Использование химии Нажмите для оценки влияния вирусной инфекции на клетки-хозяина синтеза РНК

Summary

Этот метод описывает использование мыши химии для измерения изменений в принимающих транскрипции клетки после заражения лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12. Результаты могут быть визуализированы качественно с помощью флуоресцентной микроскопии или получают с количественным выходом путем проточной цитометрии. Этот способ можно приспособить для использования с другими вирусами.

Abstract

Многие вирусы РНК эволюционировали способность ингибировать транскрипцию клетку-хозяина, как средство, чтобы обойти сотовой оборону. Для изучения этих вирусов, поэтому важно, чтобы иметь быстрый и надежный способ измерения транскрипционной активности в инфицированных клетках. Традиционно транскрипции был измерен либо по включению радиоактивной нуклеозиды, такие как ³ H-уридина с последующим детектированием с помощью авторадиографии или сцинтилляционного счетчика или включение галогенированные аналоги уридина, такие как 5-bromouridine (BRU) с последующим детектированием с помощью иммунной окраски. Использование радиоактивных изотопов, однако, требует специального оборудования и не представляется возможным в ряде лабораторных условиях, в то время обнаружения BRU может быть громоздкими и могут страдать от низкой чувствительности.

Недавно разработанный мыши химии, который включает в себя медь катализируемой триазола образование из азида и алкина, теперь обеспечивает быстрое и Highlу чувствительных альтернативы этих двух методов. Нажмите химии является двухстадийным процессом, в котором возникающий РНК первый помечены путем включения уридина аналоговый 5-ethynyluridine (ЕС), с последующим детектированием этикетку с флуоресцентным азидом. Эти азиды доступны в нескольких различных флуорофоров, что обеспечивает широкий спектр возможностей для визуализации.

Этот протокол описывает метод измерения транскрипционные подавления в клетках, инфицированных лихорадкой Рифт-Валли Вирус (RVFV) штамма MP-12 с использованием клик химии. Одновременно экспрессии вирусных белков в этих клетках определяется классической внутриклеточный иммунной окраски. Шаги с 1 по 4 подробно метод визуализации транскрипционный подавление с помощью флуоресцентной микроскопии, а шаги с 5 по 8 подробно метод количественного транскрипционный подавление с помощью проточной цитометрии. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования с другими вирусами.

Introduction

Традиционно транскрипционную активность была измерена посредством включения или радиоактивный ⁽³ H-уридина) ^один или галогенированных (BRU) ² нуклеозидов в возникающий РНК. Эти аналоги уридина принимаются к клеткам, превращается в уридин-трифосфата (UTP) через нуклеозидов путь спасения, и впоследствии включено во вновь синтезированную РНК. ³ H-уридина может быть обнаружен с помощью авторадиографии, которые могут быть трудоемким или сцинтилляционного считая, что требует специального оборудования. Кроме того, использование радиоактивных изотопов не может быть практически в ряде лабораторных условиях, в том числе высокой сдерживания биобезопасности лабораторий. BRU могут быть обнаружены с помощью иммунных анти-BRU антител, которые могут потребовать суровых проницаемости для обеспечения доступа антитела к ядру или частичной денатурации РНК, а вторичной структуры РНК может быть стерических затруднений для связывания антител.

_content "> протокол, описанный здесь использует недавно разработанные нажмите химии ³ для измерения транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12. Нажмите химии опирается на высокой селективностью и эффективное меди (I), катализируемой реакции циклоприсоединения между алкина и азид фрагмент ^4,5. В этом протоколе, возникающий РНК в инфицированных клетках сначала помечены посредством включения уридина аналоговый ЕС. На втором этапе, объединенный ЕС обнаружены с помощью реакции с флуоресцентным азидом. Основным преимуществом этого метода являются (1), что она не требует использования радиоактивных изотопов и (2) что он не требует суровых проницаемости или денатурации РНК. с молекулярной массой менее 50 Da, доступ флуоресцентного азида не мешают недостаточный проницаемости или вторичной структуры РНК. Кроме того, исследователи не ограничены в своем выборе первичных антител при объединении обнаружения РНК с классомческих иммуноокрашивания для вирусных белков.

