Introduction
Akciğer kanseri dünyada yaklaşık 1 kanseri önde gelen ölüm nedenidir. Akciğer kanserinin önlenmesi, erken tespit ve tedavisi üzerine araştırmalar, dünya 2,3 genelinde birçok araştırma merkezlerinde devam etmektedir. Akciğer kanseri için çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir ve bunlar kanser kök hücrelerinin varlığını belirlemede, akciğer karsinogenezindeki ve menşe hücrenin mekanizmaları çalışmak yararlı olduğu kanıtlanmıştır ve çeşitli yeni tedavi stratejileri 4 incelerken. Daha önce modelleri farelerin 5 hassas suşlarında kanserojen kaynaklı tümör başlaması dayanıyordu. Akciğer kanseri özellikle manipüle genetik lezyonlar sonucu ortaya çıktığı nakavt ve transgenik fare modellerinin geliştirilmesi önemli ölçüde tümör indüksiyonu ve insan akciğer kanseri 4 mimik çeşitli yönlerini kontrol yeteneğimizi geliştirdi. Bununla birlikte, akciğer kanseri, hayvan modellerinde kullanımında büyük bir sorun, gerçek zamanlı bir yöntemi yokluğu içindoğru tespit etmek ve fare akciğerlerde tümör başlangıcı ve gelişimini izlemek ve bu tür tedavilere yanıt devam eden büyüme ya da azaltılması gibi boylarına, herhangi bir sonraki değişiklik belgelemek. Bu birkaç kez, çaba ve kaynak tüketen teknikleri tümörleri belirlemek ve bunların deney sonuçlarını değerlendirmek için başvurmak araştırmacılar zorlamıştır. Tümör başlatılmasına cevaben doğal arası fare varyasyonu, bu veri değişkenliği azaltmak için her bir deney grubu hayvanların çok sayıda kullanılmasını gerektirir. gerçek zamanlı olarak tedavi tümör büyümesini veya yanıtı değerlendirmek için yetersizlik örneklerinden kaynak israfı ile sonuçlanan, körü körüne doğru veri toplamak garanti uzun süreli deneysel protokolleri birden fazla zaman noktalarında fareler euthanize araştırmacılar zorlamıştır ya çok erken ya da çok geç zaman noktalarında toplanan.
Bu çalışmada, bir yöntem olup, küçük bir hayvan mikro c yararlanmaomputed tomografi (mikro-CT) tarayıcı tespit ve takip akciğer tümörleri farelere yaşayan tanıtıldı 'de. Biz son zamanlarda tarif Sftpc-rtTA ve Tre-Fgf9-Teller-eGFP çift transgenik (DT) hızla doksisiklin 6,7 ile indüksiyon aşağıdaki akciğer adenokarsinomu geliştirmek fareler kullanıldı. Mikro-BT kullanımı (diğer şeylerin yanı sıra) bize sağlayan indüksiyon sonrası akciğerde tümör nodülleri gelişimini onaylamak ve deneysel tedavilere yanıt tümör nodülleri değişiklikleri gözlemlemek, indüksiyon öncesi anormal akciğer anomalileri olan fareler dahil değildir. fareler ve histolojik değerlendirme son nokta ötanazi mikro-CT ile gerçekleştirilen gerçek zamanlı değerlendirilmesi doğruluğunu teyit etti. Biz bu teknik, değerli kaynakların tasarrufu gözlem süresini kısaltarak ve sonuçlarının doğruluğunu ve anlayış artırırken akciğer kanseri hayvan modelleri kullanılarak daha iyi planlanmış deneyler önünü inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Keio Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Not: Bu çalışmada, Sftpc-rtTA ve akciğer adenokarsinomu hızla doksisiklin 6,7 içeren yemi besleyerek indüksiyon sonrası geliştiği Tre-Fgf9-Teller-eGFP DT fareler kullanıldı. Bununla birlikte, tüm değerlendirme işlemleri diğer akciğer kanseri fare modellerinde uygulanabilir.
