Introduction
سرطان الرئة هو السبب الرئيسي لوفيات السرطان في جميع أنحاء العالم 1. بحث في الوقاية والكشف المبكر، والعلاج من سرطان الرئة مستمر في العديد من مراكز البحوث في جميع أنحاء العالم 2،3. وقد وضعت عدة نماذج حيوانية لسرطان الرئة، وأنها قد أثبتت فائدتها في دراسة آليات التسرطن الرئة وخلايا المنشأ، في تحديد وجود الخلايا الجذعية السرطانية، وفي دراسة مختلف استراتيجيات علاجية جديدة 4. اعتمدت النماذج السابقة على الناجمة عن مادة مسرطنة بدء الورم في سلالات حساسة من الفئران 5. تطوير خروج المغلوب ونماذج الماوس المعدلة وراثيا التي ينشأ سرطان الرئة نتيجة للآفات وراثية التلاعب على وجه التحديد قد تحسنت إلى حد كبير قدرتنا على التحكم في الحث ورم والعديد من الجوانب تقليد من سرطان الرئة البشرية 4. ومع ذلك، تحديا كبيرا في استخدام نماذج حيوانية سرطان الرئة هو عدم وجود طريقة في الوقت الحقيقي لتحديد بدقة ومراقبة ظهور ونمو الاورام في الرئتين الماوس وتوثيق أي تغيير لاحق في أحجامها، مثل النمو المستمر أو انخفاض في استجابة للعلاجات. وقد اضطر هذا الباحثون إلى اللجوء إلى الوقت عدة والجهد وتقنيات تستهلك الموارد لتحديد الأورام وتقييم نتائجها التجريبية. وجود الأصيل الاختلاف بين الماوس في استجابة لتحريض الورم يتطلب استخدام أعداد كبيرة من الحيوانات في كل مجموعة التجريبية للحد من تقلب البيانات. عدم القدرة على تقييم نمو الورم أو الاستجابة للعلاج في الوقت الحقيقي أجبر الباحثون إلى الموت ببطء عمياء الفئران في عدة مرات نقاط في البروتوكولات التجريبية لفترات طويلة لضمان أنهم سوف يقومون بجمع البيانات الصحيحة، مما أدى إلى إهدار الموارد من العينات تم جمعها في نقطة زمنية التي إما أن تكون في وقت مبكر جدا أو متأخرا جدا.
في هذه الدراسة، وهي طريقة لاستغلال صغيرة والحيوان الصغير جالتصوير المقطعي omputed (الدقيقة CT) الماسح الضوئي للكشف والمتابعة أورام الرئة في وأدخلت الفئران الحية. استخدمنا لدينا وصف مؤخرا Sftpc-rtTA وتري-Fgf9-IRES-EGFP انقر نقرا مزدوجا المعدلة وراثيا (DT) الفئران التي تتطور بسرعة السرطان الرئوي بعد الاستقراء مع الدوكسيسيكلين 6،7. استخدام الدقيقة CT تمكننا من (من بين أمور أخرى) استبعاد الفئران مع تشوهات الرئة الشاذة قبل الاستقراء، وتأكيد تطور العقيدات ورم في الرئة بعد تحريض، ومراقبة التغيرات في العقيدات ورم في الاستجابة للعلاجات تجريبية. واكد نقطة النهاية القتل الرحيم من الفئران والتقييم النسيجي دقة التقييم في الوقت الحقيقي التي أجريت مع-CT الجزئي. ونحن نعتقد أن هذه التقنية سوف يمهد الطريق لإجراء التجارب المخطط لها بشكل أفضل باستخدام نماذج سرطان الرئة الحيوانية مع توفير الموارد القيمة، وتقصير وقت رصد وزيادة دقة وفهم النتائج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة التجارب على الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة كيو.
ملاحظة: في هذه الدراسة، استخدمنا Sftpc-rtTA والفئران تري-Fgf9-IRES-EGFP DT التي السرطان الرئوي يتطور بسرعة بعد تحريض من خلال إطعام طعام تحتوي على الدوكسيسيكلين 6،7. ومع ذلك، يمكن تطبيق جميع إجراءات التقييم لنماذج سرطان الرئة الماوس الأخرى.
