,17,18,19. Sin embargo, es más difícil manejar las células RPE ratón debido a su tamaño mucho más pequeño. A pesar de que absolutamente un número de publicaciones ha descrito protocolos para aislar células RPE del ratón14,20,21, todavía hay muchos investigadores que luchan aislar las células RPE sin contaminación de células coroides o de desechos de retina neural. Aquí presentamos el protocolo para el establecimiento de cultivo de células RPE, incluyendo la obtención de los ojos del ratón, la disección de los ojos y el aislamiento de las hojas RPE para producir las células de cultivo primario de ratón. Este protocolo video sería especialmente útil para los investigadores que están empezando a trabajar con cultivos primarios de RPE de ratón y necesita orientación sobre las técnicas de disección.

<table><tbody><tr><td>animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ~ ratones de tipo</td><td></td><td></td><td></td> salvaje de 3 semanas de edad</tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>reactivos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM), alto contenido de glucosa</td><td>GIBCO</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>dispasa II</td><td>Sigma</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1X, pH 7,4</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Cellgro</td><td></td><td>61-034</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1310-58-3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>GIBCO</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo RPE65</td><td>Un regalo del Dr. Michael Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceína Faloidina &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>F432</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG (H+L), Harina Alexa 568&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A11011&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suero</td><td>de cabra Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00380</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 Anticuerpo policlonal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catálogo Número</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>instruments and equipmentsCabina de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>flujo laminar</td><td>Baker</td><td>SterilGARD SG403A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección (microscopio estereoscópico Zoom)</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 con esterilización por aire caliente</td><td>Binder</td><td>C150</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875712</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Insertos de membrana de poliéster precargados en placas de cultivo de 12 pocillos, tamaño de poro: 0,4 y micro; m, estéril</td><td>Corning Incorporated</td><td>COR-3460</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tenotomía Westcott, hojas estándar, afiladas</td><td>STEPHENS instruments</td><td>S7-1320</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo pinzas de sutura 0,12 mm</td><td>Stroz Ophthalmic Instruments</td><td>E1796</td><td></td></tr><tr><td>Crescent cuchillo recto</td><td>Beaver-Visitec International</td><td>373808</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Pinzas #5, 11 cm, Rectas, 0,1x0,06 mm Puntas, Dumostar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Vannas, 8 cm, 45&deg; Ángulo, estándar</td><td>World Precision Instruments</td><td>500260</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa Millex-GS, 0.22 y micro; m</td> Jeringa <td>de SLGL0250S</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>, 5 mL</td><td>BD</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de Laboratorio Invertido&nbsp; Leica DM IL LED</td><td>&nbsp; Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barrier y puntas de pipeta no filtradas</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

Primary Cell Cultures from the Mouse Retinal Pigment Epithelium

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio multifuncional altamente polarizado que se encuentra entre la retina neural y la coroides del ojo. Es una sola hoja de células pigmentadas que es hexagonal embalado y conectadas por uniones estrechas. Las principales funciones del RPE incluyen la absorción de la luz, fagocitosis de los segmentos externo del fotorreceptor de vertiente, búfer espacial de iones, transporte de nutrientes, iones y agua, así como participación activa en el ciclo visual. Con tales funciones importantes y diversas, es críticamente importante para el estudio de la biología de las células RPE. Se han establecido una serie de líneas de células RPE; sin embargo, las células inmortalizadas y los conocen a perder rápidamente algunas de las características morfológicas y fisiológicas de las células RPE naturales. Así, células primarias son más adecuadas para el estudio de diferentes aspectos de la biología de la célula RPE y función. Cultivo de células RPE primaria de ratón es muy útil a los investigadores desde modelos de ratón son ampliamente utilizados en estudios de biología, sin embargo recoger RPE células de ratón también es muy difícil debido a su pequeño tamaño. Aquí, presentamos un protocolo para el establecimiento de cultivos de células primarias de ratón RPE que incluye enucleación y disección de los ojos y el aislamiento de las hojas RPE para producir las células de cultivo. Este método permite la recuperación eficiente de la célula. Las células RPE de dos ratones pueden llegar a la confluencia en una inserción de membrana poliéster 12 mm cargado en placa de cultivo después de una semana de la cultura y mostrar algunas de las propiedades originales de buena fe RPE células como forma hexagonal y pigmentación después de dos semanas de la cultura.

El ratón RPE cultivo primario establecido de 2 ratones en 12 mm membrana poliéster relleno alcanza 90-95% confluencia después de 1 semana en cultura. Después de 2 semanas de cultivo, las células alcanzaron 100% de confluencia y comenzaron a formar un mosaico de células hexagonales pigmentadas y bi-nucleated. Por 3 semanas de cultivo, las células continúan forman la forma y la pigmentación, sin embargo, después de 4 semanas una porción de células consiguió hiperpigmentadas (<strong class="...

