Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Esperamos que estos protocolos detallados ayuden a mejorar la reproducibilidad en nuestro campo y, al mismo tiempo, permitan a los investigadores tomar una decisión informada al seleccionar el método de contabilidad para sus estudios. Al utilizar varios parámetros de muestreo, la estereología es muy sensible y precisa. Sin embargo, los recuentos directos son más rápidos y sencillos y pueden realizarse en muestras preparadas con técnicas histológicas estándar.

La estereología se utiliza en estudios de biología ovárica para evaluar el impacto de los tóxicos en las reservas ováricas. También se puede aplicar a las ciencias de la vida para el estudio del riñón y el cerebro. Familiarizarse con la morfología de los folículos requiere experiencia.

El uso de estudios previos para definir la morfología junto con el establecimiento de criterios estandarizados de clasificación puede ayudar con la consistencia. Para estimar el número de folículos primordiales por estereología utilizando un fraccionador óptico, encienda la computadora, la unidad de control múltiple, la cámara y la fuente de luz dentro de la configuración de estereología, y ajuste el objetivo del microscopio a un aumento bajo. Abra el software de estereología y coloque el primer portaobjetos de forma segura en la platina del microscopio.

Utilice el joystick para localizar la primera muestra de tejido y enfocar la muestra. En el panel de configuración de la cámara, en exposición, haga clic y arrastre la escala deslizante para ajustar la exposición a la luz. En el panel de configuración de la cámara, haga clic en el botón de balance de blancos y haga clic en un área en blanco de la sección para ajustar el balance de blancos.

Abra el menú de sondas para seleccionar el flujo de trabajo del fraccionador óptico y, a continuación, haga clic en iniciar nuevo sujeto y listo. Si se ha guardado una configuración de muestreo existente, haga clic en Sí en Parámetros de muestreo y seleccione la configuración de muestreo deseada. Haga clic en Siguiente, configure el microscopio con un aumento bajo y seleccione el aumento de 10x.

Haga clic en siguiente y haga clic con el botón izquierdo para trazar toda la sección ovárica. Haga clic con el botón derecho para finalizar la selección y seleccione cerrar contorno. Haga clic en Siguiente, configure el microscopio en aumento alto y seleccione el aumento de aceite de 100x.

Después de colocar una gota de aceite en la sección de tejido del portaobjetos, ajuste la exposición a la luz como se demuestra, vuelva a enfocar la muestra y haga clic en siguiente. A continuación, haga clic en iniciar el recuento, concéntrese en la parte superior de la muestra, haga clic en Aceptar y comience a contar. Utilice la perilla de enfoque para moverse a través de la profundidad de muestreo de 10 micras y mire dentro del marco de conteo en busca de folículos en los que el núcleo del ovocito se enfoque.

A continuación, haga clic en Siguiente para pasar al siguiente sitio. Clasifique un folículo como primordial si el ovocito está rodeado de células escamosas planas de la granulosa, pero no de células de la granulosa cuboidal. Cuente solo los folículos en los que el núcleo del ovocito es visible.

El núcleo debe aparecer dentro del marco de conteo o estar tocando las líneas de inclusión verdes del marco de conteo. Si el núcleo del ovocito queda fuera del marco de recuento o toca las líneas rojas de exclusión del marco de recuento, no cuente este folículo. Al evaluar el agotamiento del folículo primordial en respuesta a una sustancia química exógena, asegúrese de que todos los folículos contados estén sanos con una morfología normal.

Cuente los folículos anormales o atréticos por separado. Cuando se hayan contado todos los sitios de la sección, haga clic en agregar nueva sección para configurar y contar los folículos en la siguiente sección, o haga clic en Terminé de contar para finalizar la sesión y salir del software. A continuación, obtenga la suma del número de folículos brutos de cada sección de tejido muestreada de todo el ovario, y utilice la fórmula indicada para calcular el valor final de cada animal replicado.

Para estimar el número de folículos primordiales mediante el recuento directo de folículos, obtenga múltiples fotomicrografías de alta potencia suturadas de toda la sección de tejido ovárico. Para analizar las imágenes, ábralas en el software ImageJ. Para clasificar los folículos como primordiales, los ovocitos deben ser claramente visibles y estar rodeados de células escamosas de la granulosa, pero no de células de la granulosa cuboidal.

Utilice la herramienta de conteo para obtener un número de folículos sin procesar de los folículos primordiales con cada sección muestreada del tejido. Una vez obtenida la suma del número de folículos brutos de cada sección de tejido muestreada, se multiplique este número por el inverso de la fracción de muestreo para obtener el valor final para cada animal como se demuestra. Cuando se utiliza la estereología, se puede detectar un agotamiento significativo de los folículos primordiales del ratón después del tratamiento con quimioterapia en comparación con el detectado en los animales de control.

Por el contrario, al utilizar los ovarios contralaterales de los mismos animales, los recuentos directos de folículos no lograron detectar una reducción significativa de la reserva ovárica después de la quimioterapia en comparación con los controles. En particular, está claro que el número de folículos primordiales en los animales adultos jóvenes de tipo salvaje es variable, ya que la distribución de los animales tratados con solución salina es más amplia en comparación con los grupos de ciclofosfamida, incluso cuando los recuentos se realizan por estereología. Es importante poder clasificar con precisión los folículos primordiales para diferenciar entre folículos sanos y atréticos, e incluir o excluir adecuadamente folículos individuales del recuento general.

Estas técnicas de cuantificación de folículos en crecimiento y cuerpos lúteos se pueden utilizar junto con la inmunofluorescencia y la tinción de marcadores de viabilidad celular para cuantificar el número de folículos que expresan marcadores específicos de interés. La estereología y el recuento directo se utilizan para evaluar cómo la enfermedad y las lesiones exógenas pueden alterar la reserva ovárica, lo que lleva a una evaluación más completa de los tóxicos y sus impactos en la fertilidad femenina.