Две различные методы описаны в данном протоколе: один для визуализации с помощью транскрипции флуоресцентной микроскопии (шаги 1-4) и один для количественного транскрипция проточной цитометрии (шаги 5-8). Оба этих метода сочетают маркировки растущих РНК с внутриклеточным иммуногистохимическое вирусных белков, что обеспечивает корреляцию между транскрипционной активности и вирусной инфекции на ячейку за ячейкой основе.

Авторы успешно использовали протокол, описанный здесь, чтобы определить транскрипционной активности в клетках, инфицированных штаммом RVFV MP-12 ⁶ клеток, инфицированных различными MP-12 мутанты ^{7,8, 9} и клетки, инфицированные вирусом Toscana (TOSV) ^10. Протокол, описанный здесь, может быть легко адаптирован для использования с различными вирусами и имеет потенциал, чтобы быть модифицирован, чтобы включать иммунофлуоресценции окрашивание специфических вирусных или клеточных белков.

Protocol

Анализ транскрипции с помощью флуоресцентной микроскопии

1. Инфицировать клетки с MP-12 находятся в стадии становления и этикетка РНК с ЕС

1. Место 12-мм выстрел покровные в 12-луночных планшета для культуры ткани, один покровное на лунку.

Примечание: Если клетки имеют проблемы придерживаясь покровные, пальто с поли-L-лизин (М ≥ 70000) перед устанавливать в скважинах. С этой целью погрузить покровные в стерильном 0,1 мг / мл раствора в H _{2 O,} поли-L-лизин в течение 5 мин. Промыть покровные стерильной H ₂ O и воздушно-сухой в течение не менее 2 часов.

2. Для семян 293 клеток на покровных стеклах, добавляют 5 × 10 ⁴ клеток в 1 мл ростовой среды (DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина) на лунку. Инкубируют в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ O / N.
3. Infect клеток с MP-12 при множественности инфекции (MOI) 3. Включать не менее двух неинфицированных скважин: одна из двух скважин будет служить неинфицированных управления, другие будут относиться с актиномицином D (ActD) на шаге 1.5 в качестве контроля для транскрипционных подавления. Удалить ростовой среде и разбавить вирус штока так, что общий объем в каждую лунку добавляли 200 мл. Инкубировать в течение 1 часа во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.

Примечание: Вместо того, чтобы инфицировать клетки, клетки могут быть трансфицированы ДНК плазмиды или в пробирке синтезированных РНК, кодирующей специфический вирусный белок. С этой целью трансфекции клеток с соответствующим реагентом трансфекции химические в соответствии с инструкциями производителя и перейти к этапу 1,5 при 16 часов после трансфекции. Желательно, чтобы оптимизировать трансфекции условий и времени инкубации до РНК маркировки и фиксации.

4. Удалить посевной и добавить 1 мл свежей питательной среды на лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 15 час.

ove_content "> Примечание. Если адаптация этот протокол для использования с другим вирусом, то целесообразно выполнить эксперимент время курса для определения оптимального момента времени для РНК маркировки и фиксации Установка этого времени ход, так что инфекция раз в шахматном порядке, и все Образцы могут быть помечены, фиксировали и окрашивали в то же время.

5. В 15 ч после инфекции (HPI), замените питательную среду средой, содержащей 1 мМ ЕС. К одному из макета инфицированных скважин, а также добавить 5 мкг / мл ActD. Это будет служить контроль за транскрипционные подавления, как ActD ингибирует ДНК-зависимой РНК. Возврат клеток в инкубаторе.
6. В 16 HPI, удалите средних и мыть покровные один раз 1 мл PBS (KCl 0,20 г / л, KH ₂ PO ₄ 0,20 г / л, NaCl 8,00 г / л, Na ₂ НРО ₄ 1,15 г / л, рН 7,4) на лунку. Fix клетки добавлением 1 мл 4% параформальдегида (PFA) на лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.