1. تجربة الخطوط العريضة:
- تحديد وضع الرئتين في الأساس:
- قبل التعريفي الورم، وعندما الفئران DT هي 8-12 أسابيع من العمر، إجراء أول مسح CT-الصغير (انظر الفقرتين 2 و 3 أدناه). وهذا بمثابة مسح خط الأساس الرئة، يؤكد عدم وجود عقيدات وضعت بشكل عفوي الناجمة عن التحوير المتسرب، وتوثيق حالة عدم وجود أي أمراض الرئة الموجودة قبل الاستقراء الورم.
- بدء الورم الاستقراء:
- تبديل الفئران DT من الفصل العاديآه لطعام الدوكسيسيكلين للحث الخلايا الليفية عامل النمو (جمعية جيل المستقبل) 9 التعبير في الخلايا السنخية وبدء نمو الورم. إعطاء طعام الدوكسيسيكلين (200 جزء في المليون) الإرضاع بحسب الرغبة.
- تأكيد تطوير العقيدات ورم في الرئتين الفأر:
- إجراء فحص CT-الجزئي للتعرف على تطوير العقيدات الورم مقارنة مع الفحص قبل الاستقراء.
- تقييم الاستجابة للعلاج:
- لاختبار قدرة الدقيقة CT للكشف عن تغيرات في العقيدات ورم في الاستجابة للعلاج وإدارة جمعية جيل المستقبل مستقبلات (FGFR) المانع AZD4547، ثم القيام بمسح إضافية الدقيقة CT بعد 5 و 10 أسبوعا.
- تقييم نقطة النهاية:
- الموت ببطء كل علاجها ومكافحتها الفئران والأنسجة عملية التقييم النسيجي (انظر القسم 6 أدناه).
2. الفئران الاستعداد للمايكرو-CT الحصول على الصور:
- تشغيل الماسحة الضوئية الصغيرة المقطعية وجهاز الكمبيوتر.
- أنقرك على البرنامج المسمى "R_m CT2"، ثم انقر على "الاحماء".
- إزالة السرير عينة عليها سيتم وضع الماوس من الغرفة الصغيرة-CT. التفاف السرير مع غلاف بلاستيكي.
- تعيين مربع تحريض التخدير عن طريق إضافة الأيزوفلورين إلى المرذاذ التخدير يصل إلى مستوى ملحوظ. ضبط معدل تدفق الأيزوفلورين في 3 لتر / دقيقة.
- فتح خزان الأكسجين لبدء تدفق الأكسجين داخل منطقة الجزاء تحريض وتعيين معدل التدفق في 1 لتر / دقيقة.
- ضع الماوس في مربع التخدير تحريض وتأكيد أن يتم تخدير بعمق بسبب عدم وجود حركة عفوية وردا على قرصة الجلد (قرصة لطيف من حظيرة صغيرة من الجلد، والتي لا تسبب تلف الأنسجة أو كسر الجلد).
- تطبيق مواد التشحيم العين لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير.
- فتح الغرفة الصغيرة المقطعية ووضع الماوس مع الجانب الظهري على السرير العينة. عقد رئيس الماوس وسحب الجسم إلى الأسفل من الأطراف السفلية في أورديr لتمتد وتصويب الجسم بشكل متناظر.
- إيقاف تدفق التخدير إلى مربع الاستقراء وتشغيله نحو الأنبوب الذي يصل إلى الغرفة الصغيرة-CT.
- وضع أنبوب التخدير في الأنف الماوس، لإدارة مخدر المستمر.
- من أجل إصلاح الماوس في الموقف. التفاف الماوس والسرير عينة مع غلاف بلاستيكي.
ملاحظة: من المهم جدا للحفاظ على الماوس تحت التخدير العميق وملفوفة على السرير عينة لأن أي حركة بسيطة أو تطور من جسمها أثناء الفحص سيؤدي في الصور ضبابية وصعوبة في التفسير. - إغلاق الغرفة الصغيرة-CT.
- ضبط نظام الصغرى CT إلى 90 كيلو فولت و 160 أمبير ووقت الفحص إلى 4.5 دقيقة. تعيين نطاق الصورة ل24 × 19 ملم وحجم فوكسل إلى 50 × 50 × 50 ميكرون. استخدام وضع متزامن لدقات القلب.
