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Summary

Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Abstract

Des cassures double brin (CDB) de l'ADN sont les plus délétères des lésions d'une cellule peut rencontrer. Si laissé non réparés, CSD port un grand potentiel pour générer des mutations et des aberrations chromosomiques ^1. Pour éviter ce traumatisme de catalyser l'instabilité génomique, il est crucial pour les cellules pour détecter les conseils scolaires de district, activer la réponse dommages à l'ADN (DDR), et réparer l'ADN. Quand ils sont stimulés, la DDR travaille à préserver l'intégrité du génome en déclenchant l'arrêt du cycle cellulaire pour permettre la réparation doit avoir lieu ou forcer la cellule à l'apoptose. Les mécanismes prédominants de réparation des CDB se produire par recombinaison non homologue bout de jonction (NHEJ) et la réparation recombinaison homologue (HRR) (révisé en ^2). Il existe de nombreuses protéines dont les activités doivent être précisément orchestrée pour le DDR pour fonctionner correctement. Nous décrivons ici une méthode pour le 2 – et 3-dimensions (D) Visualisation d'une de ces protéines, 53BP1.

La protéine p53 lie 1 (53BP1) se localise dans les zones deCDB en se liant aux histones modifiées ^3,4, formant des foyers à 5-15 minutes ^5. Les modifications des histones et de recrutement de protéines DDR 53BP1 et d'autres vers des sites ORD sont censés faciliter le réarrangement structural de la chromatine autour des zones de dommages et contribuent à ⁶ réparation de l'ADN. Au-delà de la participation directe à la réparation, des rôles supplémentaires ont été décrits pour 53BP1 dans le DDR, tels que la régulation de un point de contrôle intra-S, un point de contrôle G2 / M, et l'activation de protéines en aval de DDR ^7-9. Récemment, on a découvert que 53BP1 ne pas former des foyers en réponse à dommages à l'ADN induits lors de la mitose, au lieu d'attendre pour les cellules à entrer G1 avant de repérer à proximité du CSD ^6. DDR protéines telles que 53BP1 ont été trouvés à associer avec des structures mitotiques (comme kinétochores) au cours de la progression à travers la mitose ^10.

Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de 2 – et 3-D imagerie des cellules vivantes pour visualiserla formation de foyers 53BP1 en réponse à l'agent de détérioration d'ADN camptothécine (CPT), ainsi que le comportement de 53BP1 lors de la mitose. La camptothécine est un inhibiteur de topoisomérase I qui provoque principalement CDB lors de la réplication d'ADN. Pour ce faire, nous avons utilisé un décrit précédemment 53BP1-mCherry protéine de fusion fluorescente construire composée d'un domaine protéique 53BP1 capable de se lier CDB ^11. En outre, nous avons utilisé une histone H2B-GFP protéine de fusion fluorescente construire en mesure de suivre la dynamique de la chromatine au long du cycle cellulaire, mais en particulier lors de la mitose ^12. Imagerie des cellules vivantes dans des dimensions multiples est un excellent outil pour approfondir notre compréhension de la fonction des protéines de DDR dans les cellules eucaryotes.

Protocol

Préparation des cellules A.

1. Humaines normales (fibroblastes primaires GM02270) ont été obtenus à partir du référentiel cellulaire Coriell, Camden, New Jersey, et a immortalisé avec hTERT ^6. Les cellules ont été cultivées et développées dans CELLSTAR de 6 cm plats dans les médias (4 ml) constitués de MEM supplémenté avec 20% de sérum de veau foetal (Gibco), non-essential/essential acides aminés, de vitamines, de pyruvate de sodium, et de la pénicilline / streptomycine (HyClone ).
2. De rein embryonnaire humain 293 (HEK293), les cellules ont été obtenues à partir de l'American Type Culture Collection et pris de l'ampleur en CELLSTAR 6-vaisselle cm. Les cellules ont été maintenues dans les médias (4 ml) constitué de DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal, non-acides aminés essentiels, de L-glutamine et de la pénicilline / streptomycine.
3. 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro; Addgene plasmide 19836) et H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene 17735 plasmide) gène de fusion constructions exprimant également la puromycine ou des gènes de résistance au G418, respectivement, ont été transduites (fibroblam) ou transfectées (HEK293) en utilisant SuperFect (Qiagene) dans les cellules et maintenu sous la sélection des médicaments. Entretien de la fluorescence a été vérifiée périodiquement.
4. 24-48 heures avant l'acquisition des images, les cellules ont été traitées à la trypsine dans une suspension à cellule unique et ensemencées à faible densité de 3,5 cm sur FluroDish plaques à fond de verre.