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a highly polarized multi-functional epithelium that is located between the neural retina and the choroid of the ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una forma factible de obtener células de epitelio pigmentario de la retina a partir de ojos de ratón y cultivarlas in vitro conservando sus propiedades originales. Este método ayudará a los investigadores de RPE a obtener las habilidades de disección que se requieren para el establecimiento de cultivos de células RPE de ratón, y a demostrar cómo hacerlo de una manera fácil. La principal ventaja de este procedimiento es que es sencillo y factible.Lo único que se requiere es práctica, y la demostración visual del aislamiento del EPR y la microscopía demuestra literalmente cómo obtener las habilidades requeridas. Para aislar los globos oculares de los ratones, primero se practica la eutanasia a dos ratones utilizando cualquier método aprobado y, con guantes, colóquelos en una almohadilla absorbente. Coloque el pulgar y el índice alrededor del ojo y empuje suavemente la piel para sobresalir el globo ocular.Una vez que el globo ocular sobresalga, mete la punta de unas tijeras en ángulo entre la piel y el globo ocular y corta con cuidado el tejido alrededor del ojo hasta que se suelte. Luego, sumerja brevemente el ojo aislado en el etanol al 70% y sumérjalo en PBS en una placa de Petri. Después de recolectar ambos ojos de cada uno de los ratones, proceda con la disección.Bajo el microscopio de disección, extraiga cuidadosamente la mayor parte del tejido conectivo alrededor del ojo. No es necesario mantener el ojo sumergido durante este paso. Para ello, utiliza unas pinzas de sutura para levantar los tejidos conectivos del globo ocular y córtalos con unas tijeras Vannas.No corte la esclerótica porque es prácticamente imposible obtener las copas oculares posteriores intactas si la esclerótica se corta. Después de limpiar el tejido conectivo, sumerja los globos oculares en PBS y cambie a trabajar en un gabinete de flujo laminar en condiciones estériles. Ahora, use fórceps para transferir los ojos a un plato de DMEM caliente que contenga una alta concentración de glucosa.Después de 20 a 30 segundos, reemplace la solución de lavado mediante aspiración para un segundo lavado. Transfiera los globos oculares a una solución de trabajo tibia al 2%Dispasa II en tubos de 15 ml y deje que los ojos se incuben a 37 grados centígrados durante 45 minutos para que se disocien. Después de la incubación, los globos oculares deben estar blandos.A continuación, lávese los ojos dos veces en el mismo recipiente con medio de crecimiento caliente. Después del segundo lavado, reemplace el medio de crecimiento con medio fresco y transfiera los globos oculares y el medio a un nuevo plato para continuar la disección. Continúe trabajando en un banco limpio con la ayuda de un microscopio de disección.Comience la disección asegurando el ojo con pinzas y haga una incisión alrededor de la ora serrata con unas tijeras Vannas. Manteniendo el globo ocular en la solución, retire con cuidado la córnea anterior extendiendo el corte alrededor de la circunferencia de la ora serrata. Después de completar el corte, retire la córnea anterior.A continuación, retire la cápsula del cristalino y el epitelio pigmentado del iris asociado tirando suavemente de ella fuera de la copa del ojo con pinzas dentadas. A continuación, se repite la disección en los ojos restantes y se incuban las copas oculares posteriores en un medio de crecimiento durante 20 minutos a 37 grados centígrados para facilitar la separación de la retina neural del EPR. Después de 20 minutos, corte las copas posteriores del ojo en cuatro pétalos.Haz los cortes lo suficientemente largos como para aplanar el ocular, pero lo suficientemente cortos como para mantener los pétalos conectados. A continuación, aplana la copa del ojo para extraer la retina neural. Asegure el complejo esclerótico coroideo del EPR restante con la mano no dominante y tire muy suavemente de la retina de los bordes.Una vez que se extirpa la retina neural, transfiera el complejo de esclerótica coroidea del EPR en cuartos a una nueva placa de cultivo estéril llena de medio de crecimiento tibio. En la placa de Petri, asegure un pétalo del complejo de esclerótica coroidea del EPR en cuartos con pinzas superfinas y, con un bisturí de media luna microquirúrgico, retire suavemente las láminas intactas de EPR de la membrana basal subyacente. El EPR parduzco debe distinguirse claramente de la coroide oscura, pegajosa y esponjosa.A continuación, humedezca una punta de micropipeta p200 con medio de crecimiento y utilice la punta para transferir las hojas de RPE a la nueva placa que contiene medio de crecimiento calentado. Ahora, lave las hojas de RPE tres veces en un medio de crecimiento caliente. Después de cada paso de lavado, recoja cuidadosamente las hojas de EPR evitando otros tejidos, como los desechos de la retina o la coroides.Después del último lavado, transfiera las láminas de EPR a un tubo de 1,5 ml y deje que se sedimenten por gravedad. Luego, en la cabina de flujo laminar, retire el medio de crecimiento adicional y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento cálido recién hecho. Ahora, triture suavemente el tejido con una micropipeta p200 sin hacer burbujas.Triturar entre 40 y 50 veces, lo suficiente para hacer una suspensión de una sola celda. Tenga cuidado, ya que demasiada trituración puede ser letal. Ahora, coloque las células EPR recolectadas de ambos ratones en un inserto de membrana de poliéster de 12 ml en el pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.Se desea una alta densidad celular para que las células del EPR conserven su forma hexagonal y pigmentación. Un cultivo primario de EPR en ratón establecido a partir de dos ratones en un inserto de membrana de poliéster de 12 mm alcanzó una confluencia del 90 al 95% después de una semana en cultivo. Después de dos semanas en cultivo, las células eran 100% confluentes y comenzaron a formar un mosaico de células hexagonales pigmentadas y binucleadas.Para la tercera semana, las células continuaron cambiando de forma y pigmentación. Sin embargo, después de cuatro semanas, una parte de las células se hiperpigmentó. La pureza del cultivo celular primario del EPR se evaluó utilizando el anticuerpo RPE65, que marca la isomerohidrolasa retinoides, una enzima crítica para el ciclo visual de los vertebrados.La integridad de las uniones entre células y la forma de la célula hexagonal se demostraron mediante tinción con faloidina. Las uniones estrechas se visualizaron mediante el análisis de la expresión de la proteína ZO-1, que pudo visualizarse mediante una tinción de aminoácidos y validarse mediante Western blot. En general, los cultivos son capaces de proliferar, retener la pigmentación y su forma hexagonal mientras forman uniones estrechas y expresan marcadores funcionales, como RPE65.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células EPR de los ojos del ratón y cultivarlas correctamente in vitro. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe mantener los ojos húmedos y tratar de operar lo más rápido posible.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Ofrecemos un método reproducible para el cultivo de las monocapas confluentes de células fetales humanas del epitelio pigmentario de la retina (hfRPE) las células que presentan la morfología, la fisiología, la polaridad, y la proteína y los patrones de expresión génica del tejido nativo adulto. Este trabajo se ha extendido a un modelo animal de enfermedades de los ojos de varios.

Modelos experimentales para el estudio de la fisiología epiteliales del pigmento retiniano y fisiopatología

En este video, vamos a demostrar cómo aislar las células madre de la retina del epitelio ciliar del ojo del ratón y hacer crecer en cultivo de forma clonal esferas de retina. Las esferas que se encuentran aisladas poseen las propiedades cardinales de las células madre: la auto-renovación y multipotencialidad.

Aislamiento de células madre de la retina del ojo del ratón

Retina neural de un ratón envejecido 8 días es en la parte superior de un bloque de gelatina 4%. Después del aislamiento de la capa de fotorreceptores (200 m) por vibratome, los fotorreceptores se siembran después de la disociación mecánica y enzimática para la cultura. La capa de fotorreceptores se puede utilizar para, análisis o trasplante bioquímicos moleculares.

Vibratome Seccionamiento retina del ratón para preparar cultivos de fotorreceptores

El protocolo describe explantes organotípicos de ratón neuroretina,cultivados junto con su epitelio pigmentario retiniano (EPR), en medio definido R16, libre de suero y antibióticos. Este método es relativamente simple de realizar, menos costoso y lento en comparación con los experimentos in vivo, y se puede adaptar a numerosas aplicaciones experimentales.

A largo plazo, Cultivo Sin Suero De Explantes Organotípicos De La Retina De Ratón Con Epitelio Pigmento Retiniano Intacto

Este protocolo, que fue reportado originalmente por Fernandez-Godino et al. en 20161,describe un método para aislar eficientemente y cultivo de células RPE del ratón, que forman una monocapa RPE funcional y polarizada dentro de una semana en las placas Transwell. El procedimiento dura aproximadamente 3 horas.

Disección eficiente y cultivo de células epiteliales de pigmento retiniano de ratón primario

Este manuscrito describe un protocolo simplificado para el aislamiento de las células del epitelio pigmentado de la retina (EPR) de los ojos de ratón de una manera gradual. El protocolo incluye la enucleación y disección de los ojos del ratón, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de células del EPR.

Aislamiento de células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón

Aquí, se presenta un método fácil de seguir para cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina in vitro .

Cultivo primario de células epiteliales pigmentarias de la retina porcina

Describimos un método simple y eficiente para aislar células del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de los ojos de conejillos de indias pigmentados jóvenes. Este procedimiento permite realizar estudios de biología molecular de seguimiento en el EPR aislado, incluidos los análisis de expresión génica.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias de la retina de ojos de conejillo de indias

Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) actúa como una barrera crucial entre la coroides y la retina, promoviendo la salud y la función de los tipos de células de la retina, como los fotorreceptores. En este trabajo se describe un protocolo sencillo y eficaz para el aislamiento y cultivo de EPR murino adulto.

Un método simplificado para el aislamiento y cultivo de células epiteliales pigmentarias de la retina de ratones adultos

Aprende a aislar y cultivar células del epitelio pigmentario de la retina de ratón manteniendo sus propiedades originales. Este protocolo sencillo permite adquirir habilidades de disección esenciales para investigación ocular.

Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

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