- إنشاء مجلد جديد في "قاعدة البيانات" من أجل حفظ الصور الجديدة في هذا المجلد.
- بدء المسح الضوئي.
- بعد الانتهاء من الفحص، تحريك الماوس إلى قفص فارغ والالتزام به حتى يستعيد وعيه. عدم وضعه مع الفئران الأخرى حتى أنه قد تعافى تماما من آثار التخدير.
3. قبل الاستقراء مايكرو-CT التصور صورة والتحليل:
- لتصور الصور الصغيرة CT، تحميل برنامج ImageJ مجانا من الموقع التالي: http://imagej.nih.gov/ij/ . ملاحظة: كل-CT الجزئي ملف البيانات هو كومة من حوالي 500 الملفات TIF (. TIF). ويمكن أيضا غيرها من البرامج مشاهدة الصورة يمكن استخدامها.
- فتح الدقيقة CT-الملفات التسلسلية الصور والتمرير من خلال جميع الصور من كل فأر من الرقبة إلى البطن أو العكس بالعكس.
- عن طريق المسح الضوئي من السذاجة الفئران من النوع البري، وتحديد كثافة من المجالات المختلفة والهياكل التشريحية الطبيعية في صدره على أساس معرفة تشريح الفأر (انظر الشكل 1A).
- عقد المؤشر معفأرة الكمبيوتر وانتقل لأعلى، بدءا من أحشاء البطن بيضاء والحجاب الحاجز، عن طريق الصدر وحتى الرقبة.
- تعرف على معالمها قفص الصدر العظمية (القص في الجبهة، فقرات في الظهر والأضلاع على الجانبين).
- التعرف على القلب في الجزء الأمامي من الصدر والأوعية الدموية الرئيسية بالقرب من القلب والمنصف.
- مراقبة تجويف القصبة الهوائية (على شكل دائرة صغيرة مظلمة على مستوى الرقبة وأعلى الصدر)، التي bifurcates إلى الحق والشعب الهوائية الرئيسية اليسار ثم يواصل فرع في أصغر فأصغر. لاحظ أن كل القصبات الهوائية يرتبط بشكل وثيق مع اثنين أو ثلاثة الأوعية الدموية (الشكل 1A).
- بدء فحص بالاشعة من الفئران DT الناجم عن الامم المتحدة وتحديد وجود أي شذوذ.
- استبعاد الفئران مع الظلال غير طبيعية قبل الاستقراء الرئة (على سبيل المثال، العقيدات، الفقاعات النفاخي، وما إلى ذلك) من أي تجارب أخرى. (الشكل 1C-E، G، H
4. ورم الاستقراء:
- للحث على نمو الورم في فئران التجارب التي أظهرت مسح رئة طبيعية، والتبديل طعامهم من طعام منتظمة للطعام تحتوي على الدوكسيسيكلين (200 جزء في المليون).
5. مسح المتابعة:
- بعد 10 أسابيع، إجراء فحص الدقيقة CT الثاني من كل الفئران لتأكيد تطور العقيدات ورم في الرئتين (انظر الشكل 2).
- تقسيم الفئران إلى مجموعتين. إدارة AZD4547 FGFR مانع (125 ميكروغرام / كغ / يوم عن طريق أنبوب المعدة لمدة 6 أيام / الأسبوع لمدة 10 أسبوعا) لمجموعة واحدة وهمي لمجموعة التحكم الأخرى لمدة 10 اسابيع اخرى.
- متابعة التغييرات في الظل عقيدية عن طريق إجراء مسح الثالث 4 - بعد 5 أسابيع.
- في نهاية 10 أسبوعا من العلاج، إجراء فحص الرابع.
- الموت ببطء كل الفئران مع CO 2 الاستنشاق أو مع حقن داخل الصفاق من 0.1 ملغ / 200 ميكرولتر من بنتوباربيتال.
- إلىالتعرف على التغيرات الديناميكية في العقيدات الورم بعد الاستقراء وفي الاستجابة للعلاج، وتحديد مواقف مماثلة في مسح الصور المتسلسلة لنفس الماوس على اثنين أو أكثر من مختلف نقاط الوقت ثم تحقق من ظهور / اختفاء أي الظلال غير طبيعية (الشكل 3 ).