Configuration Microscope B. et d'acquisition d'images

Ce protocole a été développé en utilisant la cellule Zeiss Observer SD microscope confocal à disque rotatif équipé d'un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-X1A modèle 5000 disque de rotation, 2 Photometrics QuantEM 512SC caméras EMCCD, un HXP 120C à base de fibres d'éclairage, 4 lasers (un Lasos 100mW multi-lignes argon [458, 488, 514 nm], 50 mW nm diode 405, 40 mW nm diode 561, et 30 mW diode 635 nm), AOTF, un Pecon XL multiS1 système d'incubation stade, l'incubation Zeiss modules (Module O ₂ S, CO ₂ Module S, S TempModule, chauffage Unité XL S) et un pré motorized XY avec un insert NanoScanZ piézo Z. Pour minimiser les aberrations sphériques tandis que les cellules vivantes d'imagerie supporté dans un milieu aqueux, un C-Apochromat 63x/1.20 eau / Corr lentille d'objectif et Zeiss Immersol fluide d'immersion W (avec un indice de réfraction n = 1,334) ont été utilisés. Pour 2 canaux imagerie confocale, une RQFT 405/488/568/647 miroir dichroïque et BP525/50 (vert) et BP629/62 (rouge) filtres d'émission ont été utilisés. Le logiciel du système utilisé était Zeiss AxioVision (ver. 4.8.2.0) avec AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, physiologie, MosaiX, Mark & ​​Find, double caméra, l'intérieur de 4D, autofocus et modules Déconvolution 3-D.