1. Deney Anahat:
- Başlangıçta akciğerlerin durumunu belirlemek:
- Tümör indüksiyon öncesi, DT fareler 8 olduğunda - 12 haftalık ilk mikro-CT taraması (aşağıdaki bölümlere 2 ve 3'e bakın) gerçekleştirin. Bu, akciğer bazal tarama olarak hizmet veren bir sızdıran transgen neden kendiliğinden geliştirilen nodüllerin yokluğunu teyit ve tümör indüksiyon öncesi varolan herhangi bir akciğer patolojisi yokluğunu belgelemek.
- Tümör indüksiyon başlatın:
- Düzenli ch DT fareler geçişdoksisiklin Chow akış alveoler hücreler, fibroblast büyüme faktörü (FGF), 9 ekspresyonunu indükleme ve tümör gelişimini başlatmak için. doksisiklin yemi (200 ppm) libitum verin.
- fare akciğerlerinde tümör nodüllerinin gelişimini teyit:
- Ön indüksiyon tarama ile karşılaştırıldığında tümör nodüllerinin gelişimini tanımlamak için bir mikro-CT taraması gerçekleştirin.
- tedaviye yanıtın değerlendirilmesinde:
- Tedaviye tepki olarak tümör nodülleri değişiklikleri tespit FGF reseptörü (FGFR) inhibitörü AZD4547 yönetmek için mikro-CT yeteneğini test etmek için, daha sonra 5 ve 10 hafta sonra ek mikro-CT tarama.
- Uç nokta değerlendirme:
- histolojik değerlendirme (aşağıdaki bölüm 6'ya bakınız) için tüm tedavi ve kontrol fareleri ve süreç dokuları euthanize.
Mikro-CT Image Acquisition 2. hazırlanması Fare:
- Mikro-BT tarayıcı ve bilgisayarı açın.
- clic"R_m CT2" adlı yazılım üzerinde k, sonra "ısınma" üzerine tıklayın.
- Fare mikro-BT odasından alınacaktır bunun üzerine örnek yatak çıkarın. naylon ile yatak sarın.
- belirtilen seviyeye kadar anestezi buharlaştırıcı için izofluran ekleyerek anestezi indüksiyon kutusunu ayarlayın. / Dk 3 L izofluran akış hızını ayarlayın.
- indüksiyon kutunun içine oksijen akışını başlatmak ve 1 l / dk akış hızını ayarlamak için oksijen tankı açın.
- anestezi indüksiyon kutusunda fare yerleştirin ve derinden kendiliğinden hareketin ve bir cilt tutam yanıt yokluğunda (doku hasarı veya deri molası neden olmaz cildin küçük bir kıvrım, yumuşak bir tutam) ile anestezi emin olun.
- Anestezi sırasında kornea kuruluğunu önlemek için bir göz yağ sürün.
- Mikro-BT odasına açın ve örnek yatakta sırt tarafında fareyi yukarı yerleştirin. fare başını tutun ve orde alt ekstremitelerde aşağıya doğru vücudu çekinr germek ve simetrik vücudu düzeltmek için.
- indüksiyon kutusuna anestezi akışını kapatın ve mikro-BT odasına bağlayan tüp doğru açın.
- Sürekli anestezi yönetmek için farenin burun içine anestezi tüp yerleştirin.
- pozisyonda fare düzeltmek için; Fare ve plastik wrap ile örnek yatak sarın.
Not: Derin anestezi altında ve tarama sırasında herhangi bir hafif bir hareket ya da vücudunun büküm puslu görüntü ve yorumlanmasında zorluk neden olur, çünkü örnek yatağa sarılı fare tutmak için kritik öneme sahiptir. - Mikro-BT odası kapatın.