- لتسهيل التعرف على نفس الطائرة في نفس الماوس على مختلف الوقت نقاط، في محاولة لربط الطائرة في المصالح مع الهياكل معلما التشريحية داخل الصدر الماوس.
- استخدام المعالم مثل القصبة الهوائية والتشعب لها، والحق والشعب الهوائية الرئيسية اليسار، الشريان الأورطي، والحجاب الحاجز، والأوعية الدموية الكبيرة.
ملاحظة: عظام الصدر، بما في ذلك الصدرية، الأضلاع، والقص أقل مفيدة كما المعالم المواقع بسبب يميل الثانوية المشتركة في محاذاة الجسم الماوس على السرير العينة، مما يزيد من إمكانية سوء تفسير للموقف المسح الضوئي. وبالمثل، فإن الرقم التسلسلي صورة داخل ملف المسح الضوئي لا يمكن الاعتماد عليها لidentifyinز نفس الموقف مع مرور الوقت بسبب التغيير في الماوس طول الجسم من نقطة مرة واحدة إلى أخرى. قد فشل أو عدم دقة في التعرف على نفس الطائرة في نقاط زمنية مختلفة يؤدي كاذبة / التفسير السلبي الإيجابي للنتائج.
- استخدام المعالم مثل القصبة الهوائية والتشعب لها، والحق والشعب الهوائية الرئيسية اليسار، الشريان الأورطي، والحجاب الحاجز، والأوعية الدموية الكبيرة.
6. ماوس القتل الرحيم ومجموعة الرئة:
- الموت ببطء الفئران مع CO 2 الاستنشاق أو مع حقن داخل الصفاق من 0.1 ملغ / 200 ميكرولتر من بنتوباربيتال.
- فضح أحشاء البطن عن طريق قطع طوليا من خلال جدار البطن. تنزف الماوس لتقليل حجم الدم في الرئتين عن طريق تشريح الشريان الأورطي البطني.
- شق الحجاب الحاجز مع مقص غرامة. هذا سوف يؤدي إلى فقدان الضغط السلبي من تجويف الصدر، وبالتالي انهيار الرئتين. فضح الرئتين والقلب عن طريق خفض وإزالة أجزاء من أضلاع جدار الصدر الأمامي. تنظيف الجزء الأمامي من الرقبة عن طريق قطع أنسجة الجلد وناعمة لفضح القصبة الهوائيةا.
- قطع القلب والغدة الصعترية. إدراج ملقط وراء القصبة الهوائية لفصلها من المريء.
- يقني؛ يدخل القنية القصبة الهوائية مع قنية G24 ثم ثبته في مكانه من خلال تشديد خيط حول الجزء المدرج.
- تضخيم وإصلاح الرئة باستخدام الثلج الباردة بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) من خلال قنية القصبة الهوائية باستخدام عمود 25 سم. فصل قنية وتشديد موضوع لمنع تسرب PFA ثم قطع القصبة الهوائية العليا من حرصه على الحنجرة.
- سحب القصبة الهوائية من خيوط الجروح وتشريح من التعلق بها، ومواصلة الهبوط لإزالته مع الرئة أون بلوك. أدخله في أنبوب 15 مل تحتوي على 5 مل من 4٪ PFA. ترك الرئتين في PFA O / N لضمان اختراق الأنسجة الكامل والتثبيت، ثم معالجة الأنسجة في كتلة البارافين العادي 8.
- قطع كتل البارافين إلى 6 شرائح أم سميكة على مشراح وصمة عار مع الهيماتوكسيلين ويوزين باستخدام التقنيات القياسية. 7. النسيجي التقييم:
- تشغيل أداة الماسح الضوئي الشرائح وجهاز الكمبيوتر.
- انقر على برنامج "مسح الحزب الوطني الديمقراطي".
- حدد وضع المسح الضوئي "دفعة من الشرائح" و "شبه تلقائي الوضع" لمسح سلسلة من الشرائح.