1. Veiller à ce que le gaz CO ₂ est en marche pour le CO ₂ Module du système d'incubation. Si le microscope est supporté par une table anti-vibration de l'air, allumer l'alimentation en air (ou gaz N ₂₎ de la table d'air.
2. Tournez sur la puissance du statif du microscope, unité de disque en rotation, caméras, modules d'incubation, illuminateur HXP, platine motorisée, Argonlaser, et l'ordinateur.
3. Après 1 min de temps de préchauffage, tournez la clé de contact pour le laser Argon sur "On".
4. Sur le panneau de commande du laser Zeiss, mettez les commutateurs pour les lignes laser à utiliser.
5. Mettez le commutateur à bascule pour le contrôleur Lasos laser argon de «veille» à «run laser" et régler le contrôleur de lumière au niveau optimal (c'est à dire juste en dessous du point où le voyant vert s'allume en rouge).
6. Démarrez le logiciel AxioVision. Remarque: l'interface utilisateur pour AxioVision peut être personnalisé avec des menus et fenêtres déroulant qui sont spécifiques pour le microscope particulier et les composants qu'il contrôle. Ainsi, chaque système possède une interface potentiellement unique. Par conséquent, des instructions générales pour la manipulation des logiciels sont fournis dans les étapes suivantes, plutôt que de directions pour les fenêtres, les onglets de logiciels spécifiques et / ou des menus déroulants.
7. Environ 1 heure avant l'imagerie, dans le logiciel, repérez les contrôles de l'incubateur etallumer le chauffage de la chambre supérieure et la plaque de platine. Réglez la température à 37 ° C. Allumez le CO ₂ de contrôle et de régler le niveau à 5%.
8. Sélectionner la lentille d'objectif pour l'imagerie. Dans cette étude, une 63x/1.20 NA C-Apochromat Eau / Corr objectif a été utilisé. Remarque: Pour cet objectif, un milieu d'immersion avec un indice de réfraction similaire à l'eau (Zeiss Immersol liquide d'immersion W) est nécessaire.
9. Si plusieurs positions distinctes doivent être échantillonnées sur une longue période de temps, être certain d'appliquer une quantité suffisante de milieu d'immersion afin de s'assurer qu'il est réalisé à partir d'une position à une autre.
10. Placer la capsule sur la scène et mettre en place la lentille d'objectif en contact avec le fond.
11. À l'aide des commandes du microscope ou du logiciel, diriger la lumière émise vers les oculaires et sélectionnez le champ large du filtre définie pour le signal de fluorescence d'intérêt (pour cette étude, "rouge" filtre définie pour 53BP1 et un "GFP" filtre définie pour H2B ). </ Li>
12. Voir à travers les lentilles oculaires, focaliser l'image, et localiser un champ approprié de cellules.
13. En utilisant soit le logiciel ou les commandes de microscope, diriger la lumière émise à l'écart des oculaires vers le port avec l'unité de disque en rotation confocale.
14. Dans le logiciel, mettez le laser approprié (pour cette étude, le laser 561 nm pour 53BP1 et la ligne de 488 nm du laser Argon pour H2B).
15. Pour chaque canal, régler l'intensité du laser en réglant le filtre acousto-optique accordable (AOTF) de commande à un niveau approprié.
16. Sélectionnez le miroir dichroïque appropriée (RQFT 405/488/568/647) et filtres d'émission (BP 629/62 pour 53BP1 et BP 525/50 pour H2B). Ouvrir l'obturateur de l'unité de disque en rotation.
17. Sélectionnez la page "Live" fenêtre pour afficher le champ de vue actuel.
18. Dans le logiciel, ouvrez le "Camera" de commande, sélectionnez la caméra à utiliser (si un système de double caméra) et régler le temps d'exposition d'environ 100 ms. Régler le% EM et acquérir le necRemarque saire:. La construction 53BP1-mCherry semble un peu faible. Nous avons trouvé utile d'augmenter le gain EM.
19. Dans le logiciel, ouvrir la commande de l'unité de disque en rotation confocale et régler la vitesse de rotation du disque en saisissant le temps d'exposition caméra qui a été fixé pour capturer une image convenable (par exemple ~ 100 ms). Cliquez sur "Set" pour verrouiller le changement.
20. Ouvrez "multi-dimensionnelle d'acquisition». Sélectionnez l'onglet canal et de charger / sélectionner les canaux appropriés. Pour cette étude, nous utilisons les canaux définis pour dsRED (561 nm et une excitation laser BP 629/62 pour filtre d'émission) et la GFP (488 nm ligne laser pour l'excitation et BP525/50 filtre pour l'émission).
21. Pour assurer l'enregistrement d'image, un miroir dichroïque commune (RQFT 405/488/568/647) a été utilisé pour les deux canaux. Réglez le logiciel à la section «Autofocus». Remarque: Allez dans Outils → Paramètres rédacteur en chef pour ajuster les paramètres MDA. Assurez-vous que la puissance du laser est suffisante («la puissance du laser adéquate» fait référence à un paramètre qui vous permetpour exciter le fluorophore approprié tout en minimisant les photo-blanchiment).
22. Dans la fenêtre MDA, sélectionnez l'onglet z-pile. Sélectionnez "Z-stack à la position focus courant". Définissez la plage d'environ 10 um Z-stack et choisissez "optimale" pour le nombre de mesures pour s'assurer d'échantillonnage de Nyquist par Z. Remarque: La taille exacte de la z-pile dépendra de la hauteur de vos cellules. Ajustez en conséquence.
23. 23. Cliquez sur "Démarrer" et d'analyser le résultat z-pile d'images pour s'assurer que les réglages sont appropriés pour ce que vous étudiez (par exemple, dans cette étude, il était important de l'image du noyau entier).
24. Sélectionnez le "T" (temps) onglet. Pour notre expérience avec la camptothécine, nous avons mis l'intervalle entre les points de temps d'imagerie à 5 min et la durée totale de la session pendant 1 heure pour un contrôle (cellules non traitées) vidéo. Remarque: afin de minimiser photo-blanchiment des cellules, l'expérience doit être configuré de sorte que l'AOTF flans le laser entre des instants d'imagerie.
25. Faou multi-point imagerie de plusieurs cellules dans le plat, dans la fenêtre MDA, sélectionnez l'onglet position. Veiller à "Appliquer" réglage avant / après le point de temps la position par "est cochée. Sélectionnez "Mark_Find". En utilisant le "Live" point de vue, déplacer la parabole et de sélectionner les champs appropriés de vue.
26. Cliquez sur "Démarrer" dans le menu multi-dimensionnelle d'acquisition pour commencer l'expérience et enregistrer une vidéo de contrôle (des cellules non traitées).
27. Après la vidéo de contrôle, ajoutez le traitement approprié (dans ce cas, 10 camptothécine uM). Nous avons enregistré l'expérimental (cellules traités avec le médicament) vidéo à intervalles 5-10 min pendant 2-4 heures. Remarque: Une question importante à considérer est la rapidité avec laquelle se produit un effet donné après le traitement. Comme on le voit dans la vidéo, 53BP1 foyers commencent à partir de ~ 5 minutes après l'addition du CPT. Même si un processus relativement simple, l'ajout de médicaments à l'antenne manuellement et re-calibrer le microscope prend du temps. Il faut tenir compte lors de la conception de cette expérience.
28. Pour la surveillance des mitosis, nous avons mis l'intervalle de 7,5 min et enregistré pendant 4-5 heures (les paramètres spécifiques dépendent de la lignée cellulaire utilisée et la durée de son cycle cellulaire). Ajustements pourraient devoir être prises pour éviter la photo-blanchiment au cours de longs enregistrements.