- 90 kV ve 160 uA ve 4.5 dk tarama zamanı mikro-BT sistemini ayarlayın. 50 × 50 × 50 mm 24 × 19 mm görüntü aralığı ve voksel boyutunu ayarlayın. kalp atışları için senkron modunu kullanın.
- o klasördeki yeni görüntüleri kaydetmek için "Veritabanı" yeni bir klasör yapın.
- Taramayı başlatın.
- Taramanın tamamlanmasından sonra, boş bir kafesin içine fare taşımak ve bilinci yerine gelene kadar gözlemleyin. tamamen anestezi etkisinden iyileşene kadar diğer farelerin ile koymayın.
3. Ön indüksiyon Mikro-BT Görüntü Görselleştirme ve Analiz:
- : Mikro-BT görüntüleri görselleştirmek için, aşağıdaki web sitesinden ücretsiz ImageJ yazılımı indirmek http://imagej.nih.gov/ij/ . Not: Her mikro-BT veri dosyası yaklaşık 500 TIF dosyaları bir yığını (tif). Diğer resim görüntüleme yazılımı da kullanılabilir.
- seri mikro-BT görüntüleri dosyaları açmak ve tersi karın veya boyun her fare tüm görüntüleri ilerleyin.
- Naif vahşi tip farelerin taramaları kullanarak, (Şekil 1A bakınız) fare anatomi bilgisine dayanarak göğüs farklı alanlarda ve normal anatomik yapıların yoğunluğunu belirlemek.
- ile imleci tutunbilgisayar fare ve boyun göğsüne beyazımsı abdominal organlar ve diyafram gelen ve yukarı başlayarak yukarı ilerleyin.
- kemikli göğüs kafesi işaretlerini (tarafta sırt ve kaburga ön sternum, vertebra) belirleyin.
- göğüs ön ve kalbine yakın ve mediastende büyük kan damarları kalbi belirleyin.
- sağ üzere iki kola ayrılır ve sol ana bronş daha küçük ve daha küçük bronşlara şube devam (boyun ve göğsün üst seviyesinde küçük bir koyu daire gibi) trakea lümeni gözlemleyin. Her bir bronş yakın iki ya da üç kan damarları (Şekil 1A) ile ilişkili olduğunu not edin.
- un kaynaklı DT farelerin taramaları inceleyerek başlayın ve herhangi bir anormallik varlığı tespit.
- Başka deneyler anormal öncesi indüksiyon akciğer gölgeler (örneğin, nodüller, amfizemli bül, vs.) ile fareler hariç. (Şekil 1 C-E, G, H
4. Tümör indüksiyonu:
- Normal akciğer taramaları gösterdi deney farelerinde, tümör gelişmesini teşvik etmek için, doksisiklin içeren yemi (200 ppm), düzenli olarak yiyecek kendi gıda geçiş.
5. Takip taramaları:
- 10 hafta sonra, akciğerlerinde (bakınız Şekil 2) tümör nodüllerinin gelişimini doğrulamak için bütün farelerde bir ikinci mikro-CT taraması yapar.
- iki gruba fareler ayrıldı. Bir grup için 10 hafta daha başka kontrol grubuna bir plasebo (10 hafta boyunca / hafta 6 gün gastrik tüpü yolu ile 125 ug / kg / gün) FGFR engelleyici AZD4547 yönetme.
- 5 hafta sonra - 4 üncü tarama yaparak nodüler gölgeler değişiklikleri takip edin.
- Tedavi 10 hafta sonunda, dördüncü bir tarama yapar.
- CO2 inhalasyonu ile ya da 0.1 mg / pentobarbital 200 ul intraperitonal enjeksiyonu ile tüm fareleri öldürülür.
- içinSonra görünüm / herhangi bir anormal gölgeler ortadan kaybolması (Şekil 3 kontrol, indüksiyon sonrası ve tedaviye yanıt tümör nodülleri dinamik değişimleri tespit iki veya daha fazla farklı zaman noktalarında aynı fare seri tarama görüntüleri içinde benzer pozisyonları belirlemek ).