ملاحظة: الذراع الروبوتية التي تلتقط الشرائح خلال المسح المتتابع حساس جدا لأي مخالفات على حواف الشرائح الزجاجية. - جس حواف كل الشرائح الزجاجية قبل تحميلها في الجهاز. إذا كان هناك أي نتوء من الزجاج غطاء أو المجففة المتوسطة المتزايدة، وتنظيف تشغيله مع القاطع أو مشرط.
- تحميل الشرائح في الكاسيت الشريحة. فتح فتحة العينة، وحرك الكاسيت في موقف "واحد"،. أغلق الباب.
- على برامج الكمبيوتر، وإعطاء أسماء وصفية قصيرة لجميع الشرائح في الموقف المقابل في الكاسيت ثم انقر على زر "موافق".
- تحديد وضع الملف الشخصي: "Brightfield".
- انقر على "دفعة ابدأ" لبدء المسح المؤقت.
ملاحظة: بمجرد الانتهاء من آلة مسح كافة الشرائح، يقوم البرنامج تلقائيا الكشف عن المناطق ذات الأنسجة على كافة الشرائح وتشير بأنها المنطقة من اهتمام. - إذا لزم الأمر، إعادة تعريف المنطقة ذات الاهتمام طريق الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر وسحب الحدود المنطقة.
ملاحظة: تحديد مناطق واسعة بشكل مفرط من الشرائح مثل المناطق ذات الاهتمام سيؤدي في وقت المسح وقتا أطول. - مرة واحدة راض عن مناطق المصالح على كافة الشرائح، انقر على "مسح" لبدء مسح كافة الشرائح.
ملاحظة: الملفات الممسوحة ضوئيا يمكن ملاحظة رقميا في القرار المنخفضة والعالية، ويمكن تصديرها الصور كما JPEGالملفات.
ملاحظة: على الرغم من أن يوصف استخدام الماسحة الضوئية "شريحة" لتقييم النسيجي الرقمي هنا، واستخدام المجاهر العادية والتقييم النسيجي البصري لتقييم هو ممكن أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء تحديد الفئران مع تشوهات الرئة في الأساس. قبل التعريفي الورم، عندما كانت الفئران DT 8-12 أسابيع من العمر، تم مسحها ضوئيا الرئتين من كل الفئران مع الصغير-CT. والمثير للدهشة، وأظهرت ما يقرب من 50٪ من الفئران التشوهات التي أجبرنا على تراها يجعلها غير صالحة لإدراجها في دراسة لاحقة. وكانت هذه التشوهات التي تشبه العقيدات الظلال، واحدة كبيرة أو عدة الفقاعات النفاخي الصغيرة و / أو انخماص فصي (الشكل 1A، C، DE، GH). ثم، كان التحوير FGF9 وورم تحريض activated.Only الفئران أظهرت أن يمسح رئة طبيعية (بدون تشوهات) تم تحويل من طعام منتظمة للطعام الدوكسيسيكلين للحث على التعبير FGF9 في الخلايا السنخية والتنمية ورم لاحقة. لتأكيد تطور العقيدات ورم في الرئتين الماوس بعد عشرة أسابيع من بدء تحريض الورم، ومتابعة بالاشعة الدقيقة CT أجريت. وكشف هؤلاء د evelopment العقيدات متعددة الأحجام المتغيرة في كل الفئران (الشكل 2، مقارنة ألف إلى باء ودال لE). تم تنفيذ مسح مايكرو-CT لتقييم الاستجابة للعلاج. هذه وكشف أن الفئران التي كانت تدار من AZD4547 FGFR المانع لمدة 10 أسابيع عرضت بالفعل اختفاء أو انخفاض في حجم العقيدات التي كانت واضحة في المسح ما قبل العلاج (الشكل 3، مقارنة ما قبل وما بعد الاستقراء والمعالجات اللاحقة، AC ، EG وايك). من ناحية أخرى، السيطرة على الفئران التي لم تعط المانع FGFR وأعطيت العلاج الوهمي بدلا أظهر أي تغيير، وزيادة في حجم العقيدات وظهور عقيدات جديدة (الشكل 3، MO)؛ مؤكدا أن الانخفاض في حجم وحظ في مجموعة العلاج هو تأثير حقيقي للتدخل العلاجي.
وأكد -together.within الصفحات = "1"> النهاية نقطة تقييم النسيجي من الرئتين الماوس من مختلف الوقت نقاط دقة النتائج مع الكشف الجزئي الفحص بالاشعة المقطعية. وأظهرت الفئران التي تبين أنها تملك الرئتين واضحة على بالاشعة المقطعية الصغير الأنسجة رئة طبيعية: الفئران السذاجة قبل التعريفي الدوكسيسيكلين. كانت الفئران التي أظهرت تشوهات على الفحص التغيرات النسيجية المختلفة بما في ذلك فقاعات وعقيدات (الشكل 1B، F، I). الفئران بعد 10-12 أسبوعا من الاستقراء مع الدوكسيسيكلين: لوحظت عقيدات غدية متعددة مع أحجام متغيرة والمواقف في جميع الحيوانات (الشكل 2C، F). الفئران بعد 10-12 أسبوعا من تحريض الدوكسيسيكلين تليها 10-12 أسابيع من مانع FGFR: كانت العقيدات أقل من ذلك بكثير في عدد وأصغر (الشكل 3D، H، L) بالمقارنة مع تلك التي لوحظت بعد الاستقراء. الفئران بعد 10-12 أسبوعا من تحريض الدوكسيسيكلين تليها 10-12 أسابيع من العلاج الوهمي: عقيدات كبيرة متعددة مرئية (الشكل 3P) مماثلة لتلك التي كانت عليها في نقطة زمنية ما بعد الاستقراء.
الشكل 1. مايكرو-CT يحدد ما قبل الاستقراء الرئة شذوذ. تم فحص جميع الفئران مع الصغير-CT قبل الشروع في تحريض الدوكسيسيكلين. عندما تم الكشف عن تشوهات الرئة، والموت الرحيم الفئران للتأكيد النسيجي. الممثلة الصغيرة CT مسح الصور ل(A) لرئة طبيعية. (C) الرئتين بمساحة منخمص؛ (DE) الرئتين مع الفقاعات النفاخي و (GH) الرئتين مع الظل عقيدية غير طبيعي. وأكد التقييم النسيجي دقة النتائج الدقيقة CT: (B) العادية الأنسجة الرئة. (F) المناطق النفاخي متعددة؛ وأنا) متعددة العقيدات الورم. شريط مقياس: 200 ميكرون.53904fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مايكرو-CT يحدد تنمية العقيدات الورم بعد الاستقراء. الفئران التي أظهرت ما قبل الاستقراء نظيفة مسح تم تغذيتها الدوكسيسيكلين طعام لمدة 10 أسابيع ثم إعادة تقييمها مع الصغير-CT، وبعد ذلك الموت الرحيم كانت لتقييم النسيجي. الممثلة الصغيرة CT مسح الصور من اثنين من الفئران مختلفة تظهر ظهور الظلال عقيدية متعددة بعد 10 أسابيع من بدء طعام الدوكسيسيكلين. (A، D) قبل الاستقراء الرئة نظيفة، (B، E) موقف نفس مسح الصور التي تبين تطور عقيدات متعددة (الأسهم الحمراء). تشير الأسهم الصفراء الصغيرة إلى المعالم التشريحية المستخدمة لتحديد الموقف نفسه في نقطة زمنية مختلفة. (C، F) العقيدات ينظر في الفحص الدقيقة CT كانوا جonfirmed في الأقسام النسيجية الرئة. شريط مقياس: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مايكرو-CT يحدد التغييرات في العقيدات ورم في الاستجابة للعلاج. الفئران أظهرت أن يمسح ما قبل الاستقراء نظيفة غذيت الدوكسيسيكلين طعام لمدة 10 أسابيع، وبعد ذلك تم إجراء بعد تحريض الصغير-CT. بعد ذلك، أنها كانت تدار من FGFR المانع AZD4547 لمدة 10 اسابيع اخرى وإعادة تقييمها مع الصغير-CT (بعد المعالجة). كانت تدار السيطرة على الفئران وهمي بدلا من المانع FGFR لتوضيح التأثير الفعلي للتدخل العلاجي. وأخيرا، تم يصرح باستخدامها الفئران لتقييم النسيجي.