Примечание: Чтобы подготовить 4% PFA в фиксирующем растворе, растворите 10 г параформальдегида в 150 мл H ₂ O нагревают до 60 ° С на нагретой магнитной мешалкой. Добавить 500 мкл 1 М NaOH и продолжаем движение, пока раствор не станет ясно. Фильтр PFA раствора через бумажный фильтр для удаления частиц и добавляют 62,5 мл фосфатного буфера (77 мМ NaH ₂ PO _4, 287 мМ Na ₂ HPO _4, рН 7,4). Добавить H ₂ O до общего объема 250 мл. Замораживание при -20 ° С в одноразовых аликвоты.

7. Мыть один раз с 1 мл PBS на лунку. Нет времени инкубации не требуется для этого и всех последующих этапов стирки. Немедленно приступить к шагу 2.

Примечание: Важно, чтобы немедленно перейти с щелчком реакции, РНК вырождается при хранении на этой стадии в течение длительных периодов времени; потерю сигнала флуоресценции РНК уже можно наблюдать, если клетки выдерживали в течение 1 ч при 4 ° C . Аналогичным образом, если вобразуя время эксперимента конечно, не забудьте этикетке, исправить, и пятна все образцы в то же время.

2. Нажмите Реакция на обнаружение меченой РНК

1. Проницаемыми клеток путем добавления 1 мл 0,2% Тритон Х-100 в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Примечание: Все растворы, используемые с шагом 2,1 до 2,3 должны быть нуклеаз.

2. Мытье три раза с помощью 1 мл PBS на лунку.
3. Удалить покровные с 12 лунками и передачи в влажной камере. Обложка каждого покровное с 50 - 100 мкл раствора окрашивания клик (100 мМ Трис рН 8,5, 1 мМ CuSO _4, 20 мкМ флуоресцентного азид [возбуждения / испускания максимальная: 590/617 нм], 100 мМ аскорбиновой кислоты) каждый. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: Чтобы собрать влажной камере, линия нижней части клеточной культуре или чашки Петри с диаметром 10 см с пластиковой пленкой парафина. Линия внутренней кромки диSH с влажными бумажными полотенцами. Поместите покровные на пластиковой пленкой парафина.

Примечание: Будьте осторожны, чтобы не позволить покровные высохнуть в течение этой или любой другой шаг в протоколе. Лучше всего, чтобы добавить окрашивание раствора в каждую покровным непосредственно после того, как он был помещен во влажной камере.

Обратите внимание: Подготовьте решение кнопкой окрашивания свежей непосредственно перед этим шагом. Маточные растворы 1,5 М трис, рН 8,5, 100 мМ CuSO ₄ и 500 мМ аскорбиновой кислоты можно хранить при температуре 4 ° С. Тем не менее, отказаться от любой акции раствора аскорбиновой кислоты, которая превратила желтый.

Примечание: убедитесь, что выбран флуорофором, который соответствует фильтрам на вашем флуоресцентного микроскопа.

4. Удалить из покровных влажной камере и место в свежем 12-луночный планшет и вымыть три раза с 1 мл PBS на лунку.

Примечание: Если не де-защиты вирусных белков желательно, покровные может быть установлен и отображаемого после этого шага (перейти к этапу 3.3).

3. Иммунофлуоресценция для выявления экспрессии вирусных белков

1. Добавляют 1 мл блокирующего буфера (3% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS) в каждую лунку и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте.
2. Удалить покровные с 12-луночный планшет, перевод на влажной камере и покрытие с 50 - 100 мкл первичного антитела (анти-RVFV, своего рода подарком д-ра RB Tesh, UTMB), разведенного в блокирующем буфере (1:500). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: При этом адаптация протоколов для использования с различными вирус, определить оптимальный для вашего разбавления первичных антител в первую очередь.

Примечание: В качестве альтернативы, этот шаг может быть выполнен O / N при 4 ° С в темноте.