C. Traitement de l'image et de l'analyse

Ce protocole a été développé à l'aide du logiciel Volocity (PerkinElmer). Le logiciel utilisé pour l'acquisition de ces données (AxioVision) a également la capacité de traiter et d'analyser les images. Les utilisateurs sont encouragés à utiliser le logiciel mis à leur disposition, et consulter la documentation appropriée concernant leur application.

1. Ouvrez le logiciel Volocity. Créer et nommer une nouvelle bibliothèque, et d'importer vos fichiers vidéo.
2. Pour visualiser les fichiers, nous trouvons généralement le plus utile d'utiliser le "Focus étendue" réglage. Cette superpose les tranches z-stack et, par ce protocole, nous permet de visualiser les foyers 53BP1 dans les différents domaines du noyau.
3. Ajuster les vidéos selon les besoins. Volocity est équipé d'une gamme d'outils pour améliorer la qualité des images acquises. En s'assurant que les paramètres du microscope étaient appropriées, beaucoup de temps peut être sauvé dans l'édition tard. Souvent, il est utile de déconvolution vos images et ajuster la luminosité / contraste. Vos besoins d'édition spécifiques varieront en fonction de l'expérience.
4. Ajouter un horodatage relatif et barre d'échelle.
5. Pour afficher les cellules en 3-D, passez au «3-D Opacité" réglage. Cela permet la rotation des cellules 3-D rendus dans l'espace, offrant ainsi des perspectives multiples de structures d'intérêt dans les cellules. Remarque: Il est utile de visualiser les cellules dans des plans différents pour déterminer où les structures de voyage intérêt. Par exemple, dans le "Focus étendue" réglage, il est difficile de discerner que le 53BP1 ne, en effet, dissocier de l'ADN pendant la mitose. Toutefois, cela est évident en 3-D.
6. Les films et les images fixes peuvent être exportées dans une variété de types de fichiers en fonction des préférences de l'utilisateur. </l i>

D. Représentant Résultats

Un exemple de 53BP1 foyers en réponse au CPT est illustré à la figure 1. Des cellules exposées à l'intérieur des foyers CPT forme 5-10 min, et de maintenir ces foyers pendant toute la durée de l'enregistrement. Comme le montre la figure 2, 53BP1 dissocie de la chromatine au début de la mitose, la formation d'une fine brume autour des chromosomes condensation. En télophase et la mitose se produit arrive à son terme, une fois de plus 53BP1 agrégats dans les foyers distincts. Alors que les cellules HEK293 n'ont pas été exposés au CPT, ils ont néanmoins formé en abondance, des foyers de réparation spontanée générée par 53BP1 dommages à l'ADN endogène. Cette observation nous a permis de conclure que 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose précoce, en accord avec un précédent rapport montrant un effet similaire après l'exposition des cellules aux radiations ionisantes et les drogues radiomimétiques ^5.

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Figure 1. Camptothécine (10 pM) provoque CDB et 53BP1 formation de foyers dans le cyclisme fibroblastes dans les 30 minutes de l'ajout de la drogue dans le milieu.

Figure 2. 53BP1 ne pas former des foyers durant la mitose jusqu'à telophase/G1 dans les cellules HEK293.