- farklı zaman noktalarında aynı fare aynı düzlemde belirlenmesini kolaylaştırmak için, fare göğüs içinde anatomik dönüm yapıları ile ilgi uçağı ilişkilendirmek için deneyin.
- Böyle trakea, onun çatallanma, sağ ve sol ana bronş, aort, diyafram ve büyük kan damarları gibi işaretlerini kullanın.
Not: torakal vertebraların, kaburga ve sternum dahil Göğüs kemikleri, çünkü tarama pozisyonu yanlış yorumlanmasına olasılığını artırmak örnek yatakta fare vücut uyum ortak küçük yatırır, konumlandırma simge olarak daha az yararlıdır. Benzer şekilde, tarama dosya içinde görüntü seri numarası identifyin için güvenilmezg zaman için başka bir zaman noktası fare vücut uzunluğu değişiklik aynı pozisyon. Farklı zaman noktalarında aynı düzlem belirlenmesi başarısızlık ya da hata bulgular yanlış pozitif / negatif yorumlanmasına neden olabilir.
- Böyle trakea, onun çatallanma, sağ ve sol ana bronş, aort, diyafram ve büyük kan damarları gibi işaretlerini kullanın.
6. Fare Ötenazi ve Akciğer Koleksiyonu:
- CO2 inhalasyonu ile ya da 0.1 mg / pentobarbital 200 ul intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere öldürülür.
- Karın duvarından boylamasına keserek karın iç organ Açığa. abdominal aorta diseksiyon ile akciğerlerde kan hacmini azaltmak için fareyi havasını alın.
- ince makas ile diyafram yarık; Bu nedenle akciğerleri çöken, göğüs boşluğundan negatif basınç kaybına neden olur. kesme ve göğüs ön duvarının kaburga parçaları kaldırarak akciğer ve kalp Açığa. trake maruz cilt ve yumuşak dokuları keserek boyun ön kısmını temizleyina.
- kalp ve timus bezi kesip. yemek borusu ayırmak için trakea arkasında forseps yerleştirin.
- daha sonra bir G24 kanül ile trakea cannulate eklenen parçası etrafında bir iş parçacığı sıkarak yerine sabitleyin.
- Şişirme ve 25 cm kolon kullanılarak trakeal kanül ile buz soğukluğunda% 4 paraformaldehit (PFA) ile akciğer sabitleyin. kanül ayırın ve sonra PFA sızmasını önlemek gırtlak onun eki kapalı üst trakea kesmek için iplik sıkın.
- Dikiş ipliğinin gelen trakea çekin ve eki onu incelemek ve -bloku tr akciğer ile çıkarmak için aşağı doğru devam ediyor. % 4 PFA 5 ml ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içine yerleştirin. Tam doku penetrasyonu ve fiksasyonu sağlamak için PFA O / N akciğerleri bırakın, daha sonra standart bir parafin blok 8 içine doku işlemek.
- Hematoksilen ve eozin standart teknikler kullanılarak bir mikrotom ve leke 6 um kalınlığında dilimler halinde parafin blokları kesin. 7. Histolojik Değerlendirme:
- slayt tarayıcı enstrüman ve bilgisayarı açın.
- "NDP tarama" yazılım tıklayın.
- "Slaytlar Toplu" ve slaytlar bir dizi taranması için "Yarı Otomatik Mod" tarama modunu seçin.
Not: sıralı tarama sırasında slaytlar alır robotik kol cam slaytlar kenarlarında herhangi bir düzensizlik karşı çok duyarlıdır. - Makinenin içerisine yerleştirmeden önce tüm cam slaytların kenarlarını elle muayene edin. Herhangi bir kapak cam çıkıntı veya kurutulmuş montaj orta varsa, bir kesici veya bir neşter ile temizleyin.