3. Удалить из покровных влажной камере и место обратно в 12-луночный планшет и мытьтри раза с помощью 1 мл PBS на лунку.
4. Удалить покровные с 12-и места, места в влажной камере и накрыть 50 - 100 мкл вторичными антителами (анти-IgG мыши конъюгированные с флуоресцентным красителем [возбуждения / испускания максимальная: 495/519 нм]), разведенного в блокирующем буфере (1: 500). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: убедитесь, что выбран вторичные антитела, способные распознавать ваши первичного антитела и соответствует фильтрам на вашем флуоресцентного микроскопа.

Примечание: При желании, 200 нг / мл DAPI может быть добавлен к вторичным антителом разбавления для визуализации ядер.

5. Удалить из покровных влажной камере и место обратно в 12-луночный планшет и вымыть три раза с 1 мл PBS на лунку.
6. Установите покровные, поместив одну каплю (Калифорния. 15 мкл) Fluoromount-G на предметное стекло микроскопа. Погрузите в покровного H ₂ O, удалить избыток H ₂ O, касаясь йE Боковое против бумажным полотенцем и поместить камеру стороной вниз в каплю Fluoromount-G. Воздух сухой в течение 5 мин.

Примечание: Если изображение на инвертированный микроскоп, позволит Fluoromount-G затвердевать при 4 ° CO / N или прикрепить к покровные стекло микроскопа путем герметизации края с прозрачным лаком для ногтей.

Примечание: Слайды могут быть отображены немедленно или хранят при 4 ° С в темноте в течение до недели.

4. Приобретение данных

1. Изображение с использованием флуоресцентного микроскопа.

Примечание: Не забудьте выбрать соответствующие флуорофорам которые могут быть визуализированы с помощью микроскопа. Для справки, являются следующие флуорофорам и наборы фильтров используется для получения изображения показаны в настоящей публикации.

DAPI:
Фильтр возбуждения: BP 330 - 385
Двухцветные зеркала: DM 400
Эмиссионный фильтр: LP 420

Фильтр возбуждения: BP 460 - 490
Двухцветные зеркала: DM 505
Эмиссионный фильтр: LP 510

Флуорофора с возбуждением / максимум эмиссии 590/617:
Фильтр возбуждения: BP 545 - 580
Двухцветные зеркала: DM 600
Эмиссионный фильтр: LP 610

Анализ транскрипции с помощью проточной цитометрии

5. Инфицировать клетки с MP-12 находятся в стадии становления и этикетка РНК с ЕС

1. Семенной 293 клеток в 6-луночный культуральный планшет ткани в питательной среде (DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина). Инкубируют в увлажненном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2, пока клетки не достигли 80 - 100% сплошности.
2. Инфицировать клетки с MP-12 в МВД 3. Включите по крайней мере два неинфицированных скважин: одна из двух скважин будет служить в качестве неинфицированных управления, другие будут относиться с ActD на шаге5.4. Удалить ростовой среде и разбавить вирус штока так, что общий объем в каждую лунку добавляли 400 мкл. Инкубировать в течение 1 часа во влажном инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
3. Удалить посевной и добавить 2 мл свежей питательной среды на лунку. Инкубировать при 37 ° С в течение 12 час.

Примечание: Если этот протокол адаптации для использования с другим вирусом, рекомендуется выполнять время эксперимента курс для определения оптимального момента времени для маркировки и сбора урожая. Установка этого времени ход, так что инфекция раз в шахматном порядке, и все образцы могут быть помечены, собирали и окрашивали в то же время.

4. В 12 HPI, замените ростовой среды на среду, содержащую 0,5 мМ ЕС. К одному из макета инфицированных скважин, а также добавить 5 мкг / мл ActD. Это будет служить контроль за транскрипционные подавления, как ActD ингибирует ДНК-зависимой РНК. Возврат клеток в инкубаторе.
5. В 13 HPI, мыть клетки один раз остроумиемч PBS и урожай обработкой трипсином клетки. Мытье собранные клетки три раза PBS, содержащем 1 мМ EDTA (PBS-EDTA).