الممثلة الصغيرة CT مسح الصور من أربعة فئران مختلفة. (A، E، I، M) (B، F، J، N) يمسح من نفس الفئران بعد أن يسببها مع طعام الدوكسيسيكلين لمدة 10 أسابيع، أظهر جميع العقيدات متعددة (السهام الحمراء، البيضاوي الأحمر يطوق المنطقة التي تم تظليلها تماما من العقيدات). (C، G، K) يمسح من نفس الفئران بعد 10 أسابيع إضافية من العلاج المانع FGFR تبين اختفاء كامل أو انخفاض ملحوظ في حجم العقيدات. (O) مسح من ماوس تحكم لتمثيل المجموعة الضابطة التي كانت تدار وهمي بدلا من FGFR المانع تظهر زيادة في حجم العقيدات الورم والعدد. الأسهم الصفراء الصغيرة تشير إلى المعالم التشريحية المستخدمة لتحديد الموقف نفسه في نقطة زمنية مختلفة. (D، H، L) وأكدت أقسام النسيجية وانخفاض ملحوظ في حجم العقيدات وعدد (قارن إلى الشكل 2 C و F). (P) يظهر بريسيالامتحانات التنافسية الوطنية العقيدات الورم متعددة عندما كانت تدار همي. شريط مقياس: 200 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة أساس الدقيقة CT-الموصوفة هنا لتحديد الوقت الحقيقي من تشوهات الرئة ورصد تطور العقيدات الورم والاستجابة للعلاج في النماذج الحيوانية سرطان الرئة ستمكن العلماء الذين يجرون التجارب المتعلقة بسرطان الرئة لتخطيط أكثر تجارب دقة وكفاءة مع توفير الوقت والموارد. لقد استخدمت سابقا التصوير بالرنين المغناطيسي لنفس الغرض 6. كان وضوح المسح الضوئي وعتبة للكشف عن العقيدات الرئة مع التصوير بالرنين المغناطيسي أدنى من تلك التي مع المسح الدقيقة CT الموضحة في هذه الدراسة 6.
كانت دراسة سابقة أن تستخدم نماذج السرطان الرئوي الفئران مماثلة (مع خلفيات وراثية مختلفة، وأساليب الورم الاستقراء) من الواضح أن العديد من العيوب التي كان يمكن تجنبها أو تحسين قد استخدموا-CT الجزئي المسح 9،10. كان لديهم أي وسيلة لتحديد أي تشوهات الرئة قبل تحريض أو عقيدات، مما يهدد بتفاقمالنتائج من خلال إدراج الحيوانات غير مناسبة. كان لديهم أيضا أي وسيلة لتأكيد نمو الاورام بعد تحريض أو بعد نشر الخلايا السرطانية في الفئران من النوع البري (للحث على أورام ثانوية)، لذلك كان عليهم الانتظار لمدة 4-8 أشهر ثم الموت ببطء عمياء الفئران لتحديد النسيجي لل الأورام. عندما استخدمت هذه النماذج لتقييم الإمكانات العلاجية للدواء، وكان الباحثون إلى تخصيص عدة مجموعات ليتم التخلص في تسلسل زمني للكشف عن تأثير العلاج على العقيدات الورم مع الأنسجة ولتكون قادرة على تحديد نقطة زمنية من تأثير القصوى 11.
واحد الحد من أسلوبنا، ومع ذلك، هو ظهور ظلال ضبابية التي تحجب الكشف عن عقيدات في الرئتين عندما يتم حقن بعض المواد الغريبة intratracheally 7 (لا تظهر البيانات). يبدو بعض الفئران لتطوير رد فعل للالتهابات لفترات طويلة لمادة حقن وظل هذا reactiعلى ذمة والخلالي المرفقة ملثمين العقيدات الموجودة. في مثل هذه الحالات، يمكن أن يحاكم التصوير بالرنين المغناطيسي كبديل.
في الآونة الأخيرة، أدخلت طرائق التصوير الأخرى لتقييم الحالات المرضية المختلفة في الحيوانات الصغيرة؛ مثل التصوير تلألؤ بيولوجي 12 و التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) مسح 13. على حد علمنا، لم تستخدم هذه الأنظمة التصوير بعد لتقييم أورام الرئة في نماذج الفئران حتى مقارنة كفاءة الكشف وضوح الصورة مع التصوير بالرنين المغناطيسي الحيوانات الصغيرة والصور الصغيرة CT ليس متاحا بعد. من توفر وكلفة هذه الآلات هي العامل المحدد لاستخدامها على نطاق واسع.
اكتشفنا تشوهات الرئة في ما يقرب من 50٪ من الفئران في فحص ما قبل الاستقراء، وبالتالي تم استبعاد هذه الفئران من تجارب أخرى. هذه نسبة عالية من تشوهات قد يكون نتيجة "المتسرب" التحوير FGF9 في بعض الحيوانات مما أدى إلى تطوير العقيدات الورمق حتى قبل أن يتم الناجم عن أنهم 14. في الواقع، أظهر ما يقرب من نصف الحيوانات المستبعدة عند فحص تشريحيا وجود عقيدات صغيرة متعددة. ويمكن أيضا أن يكون سبب هذه التي لها تأثير الشاذة من التحوير إدراج على الجينات المجاورة في جينوم الفأر 14. تطوير هذا النوع من التشوهات هي بأي حال من الأحوال محددة لSftpc-rtTA وتري-Fgf9-IRES-EGFP الفئران نقرا مزدوجا المعدلة وراثيا وبالتالي نماذج أخرى سرطان الرئة قد تكون تعاني من حالات مماثلة. هذه نسبة عالية من الضوء شذوذ حتى أكثر أهمية الفحص قبل إدراج الفئران باستخدام الصغير-CT. أبدا أظهر ساذجة الفئران البرية من نوع أي الظلال غير طبيعية على CT الصغيرة (الشكل 1A).
في الختام، لقد وصف الطريقة التي يستغل حيوان الجهاز الصغير-CT صغيرة لكشف دقيق ورصد لتطور العقيدات ورم في الرئتين من نموذج غدية الماوس. بواسطةاستخدامه لرصد التغيرات في العقيدات مع مرور الوقت، بيانات أكثر دقة يمكن جمعها، والتكلفة ودوام كفاءة في استهلاك الوقت ويمكن تكييف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل منحة في والمساعدات من JSPS KAKENHI لAEH (منحة رقم 25461196) والسل (جرانت أرقام 23390218 و15H04833) والمعاهد الوطنية للصحة HL111190 منحة (DMO). فإن الكتاب أن نعترف ميوكي ياماموتو لجهودها في مساعدة مع التنميط الجيني الحيواني وإعداد المقاطع النسيجية. ونحن ممتنون للبحوث الموارد التعاونية، كلية الطب، جامعة كيو للدعم التقني والكواشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J. Cancer. 136, 359-386 (2015).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am. J. Transl. Res. 15, 114-118 (2014).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat. Rev. Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol. Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Malkinson, A. M. The genetic basis of susceptibility to lung tumors in mice. Toxicology. 54, 241-271 (1989).
- Yin, Y., Betsuyaku, T., Garbow, J. R., Miao, J., Govindan, R., Ornitz, D. M. Rapid induction of lung adenocarcinoma by fibroblast growth factor 9 signaling through FGF receptor 3. Cancer Res. 73, 5730-5741 (2013).
- Arai, D., et al. Characterization of the cell of origin and propagation potential of the fibroblast growth factor 9-induced mouse model of lung adenocarcinoma. J. Pathol. 235, 593-605 (2015).
- Paraffin processing of tissue. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Curtis, S. J., et al. Primary tumor genotype is an important determinant in identification of lung cancer propagating cells. Cell Stem Cell. 7, 127-133 (2010).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. EMBO J. 33, 468-481 (2014).
- Santos, A. M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J. L., Puré, E. Targeting fibroblast activation protein inhibits tumor stromagenesis and growth in mice. J Clin Invest. 119, 3613-3625 (2009).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive Bioluminescence Imaging in Small Animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Yao, R., Lecomte, R., Crawford, E. S. Small-Animal PET: What Is It, and Why Do We Need It. J Nucl Med Technol. 40, 157-165 (2012).
- Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).
