Cultivos celulares primarios de células del epitelio pigmentario de la retina del ratón

El epitelio retiniano del pigmento (RPE) es un epitelio de múltiples funciones del ojo. Aquí presentamos un protocolo para establecer cultivos celulares primarios derivados del RPE murino.

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una forma factible de obtener células de epitelio pigmentario de la retina a partir de ojos de ratón y cultivarlas in vitro conservando sus propiedades originales. Este método ayudará a los investigadores de RPE a obtener las habilidades de disección que se requieren para el establecimiento de cultivos de células RPE de ratón, y a demostrar cómo hacerlo de una manera fácil. La principal ventaja de este procedimiento es que es sencillo y factible.

Lo único que se requiere es práctica, y la demostración visual del aislamiento del EPR y la microscopía demuestra literalmente cómo obtener las habilidades requeridas. Para aislar los globos oculares de los ratones, primero se practica la eutanasia a dos ratones utilizando cualquier método aprobado y, con guantes, colóquelos en una almohadilla absorbente. Coloque el pulgar y el índice alrededor del ojo y empuje suavemente la piel para sobresalir el globo ocular.

Una vez que el globo ocular sobresalga, mete la punta de unas tijeras en ángulo entre la piel y el globo ocular y corta con cuidado el tejido alrededor del ojo hasta que se suelte. Luego, sumerja brevemente el ojo aislado en el etanol al 70% y sumérjalo en PBS en una placa de Petri. Después de recolectar ambos ojos de cada uno de los ratones, proceda con la disección.

Bajo el microscopio de disección, extraiga cuidadosamente la mayor parte del tejido conectivo alrededor del ojo. No es necesario mantener el ojo sumergido durante este paso. Para ello, utiliza unas pinzas de sutura para levantar los tejidos conectivos del globo ocular y córtalos con unas tijeras Vannas.

No corte la esclerótica porque es prácticamente imposible obtener las copas oculares posteriores intactas si la esclerótica se corta. Después de limpiar el tejido conectivo, sumerja los globos oculares en PBS y cambie a trabajar en un gabinete de flujo laminar en condiciones estériles. Ahora, use fórceps para transferir los ojos a un plato de DMEM caliente que contenga una alta concentración de glucosa.

Después de 20 a 30 segundos, reemplace la solución de lavado mediante aspiración para un segundo lavado. Transfiera los globos oculares a una solución de trabajo tibia al 2%Dispasa II en tubos de 15 ml y deje que los ojos se incuben a 37 grados centígrados durante 45 minutos para que se disocien. Después de la incubación, los globos oculares deben estar blandos.

A continuación, lávese los ojos dos veces en el mismo recipiente con medio de crecimiento caliente. Después del segundo lavado, reemplace el medio de crecimiento con medio fresco y transfiera los globos oculares y el medio a un nuevo plato para continuar la disección. Continúe trabajando en un banco limpio con la ayuda de un microscopio de disección.

Comience la disección asegurando el ojo con pinzas y haga una incisión alrededor de la ora serrata con unas tijeras Vannas. Manteniendo el globo ocular en la solución, retire con cuidado la córnea anterior extendiendo el corte alrededor de la circunferencia de la ora serrata. Después de completar el corte, retire la córnea anterior.

A continuación, retire la cápsula del cristalino y el epitelio pigmentado del iris asociado tirando suavemente de ella fuera de la copa del ojo con pinzas dentadas. A continuación, se repite la disección en los ojos restantes y se incuban las copas oculares posteriores en un medio de crecimiento durante 20 minutos a 37 grados centígrados para facilitar la separación de la retina neural del EPR. Después de 20 minutos, corte las copas posteriores del ojo en cuatro pétalos.

Haz los cortes lo suficientemente largos como para aplanar el ocular, pero lo suficientemente cortos como para mantener los pétalos conectados. A continuación, aplana la copa del ojo para extraer la retina neural. Asegure el complejo esclerótico coroideo del EPR restante con la mano no dominante y tire muy suavemente de la retina de los bordes.

Una vez que se extirpa la retina neural, transfiera el complejo de esclerótica coroidea del EPR en cuartos a una nueva placa de cultivo estéril llena de medio de crecimiento tibio. En la placa de Petri, asegure un pétalo del complejo de esclerótica coroidea del EPR en cuartos con pinzas superfinas y, con un bisturí de media luna microquirúrgico, retire suavemente las láminas intactas de EPR de la membrana basal subyacente. El EPR parduzco debe distinguirse claramente de la coroide oscura, pegajosa y esponjosa.

A continuación, humedezca una punta de micropipeta p200 con medio de crecimiento y utilice la punta para transferir las hojas de RPE a la nueva placa que contiene medio de crecimiento calentado. Ahora, lave las hojas de RPE tres veces en un medio de crecimiento caliente. Después de cada paso de lavado, recoja cuidadosamente las hojas de EPR evitando otros tejidos, como los desechos de la retina o la coroides.

Después del último lavado, transfiera las láminas de EPR a un tubo de 1,5 ml y deje que se sedimenten por gravedad. Luego, en la cabina de flujo laminar, retire el medio de crecimiento adicional y vuelva a suspender las células en un medio de crecimiento cálido recién hecho. Ahora, triture suavemente el tejido con una micropipeta p200 sin hacer burbujas.

Triturar entre 40 y 50 veces, lo suficiente para hacer una suspensión de una sola celda. Tenga cuidado, ya que demasiada trituración puede ser letal. Ahora, coloque las células EPR recolectadas de ambos ratones en un inserto de membrana de poliéster de 12 ml en el pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.

Se desea una alta densidad celular para que las células del EPR conserven su forma hexagonal y pigmentación. Un cultivo primario de EPR en ratón establecido a partir de dos ratones en un inserto de membrana de poliéster de 12 mm alcanzó una confluencia del 90 al 95% después de una semana en cultivo. Después de dos semanas en cultivo, las células eran 100% confluentes y comenzaron a formar un mosaico de células hexagonales pigmentadas y binucleadas.

Para la tercera semana, las células continuaron cambiando de forma y pigmentación. Sin embargo, después de cuatro semanas, una parte de las células se hiperpigmentó. La pureza del cultivo celular primario del EPR se evaluó utilizando el anticuerpo RPE65, que marca la isomerohidrolasa retinoides, una enzima crítica para el ciclo visual de los vertebrados.

La integridad de las uniones entre células y la forma de la célula hexagonal se demostraron mediante tinción con faloidina. Las uniones estrechas se visualizaron mediante el análisis de la expresión de la proteína ZO-1, que pudo visualizarse mediante una tinción de aminoácidos y validarse mediante Western blot. En general, los cultivos son capaces de proliferar, retener la pigmentación y su forma hexagonal mientras forman uniones estrechas y expresan marcadores funcionales, como RPE65.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar las células EPR de los ojos del ratón y cultivarlas correctamente in vitro. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre debe mantener los ojos húmedos y tratar de operar lo más rápido posible.