Примечание: В этой и последующих шагах, не центрифуги клетки быстрее, чем 500 - 1000 мкг, чтобы предотвратить клетки поломки. Центрифуга клетки в течение 1 - 2 мин до осадка.

Примечание: Если поверхность иммуноокрашивания планируется после щелчка реакции, урожай помощью полицейского резиновые или одноразовые скребком ячейки вместо этого.

6. Fix клетки путем ресуспендирования их в 1 мл 4% PFA и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Обратитесь к шагу 1.6 Инструкции о том, как подготовить 4% PFA.
7. Промывают один раз 1 мл PBS-EDTA на лунку. Немедленно приступить к шагу 6.

Примечание: Важно, чтобы немедленно перейти с щелчком реакции, РНК вырождается при хранении на этой стадии в течение длительных периодов времени. Аналогичным образом, если выполнение временной СМедведица эксперимент, обязательно маркировать, исправить и запятнал все образцы в то же время.

6. Нажмите Реакция на обнаружение меченой РНК

1. Проницаемыми клетки путем ресуспендирования в 0,5 мл 0,2% Тритон Х-100 в PBS. Инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре.

Примечание: Все растворы, используемые с шагом 6,1 до 6,3 должны быть нуклеаз.

Примечание: если клетки не должным образом осадок на этом этапе, увеличивают время центрифугирования до 5 мин. Осаждение улучшится как только клетки суспендируют в FACS буфере (шаг 6.4).

2. Мыть один раз с 1 мл PBS.

Примечание: Не использовать ЭДТА на этом этапе, так как это хелат Cu ^{2 +} ионы необходимы для мыши реакции.

3. Ресуспендируют клеток в 200 мкл красящий раствор клик (100 мМ Трис рН 8,5, 1 мМ CuSO _4, 200 нМ азид помечены флуоресцентным красителем [отлканализационным / максимум излучения: 650/665 нм], 100 мМ аскорбиновой кислоты). Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Обратите внимание: Подготовьте решение кнопкой окрашивания свежей непосредственно перед этим шагом. Маточные растворы 1,5 М трис, рН 8,5, 100 мМ CuSO ₄ и 500 мМ аскорбиновой кислоты можно хранить при температуре 4 ° С. Тем не менее, отказаться от любой акции раствора аскорбиновой кислоты, которая превратила желтый.

Примечание: Если клетки слипаются во время этого шага, ресуспендируйте с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз.

Примечание: убедитесь, что выбран флуорофором, которые могут быть обнаружены с помощью вашего проточной цитометрии.

Примечание: Также подготовить один образец инфицированных клеток, которые не подвергались процедуре окрашивания мыши, эти будут необходимы для калибровки проточного цитометра. Либо использовать половины инфицированных клеток или включить дополнительный инфицированы также на шаге 5.2. Эти конуправления клетки будут иммуноокрашиванию на шаге 7.1.

4. Мытье дважды FACS-буфером (PBS, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5% (вес / объем) БСА).

Примечание: Если иммунной вирусных белков не требуется, клетки могут быть проанализированы немедленно (перейти к шагу 8).

7. Иммунофлуоресценция для выявления экспрессии вирусных белков

1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл первичного антитела (анти-RVFV), разведенного в FACS буфере (1:10000) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.

Примечание: В качестве альтернативы, этот шаг может быть выполнен O / N при 4 ° С в темноте.

Примечание: Также подготовить один образец неинфицированных клетках, которые были подвергнуты процедуре окрашивания мыши, но не будет иммуноокрашиванию, они будут необходимы для калибровки проточного цитометра. Либо использовать половину макет инфицированные клетки или включать дополнительные скважины на неинфицированныхШаг 5.2.

Примечание: При этом адаптация протоколов для использования с различными вирус, определить оптимальный для вашего разбавления первичных антител в первую очередь.