Discussion

Maintien de l'intégrité génomique est essentielle à la survie cellulaire. Le défaut de préserver les résultats du génome dans le vieillissement prématuré, la carcinogenèse, ou la mort ^8. Il ya un intérêt intense pour discerner comment les fonctions de DDR, découlant de son importance à la recherche fondamentale et clinique. De nombreuses techniques ont été développées au fil des ans afin d'aider à l'étude de la façon dont les cellules détecter et réparer les dommages à l'ADN. Les méthodes traditionnelles comme immunocytochimie et western blot ont été les piliers du champ, bien que les récents progrès technologiques ont permis à des méthodes plus sophistiquées pour évoluer. Imagerie sur cellule vivante, comme indiqué dans ce protocole, nous permet d'étudier les caractéristiques de la DDR négligés par les techniques plus traditionnelles.

Au centre de l'utilisation de l'imagerie de cellules vivantes est la création de protéines marquées par fluorescence. Nous décrivons ici l'utilisation d'une protéine étiquetée mCherry impliqués dans le DDR, 53BP1, ainsi que d'une histone H2BGFP-produit de fusion. Protéines marquées par fluorescence sont largement utilisés en biologie moléculaire et cellulaire, mais ils ne sont pas sans limites. Fixation d'un nouvelle structure pour une protéine endogène crée le risque évident d'altérer la fonction naturelle. En outre, certaines constructions peuvent être et seront exprimés à des niveaux différents dans différentes lignées cellulaires, dans des conditions différentes. Nous avons observé les disparités de niveaux d'intensité fluorescente dans toutes les cellules génétiquement modifiées utilisées dans cette étude. Le 53BP1 construire utilisé dans ce protocole n'a pas la plupart des domaines fonctionnels, mais il conserve la capacité de se lier aux sites de dommages à l'ADN qui ne semblent pas nuire à la cellule ^2.

En outre, il est important de considérer la méthode de transfert de gènes. Dans ce protocole, nous avons utilisé deux méthodes: la transduction lentivirale et une transfection stable. Les cellules infectées par le lentivirus sont transduites de façon stable avec l'assemblage fluorescent;par conséquent, ils continuent d'exprimer ces protéines indéfiniment. Cependant, cette méthode est un peu plus de main-d'œuvre par rapport à la transfection et est dicté par le type de cellules sont la cible; certaines cellules ne se prêtent pas à une transfection efficace. D'autre part, les lentivirus sont capables de pénétrer la plupart des cellules, y compris les humains. Les chercheurs sont encouragés à mettre en balance les avantages et les inconvénients de chaque méthode quand il s'agit de leurs propres expériences. Comme un moyen possible de contourner les problèmes inhérents à protéines marquées par fluorescence, l'utilisation de cellules perméables aux sondes marquées par fluorescence ont été signalés récemment aux expériences sur des cellules vivantes ^10. Cependant, cette technique n'a pas encore été pleinement développé.

Un des principaux avantages de l'imagerie de cellules vivantes est la capacité d'étudier les relations spatio-temporelles de la DDR et de réparation des CDB. En effet, Dimitrova et al. (2008) ont pu observer marquées par fluorescence des cellules vivantes et de révéler romanformation concernant 53BP1 contraignante aux télomères et comment il affecte la dynamique de la chromatine. Cette analyse serait beaucoup plus difficile, mais pas impossible, avec d'autres méthodes. Avoir la capacité de surveiller le processus de DDR dans l'espace et le temps nous permet de discerner les fonctions et les relations que nous pourrions autrement négliger.

En résumé, en utilisant l'imagerie de cellules vivantes permet aux chercheurs de suivre la cinétique de formation de l'ORD et la résolution en temps réel, et permet une analyse quantitative à un niveau cellulaire unique. En plus de la technique utilisée dans cette étude, d'autres applications de l'imagerie de cellules vivantes peuvent être utilisés, tels que le FRET et FRAP ^3. La technologie d'observer les cellules en temps réel continuera à être amélioré et utilisé pour étudier une variété de processus cellulaires.

Materials

CellStar culture dishes	Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes	World Precision Instruments, Inc.
MEM media	GIBCO
Non-essential amino acids	GIBCO
Amino acids	GIBCO
Vitamins	GIBCO
Sodium Pyruvate	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;<br/> plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system	Zeiss
AxioVision (release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity software (version 6.0)	PerkinElmer