- bir slayt kaset içine slaytlar yükleyin. numune kapağı açın ve pozisyon "bir" içine kaseti kaydırın;. Kapıyı kapat.
- bilgisayar yazılımları, daha sonra "Tamam" düğmesine tıklayın kaset kendi uygun pozisyonda tüm slaytlara kısa açıklayıcı adlar vermek.
- "Aydınlık": profil modunu seçin.
- Geçici Taramaya başlamak için "Başlat Toplu" üzerine tıklayın.
Not: Makine tüm slaytları taramayı bittikten sonra, yazılım otomatik olarak tüm slaytlar üzerinde dokularla alanları tespit ve ilgi bir bölge olarak önerecektir. - Gerekirse, sol fare tuşunu basılı tutarak ve bölgenin sınırını çekerek ilgi bölgeyi yeniden tanımlıyor.
Not: Söz konusu bölgeler çok daha uzun bir tarama süresi neden olacak gibi slaytların aşırı büyük alanlarını belirlemek. - slaytların tümü üzerinde çıkarları bölgeleri memnun kez, tüm slaytlar taramaya başlamak için "Scan" butonuna tıklayınız.
taranmış dosyaları düşük ve yüksek çözünürlükte dijital görülebilir ve görüntüleri JPEG olarak ihraç edilebilir: Notdosyaları.
Not: Dijital histolojik değerlendirme için bir "slayt tarayıcı" kullanımı burada tarif edilmesine rağmen, değerlendirme için, düzenli mikroskobu ve görüntü histolojik değerlendirme kullanılması da mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Akciğer anormallikleri olan fareler tanımlanması başlangıçta uygulandı. DT fareler 8 idi tümör indüksiyonu önce - 12 haftalık, tüm farelerin akciğerleri mikro-BT ile tarandı. Şaşırtıcı bir şekilde, farelerin yaklaşık% 50 oranında daha sonraki çalışmaya dahil onları uygun gördükleri için bizi zorladı anormallik saptandı. Bu anormallikler nodül gibi gölgeler, büyük tek veya multipl küçük amfizematöz bül ve / veya lober atelektazi (Şekil 1A, C, DE, GH) idi. Ardından, FGF9 transgen ve tümör indüksiyon (anormallikleri olmadan) normal akciğer taramaları gösterdi fareler alveol hücreleri ve sonraki tümör gelişiminde FGF9 ifadesini uyarmak için doksisiklin chow düzenli yem geçiş edildi activated.Only oldu. Tümör indüksiyonu başlatılmasından on hafta sonra fare akciğer tümör nodülleri gelişimini teyit mikro-BT taramaları takip etmek için yapıldı. Bu d ortayaTüm fareler değişken boyutlarda birden çok nodüller evelopment (Şekil 2, E, B ve D için bir karşılaştırın). Mikro-CT taramaları tedaviye yanıtın değerlendirilmesi için yapılmıştır. Bu, gerçekten de tedavi öncesi taramalarla (Şekil 3'te görünür nodüllerin büyüklüğü kaybolması ya da azalma sergiledi 10 hafta içinde FGFR önleyicisi AZD4547 uygulanmıştır fareler ön-sonrası uyarımı ve sonrası tedavileri, ac karşılaştırın ortaya , EG ve IK). Öte yandan, FGFR inhibitörü verilen değildi ve plasebo verildi Kontrol fareleri yerine herhangi bir değişiklik, nodüller boyutu ve yeni nodüllerin görünüş olarak artış gösterdi (Şekil 3, MO); boyutunda azalma tedavi grubunda gözlemlenen teyit terapötik müdahale gerçek bir etkisidir.