2. Вымойте клетки дважды в буфере FACS.
3. Ресуспендируют клеток в 200 мкл вторичного антитела (анти-мышь IgG, конъюгированные с флуоресцентным красителем [возбуждение / максимума излучения: 495/519 нм]), разведенного в FACS буфере (1:1000) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте.
4. Вымойте клетки раз в буфере FACS.

Примечание: В этой точке клетки могут храниться O / N при 4 ° С в темноте.

8. Приобретение данных

1. Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера FACS, передача в 5 мл пробирки полистирола и анализировать с использованием проточного цитометра. Используйте MP-12 инфицированных клетках (без щелчка реакции, анти-RVFV окрашивание только) и макет инфицированных клеток (нажмите реакцию только) для калибровки прибора.

НеE: Не забудьте выбрать соответствующую флуорофорам, которые могут быть обнаружены с помощью вашего инструмента. Для справки, являются следующие лазерных линий и наборы фильтров используется для получения данных, приведенных в этой публикации.

Флуорофора с возбуждением / спектра излучения 495/519:
Лазер: 488 нм
Фильтр: 530/30

Флуорофора с возбуждением / спектра излучения 650/665:
Лазер: 640 нм
Фильтр: 670/20

Representative Results

АПЛ белка RVFV (Bunyaviridae семьи, род Phlebovirus) ¹¹ ингибирует клетки-хозяина общей транскрипции с помощью двух различных механизмов: (I) за счет связывания p44 субъединицы базального транскрипционного фактора TFIIH ¹¹ и (II) путем содействия протеосомную деградации p62 субъединицы TFIIH ^6. RVFV MP-12 вакцинного штамма ¹³ был использован для экспериментов, описанных в этом протоколе, так как MP-12, штамм могут быть обработаны в уровне биобезопасности лабораторий и 2 исключено из правил выбора агента в США, которая относится и к другим диким введите RVFV штаммов. АПЛ белка МП-12, штамм является полностью функциональной и сохраняет способность подавлять транскрипцию хозяина ^6. Вирус rMP12-C13type, который осуществляет удаление охватывающий 69% от гена НЗ ^14, был включен в качестве контрольного вируса отсутствуют все АПЛ функций, включая способность подавлять транскрипцию клетки-хозяина.

На рисунке 1 показаны изображения, полученные с помощью флуоресцентной микроскопии. В макет инфицированные клетки (рис. 1а-1D), ядрышки появляются ярко-красные из-за продолжающегося транскрипции. Так как клетки были только меченные ЕС в течение 1 часа, с последующим немедленным фиксации, наиболее РНК остаются в ядре. В противоположность этому, когда клетки были обработаны ActD фармакологически ингибировать транскрипцию (рис. 1e-1h), красная флуоресценция ядер заметно снижается. Это флуоресценции аналогично уменьшается, когда клетки инфицируют MP-12 (рис. 1n-1q), но не с АПЛ мутантом с делецией rMP12-C13type (рис. 1i-1 м). Фиг.2 также показывает изображений, полученных с помощью флуоресцентной микроскопии, но здесь клетки были трансфицированы в пробирке синтезированных мРНК вместо инфекции с живым вирусом. Когда клетки были трансфицированы мРНК, кодирующей GFP (фиг. 2г-2i), никаких изменений в трансcriptional активностью по сравнению с нетрансфицированных клеток (фиг.2а-2с), а визуализировали с помощью красной флуоресценции в ядрах, могут быть обнаружены. Только трансфекции с мРНК, кодирующей RVFV АПЛ фактор вирулентности (рис. 2k-2 м) приводит к снижению красной флуоресценции.

Фиг.3А изображает количественные данные, полученные с помощью проточной цитометрии. Данные представлены в виде графиков рассеяния с флуоресцентный сигнал для включения в ЕС возникающий РНК нанесены на оси ординат, а для анти-RVFV окрашивание нанесены на оси абсцисс. Квадрант ворота были установлены так, что большинство макет инфицированных клеток была расположена в верхнем левом квадранте, большинство обработанных клеток ActD было расположено в нижнем левом секторе, причем большинство из инфицированных клеток расположены в правой половине участка . Когда клетки были инфицированы MP-12, 81,5% от общего числа клеток или 93% анти-RVFV положительных клеток, показали, уменьшить транскрипционной активности. В противоположность этому, Wheн клетки были инфицированы rMP12-C13type, 91,6% от общего числа клеток или 97% анти-RVFV положительных клеток, показали транскрипционной активности, которая была сравнима с макет инфицированных клеток. фиг.3В изображены те же данные, 3А в форме гистограммы для флуоресцентной маркировки РНК с ЕС регистрации.

Рисунок 1. Флуоресцентная микроскопия клеток, инфицированных MP-12 и rMP12-C13type. 293 клетки были инфицированы макет или инфицированных либо MP-12 или НЗ мутантом с делецией RMP-12-C13type. Между 15 и 16 HPI, клетки метили с помощью 1 мМ ЕС. В качестве контроля для транскрипционной подавление, макет инфицированные клетки обрабатывали 5 мг / мл ActD одновременно с обработкой ЕС. Ядра визуализировали путем окрашивания DAPI (синий), экспрессию вирусных белков визуализировали путем окрашивания анти-RVFV антител (зеленый), и РНК визуализироватьD обнаружением объединенной ЕС с азид помечены флуоресцентным красителем (возбуждение / излучение максимум: 590/617 нм) (красный).

Рисунок 2. Флуоресцентная микроскопия клеток, трансфицированных в пробирке синтезированных РНК либо GFP или MP-12 НЗ. 293 клетки были трансфицированы макет или трансфицировали в пробирке синтезированных РНК, кодирующих либо GFP или MP-12 НЗ. Между 15 и 16 часах после трансфекции, клетки метили с помощью 1 мМ ЕС. В качестве контроля для транскрипционной подавление, макет трансфицированные клетки обрабатывают 5 мг / мл ActD одновременно с обработкой ЕС. Экспрессия GFP визуализируют окрашиванием с анти-GFP антитела (ги), выражение НЗ визуализируют окрашиванием анти-RVFV антитела (аф, км), а затем против мышиных IgG, конъюгированные с флуоресцентным красителем (возбуждение / излучение Maximuм: 495/519 нм) (зеленый), и РНК визуализируется обнаружения объединенного ЕС с азид помечены флуоресцентным красителем (возбуждение / максимум излучения: 590/617 нм) (красный).

Рисунок 3. (A) проточной цитометрии анализ клеток, инфицированных MP-12 или rMP12-C13type. Клетки были инфицированы макет заражению, или зараженным или MP-12 или rMP12-C13type. Между 12 и 13 HPI, клетки метили 0,5 мМ ЕС. В качестве контроля для транскрипционной подавление, макет трансфицированные клетки обрабатывают 5 мкг / мл ActD одновременно с обработкой ЕС. Экспрессия вирусных белков визуализировали путем окрашивания анти-антител RVFV последующим вторичным антитела, меченного флуоресцентным красителем (возбуждение / максимума излучения: 495/519 нм) (анти-RVFV) и РНК визуализируется обнаружения объединенного ЕС с азидом помечены флуоресцентным красителем (возбуждение / максимум излучения: 650/665 нм) (РНК). DATпредставляется в виде точечного графика. (B) представление того же данные, приведенные в виде гистограммы. Интенсивность флуоресценции для включения ЕС откладывается по оси абсцисс, клеток отложены по оси ординат. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Discussion

Предоставляется протокол описывает метод для оценки влияния вирусной инфекции на хост транскрипции клетки через включение уридином аналоговых ЕС в зарождающейся РНК. Этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими способами: это быстрый, чувствительный, и он не опирается на использовании радиоактивных изотопов. Кроме того, способ может быть адаптирован для получения качественных данных посредством флуоресцентной микроскопии или количественных данных с помощью проточной цитометрии с использованием по существу тех же самых реагентов. В сочетании с иммунофлуоресценции окрашивание на вирусные антигены, этот метод также позволяет исследователю дифференцировать инфицированных из неинфицированных клеток.