(Şekil 1B, F, I) dahil olmak üzere çeşitli histolojik değişiklikler vardı. Değişken boyutları ve pozisyonları ile Çoklu adenokarsinom nodülleri bütün hayvanlarda (Şekil 2C, F) gözlendi: doksisiklin ile indüksiyon 12 hafta - 10 sonra fareler. Nodüller çok sayıda daha az ve daha küçük (Şekil 3D, H, L) olanlar gözlemlenen sonrası indüksiyon ile karşılaştırıldığında: Bir FGFR bloker 12 haftalık - 10 izledi doksisiklin indüksiyon 12 hafta - Fareler 10 sonra. 10 ardından doksisiklin indüksiyon 12 hafta - - 10 sonra fareler plasebo 12 hafta: Çoklu büyük nodüller görülebilir (Şekil 3P) Post-indüksiyon zaman noktasında görülen bu benzer.
Şekil 1. Mikro-BT Ön indüksiyon Akciğer anormallikler. Tüm fareler doksisiklin indüksiyon başlamadan önce mikro-BT ile incelendi tanımlar. Akciğer anormallikleri tespit edildiğinde, fareler histolojik onay için ötenazi edildi. (A) Normal akciğer için temsili mikro-BT tarama görüntüleri, bir atelektazik alana sahip (C) Akciğerler; (DE) amfizematöz bül ve anormal nodüler gölge (GH) akciğerlere ile akciğerler. Histolojik değerlendirme mikro-BT bulgularının doğruluğunu teyit: (F) birden amfizematöz alanlar (B) normal akciğer histoloji; ve ben) çoklu tümör nodülleri. Ölçek çubuğu: 200 mikron.53904fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Mikro-CT onlar histolojik değerlendirme için ötenazi, bundan sonra mikro-BT ile yeniden değerlendirilmelidir 10 hafta, tarama doksisiklin yemi ile beslendi temiz öncesi indüksiyon gösterdi İndüksiyon. Farelerde sonra Tümör Nodüllerinin Geliştirme tanımlar. İki farklı farelerden alınan temsili mikro-CT taraması görüntüleri 10 hafta doksisiklin chow başladıktan sonra birden nodüler gölgeler görünümünü gösterir. (A, D) gelişimini gösteren Öncesi indüksiyon temiz akciğer, (B, E) Aynı pozisyonlu tarama görüntüleri birden nodüller (kırmızı oklar). Küçük sarı oklar (C, F). Farklı zaman noktalarında aynı pozisyonda tanımlamak için kullanılan anatomik noktalara işaret mikro-CT taraması vardı c görülen NodüllerinAkciğer histolojik bölümlerde onfirmed. Ölçek çubuğu:. 200 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Temiz öncesi indüksiyon taramaları gösterdi için tedavi. Farelerde Tepki Mikro-BT tanımlar Değişiklikler Tümör Nodüllerinin ise Şekil 3. 10 hafta boyunca doksisiklin yemi ile beslenmişlerdir, sonra bir post-indüksiyon mikro-BT yapıldı. Sonra, onlar 10 hafta daha FGFR inhibitörü AZD4547 uygulandı ve mikro-CT (tedavi sonrası) ile yeniden değerlendirildi. Kontrol fareleri terapötik müdahale gerçek etkisini netleştirmek için plasebo yerine FGFR inhibitörü uygulandı. Son olarak, fareler, histolojik değerlendirme için kurban edilmiştir.
Dört farklı farelerden Örnek mikro BT ve görüntüler. (A, E, I, E) (B, F, J, K) aynı farelerden alınan tarar.; tüm multipl nodüller gösterdi (C, G, K). (kırmızı oklar, kırmızı oval tamamen nodüller gölgesinde olmuştu bir alanı çevreleyen) tamamen kaybolması veya gösteren FGFR inhibitörü ile tedavinin ek bir 10 hafta sonra aynı farelerin tarar nodüllerin büyüklüğü belirgin bir azalma. (O) tümör nodülleri 'büyüklük ve sayıda artış gösteren inhibitör FGFR yerine plasebo verildi kontrol grubu temsil edecek bir kontrol fare tarayın. Küçük sarı oklar farklı zaman noktalarında aynı pozisyonda tanımlamak için kullanılan anatomik noktalara işaret etmektedir. (D, H, L) Histolojik kesitler nodül boyutu ve sayısı belirgin bir azalma doğruladı (2 C ve F Şekil karşılaştırın). (P) prese gösterirçoklu tümör nodüllerinin ım plasebo tatbik edildiğinde. Ölçek çubuğu:. 200 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tümör nodül gelisimi ve daha planlamak için akciğer kanseri ile ilişkili deneyler yapıyorlar bilim adamları sağlayacak akciğer kanseri hayvan modellerinde tedaviye yanıtın gerçek zamanlı akciğer anormalliklerinin belirlenmesi ve takibi için burada açıklanan mikro-BT tabanlı bir yöntem doğru ve etkili deneyler zaman ve kaynak tasarruf ederken. Biz daha önce aynı amaçla 6 MRG kullandık. MRG ile akciğer nodüllerinin tespiti için tarama ve eşik netlik Bu çalışmada 6 açıklanan mikro-BT ile ölçüşebiliyordu.
(Farklı genetik geçmişleri ve tümör indüksiyon yöntemleri ile) benzer akciğer adenokarsinomu fareler modelleri kullanılan Önceki çalışmalar açıkça kaçınılması ya da mikro-CT taraması 9,10 kullanmıştı geliştirilmiş olabilirdi bazı dezavantajları vardı. Dolayısıyla karıştırıcı riske, herhangi bir ön indüksiyon akciğer anormallikleri veya nodüller tespit etmek hiçbir anlamı yoktuUygun olmayan hayvanların dahil edilmesiyle sonuçları. Onlar da indüksiyon sonrası veya (ikincil tümörler ikna etmek için) yabani tip farelere kanser hücrelerini yayma sonra tümörlerin gelişimini teyit etmek için hiçbir anlamı vardı, bu yüzden o körü körüne histolojik tanımlama için fareler euthanize 4-8 ay beklemek zorunda kaldı tümörler. Bu modeller ilacın terapötik potansiyelini değerlendirmek için kullanıldığı zaman, araştırmacılar histoloji ile tümör nodülü üzerinde tedavilerin etkisini tespit etmek ve maksimal etki süresi noktasını tespit edebilmek için bir kronolojik sırayla ötenazi için çeşitli gruplar ayırmak zorunda kaldı 11.
Bizim yöntemin bir sınırlama, ancak, bazı yabancı maddeler intratrakeal 7 (veriler gösterilmemiştir) enjekte edildiğinde akciğerlerde nodüllerin algılama belirsiz bulanık gölgelerin ortaya çıkmasıdır. Bazı fareler enjekte maddeye uzun bir inflamasyon ve bu Reacti gölge geliştirmek gibiydive beraberindeki interstisyel ödem mevcut nodül maskeli. Bu gibi durumlarda, MRG alternatif olarak denenebilir.
Son zamanlarda, diğer görüntüleme yöntemleri küçük hayvanlarda çeşitli patolojiler değerlendirmek için getirilmiştir; biyoparlaklık görüntüleme 12 ve pozitron emisyon tomografisi (PET) gibi 13 tarayın. küçük hayvan MRG ve mikro-BT görüntüleri ile tespit verimliliği ve görüntü netliği karşılaştırılması henüz mümkün değildir bu yüzden Bildiğimiz kadarıyla, bu görüntüleme sistemleri fare modellerinde akciğer tümörleri değerlendirmek için henüz kullanılmamıştır. Bu makinelerin kullanılabilirliği ve maliyet bunların yaygın kullanımı sınırlayıcı bir faktör vardır.
Bu ön indüksiyonlu tarama farelerin yaklaşık% 50 akciğer anormallikleri tespit edilebilir ve uygun bu fareler, daha başka deneyler alınmadı. anormallikleri Bu yüksek oranda tümör nodülü geliştirilmesi ile sonuçlanan bazı hayvanlarda, bir "sızan" FGF9 transgenin bir sonucu olabilirOnlar 14 uyarılan önce bile s. Gerçekten de, histolojik olarak incelenmiştir dahil hayvanların yaklaşık yarısından çok sayıda küçük nodüller varlığını göstermiştir. Bunlar, aynı zamanda, fare genomu 14 komşu genler üzerinde yerleştirilmiş transgenin bir sapkın etkisinin neden olabilir. Anormalliklerin bu tür gelişimi hiçbir Sftpc-rtTA ve Tre-Fgf9-Teller-eGFP çift transgenik fareler ve böylece diğer akciğer kanseri modelleri benzer durumlar muzdarip olabilir özgü yoluyla bulunmaktadır. anormallik vurgulamaktadır Bu yüksek oranda mikro-CT kullanan farelerin ön eklenmesi taramasının hatta daha önemi. Naif vahşi tip fareler mikro-CT (Şekil 1A) üzerinde herhangi bir anormal gölgeler asla gösterdi.
Sonuç olarak, bir adenokarsinoma fare modeli akciğerde tümör nodüllerinin geliştirilmesi doğru algılama ve izleme için küçük bir hayvan mikro-CT cihazı kullanan bir metod tanımlamaktadır. Tarafındanzamanla nodüllerde değişiklikleri izlemek için kullanarak, daha doğru veri toplanabilir ve bir maliyet ve zaman tasarrufu zaman ders adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma Sağlık hibe HL111190 bir AEH (Hibe Numarası 25461196) ve TB için JSPS KAKENHI dan-Aid Grant-(Hibe Numaraları 23390218 ve 15H04833) ve National Institutes (DMO) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, hayvan genotipleme ve histolojik kesitlerin hazırlanması ile yardımcı onun çabaları için Miyuki Yamamoto kabul etmek istiyorum. Biz teknik destek ve reaktifler için Ortak Araştırma Kaynakları, Tıp Fakültesi, Keio Üniversitesi minnettarız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int. J. Cancer. 136, 359-386 (2015).
- Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment. Am. J. Transl. Res. 15, 114-118 (2014).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat. Rev. Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kwon, M. C., Berns, A. Mouse models for lung cancer. Mol. Oncol. 7, 165-177 (2013).
- Malkinson, A. M. The genetic basis of susceptibility to lung tumors in mice. Toxicology. 54, 241-271 (1989).
- Yin, Y., Betsuyaku, T., Garbow, J. R., Miao, J., Govindan, R., Ornitz, D. M. Rapid induction of lung adenocarcinoma by fibroblast growth factor 9 signaling through FGF receptor 3. Cancer Res. 73, 5730-5741 (2013).
- Arai, D., et al. Characterization of the cell of origin and propagation potential of the fibroblast growth factor 9-induced mouse model of lung adenocarcinoma. J. Pathol. 235, 593-605 (2015).
- Paraffin processing of tissue. , Available from: http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/ (2012).
- Curtis, S. J., et al. Primary tumor genotype is an important determinant in identification of lung cancer propagating cells. Cell Stem Cell. 7, 127-133 (2010).
- Lau, A. N., et al. Tumor-propagating cells and Yap/Taz activity contribute to lung tumor progression and metastasis. EMBO J. 33, 468-481 (2014).
- Santos, A. M., Jung, J., Aziz, N., Kissil, J. L., Puré, E. Targeting fibroblast activation protein inhibits tumor stromagenesis and growth in mice. J Clin Invest. 119, 3613-3625 (2009).
- Zinn, K. R., et al. Noninvasive Bioluminescence Imaging in Small Animals. ILAR J. 49, 103-115 (2008).
- Yao, R., Lecomte, R., Crawford, E. S. Small-Animal PET: What Is It, and Why Do We Need It. J Nucl Med Technol. 40, 157-165 (2012).
- Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 19, Unit 19.10 (2009).