Важно отметить, что этот метод также помечает вновь синтезированную вирусную РНК с такой же скоростью, как это маркирует множество транскриптов, недостаток, который используется совместно с другими способами, основанными на ³ Н-уридина или BRU регистрации. По крайней мере, в случае RVFV MP-12 инфекции, однако, мы обнаружили, что АМОUNT принимающих транскриптов намного превышает количество вирусных транскриптов, и, следовательно, влияние вирусной РНК в тотальной РНК измеряли этого анализа можно пренебречь. При адаптации этот протокол для использования с другим вирусом, исследователи могут пожелать определить вирусную стенограммы либо через их локализации, с помощью лечения инфицированных клеток с ActD, или хотя-флуоресцентной гибридизации (FISH) ^15. Если вирус реплицируется в цитоплазме, такие как MP-12, то вирусной РНК можно легко отличить от клеточной РНК, который все еще содержал главным образом в ядре через 1 ч маркировки. Инфицированные клетки также можно лечить с ActD для подавления транскрипции клетки-хозяина, оставляя синтез вирусной РНК неизменным. ActD функции путем связывания с двухцепочечной ДНК ^16, и поэтому только ингибирует ДНК-зависимую транскрипцию, но не имеет никакого эффекта на вирусную РНК-зависимой РНК-полимеразы.

При выполнении настоящего Протокола, оно имеет решающее значение, чтобы избежатьзагрязнения нуклеаз между проницаемости и реакцию мыши маркировки, как ЕС меченой РНК остается чувствительным к деградации РНКазы ^3. Кроме того, исследователи должны немедленно перейти к реакции маркировки мыши, а длительные периоды инкубации между фиксацией и нажмите маркировки реакции, даже при 4 ° С, приводит к деградации РНК и в конечном итоге привести к потере сигнала РНК флуоресценции. Это имеет особое значение при выполнении временных конечно экспериментов, исследователи должны проектировать свои эксперименты так, чтобы все клетки могут быть помечены, фиксировали и окрашивали в то же время. К счастью, сигнал флуоресценции РНК остается стабильным после реакции маркировки мыши, так что протокол может быть легко остановлен после этого шага.

Наконец, исследователи должны иметь в виду, что цитопатического эффекта (CPE), вызванных многими вирусами отрицательно сказывается на клеточный синтез РНК даже в отсутствие каких-либо конкретных транскрипционный подавления. ЭтоПоэтому важно, чтобы измерить транскрипционной активности на после заражения, когда клетки все еще жизнеспособными. Если вирус-мутант, доступный, который испытывает недостаток в способности подавлять транскрипцию, например, RMP-12-C13type (рис. 1 и 3), это может быть отличным инструментом для определения оптимального момента времени для измерения транскрипции.

При планировании большого числа экспериментов, исследователи могли бы рассмотреть прямой маркировки их первичных антител с флуорохромом ^17, тем самым устраняя необходимость вторичного антитела и сокращения времени, необходимого для определения вирусных антигенов.

Таким образом, этот протокол обеспечивает быстрый и надежный способ измерить влияние вирусной инфекции на хосте транскрипции клетки. Это может быть легко адаптирован для использования с различными вирусами и имеет потенциал быть изменены, чтобы включить immunostainings для специфических вирусных или клеточных белков.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-ethynyl-uridine	Berry Associates	PY 7563	dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips	Fisherbrand	12-545-82
5 ml polystyrene tubes	BD Biosciences	352058
Actinomycin D (ActD)	Sigma	9415	dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI	Sigma	D-9542	dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled)	Invitrogen	A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-ascorbic acid	Sigma	A-5960	dissolve in H2O for 500 mM
paper filter	VWRbrand	28333-087
paraformaldehyde	Sigma	158127
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200056
Fluorescence Microscope			e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer			e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa