Introduction
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo 1. La investigación sobre la prevención, detección temprana y el tratamiento del cáncer de pulmón está en curso en muchos centros de investigación en todo el mundo 2,3. Varios modelos animales para el cáncer de pulmón se han desarrollado, y han demostrado ser útiles en el estudio de los mecanismos de la carcinogénesis de pulmón y la célula de origen, en la determinación de la presencia de células madre de cáncer, y en el examen de diversas nuevas estrategias terapéuticas 4. Los modelos anteriores se basaban en la iniciación del tumor cancerígeno inducida por cepas sensibles de ratones 5. El desarrollo de modelos de ratones transgénicos knockout y en el que se presenta el cáncer de pulmón como resultado de lesiones genéticas manipuladas específicamente ha mejorado sustancialmente nuestra capacidad de controlar la inducción de tumores y varios aspectos mímicos de cáncer de pulmón humano 4. Sin embargo, un reto importante en el uso de modelos animales de cáncer de pulmón es la ausencia de un método en tiempo real aidentificar con precisión y controlar la aparición y el desarrollo de tumores en los pulmones del ratón y para documentar cualquier cambio ulterior en sus tamaños, tales como su continuo crecimiento o reducción en la respuesta a los tratamientos. Esto ha obligado a los investigadores que recurrir a varias tiempo, esfuerzo, y las técnicas que consumen muchos recursos para identificar los tumores y para evaluar sus resultados experimentales. La presencia de la variación inherente inter-ratón en respuesta a la inducción de tumores requiere el uso de un gran número de animales en cada grupo experimental para reducir la variabilidad de los datos. La incapacidad para evaluar el crecimiento del tumor o la respuesta al tratamiento en tiempo real, ha obligado a los investigadores a la eutanasia a ciegas ratones en varios puntos de tiempo en los protocolos experimentales prolongados para garantizar que van a recoger los datos correctos, lo que resulta en la pérdida de recursos de las muestras recogido en los puntos de tiempo que son demasiado temprano o demasiado tarde.
En el presente estudio, un método para explotar una pequeña animal micro-cLa tomografía omputed (micro-TC) para detectar y seguimiento de tumores de pulmón en ratones vivos se introduce. Utilizamos nuestra reciente descripción SFTPC-rtTA y Tre-Fgf9-IRES-EGFP-dobles transgénicos (DT) ratones que rápidamente presenta adenocarcinoma de pulmón después de la inducción con doxiciclina 6,7. El uso de micro-CT nos permite (entre otras cosas) excluyen los ratones con alteraciones pulmonares aberrantes antes de la inducción, confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en el pulmón después de la inducción, y observar los cambios en los nódulos tumorales en respuesta a los tratamientos experimentales. Punto final de la eutanasia de los ratones y evaluación histológica confirmó la exactitud de la evaluación en tiempo real realizada con micro-CT. Creemos que esta técnica allanar el camino para la realización de experimentos mejor planificados utilizando modelos animales de cáncer de pulmón, mientras que el ahorro de recursos valiosos, acortando el tiempo de observación y aumentar la precisión y la comprensión de los resultados.
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Protocol
Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Keio.
Nota: En este estudio, hemos utilizado los ratones Tre-Fgf9-IRES-EGFP DT en el que adenocarcinoma de pulmón se desarrolla rápidamente después de la inducción por la alimentación de pienso que contiene doxiciclina 6,7 SFTPC-rtTA y. Sin embargo, todos los procedimientos de evaluación se pueden aplicar a otros modelos de ratón de cáncer de pulmón.
Esquema 1. Experimento:
- Identificar el estado de los pulmones en la línea de base:
- Antes de la inducción del tumor, cuando los ratones DT son 8 - 12 semanas de edad, realizar el primer análisis de micro-CT (ver secciones 2 y 3 a continuación). Esto sirve como la exploración en base pulmonar, confirma la ausencia de nódulos desarrollados espontáneamente causadas por un transgén que gotea, y documentar la ausencia de cualquier patología pulmonar existente antes de la inducción de tumores.
- Iniciar la inducción de tumores:
- Cambiar los ratones DT de ch regularesow a pienso doxiciclina de inducir el factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) 9 expresión en las células alveolares y para iniciar el desarrollo del tumor. Chow dar doxiciclina (200 ppm) a voluntad.
- Para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones del ratón:
- Realizar un análisis de micro-CT para identificar el desarrollo de nódulos tumorales en comparación con el análisis previo a la inducción.
- Evaluar la respuesta al tratamiento:
- Para probar la capacidad de la micro-CT para detectar cambios en los nódulos tumorales en respuesta al tratamiento, administrar el FGF Receptor (FGFR) inhibidor de AZD4547, a continuación, realizar análisis adicionales micro-CT después de 5 y 10 semanas.
- Evaluación de punto final:
- La eutanasia a todos los ratones de tratamiento y control de procesos y tejidos para su evaluación histológica (véase la sección 6).
2. Los ratones se preparan para la micro-CT Adquisición de imágenes:
- Encienda el escáner micro-CT y el ordenador.
- Click en el software llamado "R_m CT2", a continuación, haga clic en "calentar".
- Retire el lecho de muestra sobre la que se colocará el ratón desde la cámara de micro-CT. Envolver la cama con una envoltura de plástico.
- Establecer el cuadro de inducción de la anestesia con isoflurano mediante la adición al vaporizador de anestesia hasta el nivel marcado. Ajuste la velocidad de flujo de isoflurano al 3 L / min.
- Abrir el tanque de oxígeno para iniciar el flujo de oxígeno en la caja de inducción y establecer la velocidad de flujo a 1 L / min.
- Coloque el ratón en la caja de la inducción anestésica y confirme que está profundamente anestesiados por la ausencia de movimiento espontáneo y en respuesta a una pizca de la piel (un pellizco suave de un pequeño pliegue de la piel, que no causa daño tisular o lesión en la piel).
- Aplicar un lubricante ocular para evitar la sequedad de la córnea durante la anestesia.
- Abra la cámara de micro-CT y colocar el ratón con el lado dorsal en la cama de la muestra. Mantenga la cabeza del ratón y tirar del cuerpo hacia abajo desde las extremidades inferiores en el order para estirar y enderezar el cuerpo de manera simétrica.
- Cierre el flujo de la anestesia a la caja de inducción y encenderlo hacia el tubo que se conecta a la cámara de micro-CT.
- Colocar el tubo de la anestesia en la nariz del ratón para administrar anestesia continua.
- Con el fin de solucionar el ratón en la posición; envolver el ratón y el lecho de la muestra con una envoltura de plástico.
Nota: Es muy importante para mantener el ratón bajo anestesia profunda y envuelto a la cama de la muestra, ya que cualquier ligero movimiento o giro de su cuerpo durante la exploración producen imágenes borrosas y dificultad en la interpretación. - Cierre la cámara de micro-CT.
- Ajustar el sistema de micro-CT a 90 kV y 160 mu y el tiempo de ciclo de 4,5 minutos. Ajuste el rango de la imagen de 24 x 19 mm y el tamaño de vóxel de 50 × 50 × 50 micras. Utilice el modo sincrónico de los latidos del corazón.
- Hacer una nueva carpeta en la "Base de datos" con el fin de guardar nuevas imágenes en esa carpeta.
- Iniciar el análisis.
- Después de terminar el análisis, mover el ratón en una jaula vacía y observar hasta que se recupere la conciencia. No lo ponga con otros ratones hasta que se haya recuperado por completo de los efectos de la anestesia.
3. Pre-inducción de micro-CT visualización y análisis de imágenes:
- Para visualizar las imágenes de micro-CT, descargar el software ImageJ gratuita desde el siguiente sitio web: http://imagej.nih.gov/ij/ . Nota: Cada archivo de datos micro-CT es una pila de aproximadamente 500 archivos TIF (.tif). Otro software de visualización de imágenes también se puede utilizar.
- Abrir los micro-CT archivos de imágenes en serie y desplazarse a través de todas las imágenes de cada ratón desde el cuello hasta el abdomen o viceversa.
- Por medio de escáneres de tipo salvaje ratones no tratados previamente, identificar la densidad de las diferentes áreas y estructuras anatómicas normales en el pecho en base al conocimiento de la anatomía del ratón (véase la Figura 1A).
- Mantenga el cursor con elratón de ordenador y desplazarse hacia arriba, a partir de las vísceras abdominales de color blanquecino y el diafragma, a través del pecho y hasta el cuello.
- Identificar los puntos de referencia óseos jaula torácica (esternón en la parte delantera, vértebras de la espalda y las costillas en los laterales).
- Identificar el corazón en la parte frontal del pecho y los principales vasos sanguíneos cerca del corazón y en el mediastino.
- Observar el lumen de la tráquea (como un pequeño círculo oscuro a nivel del cuello y parte superior del pecho), que se bifurca en la derecha y los bronquios principales izquierdo y luego siguen se ramifican en bronquios más pequeños y más pequeños. Tenga en cuenta que cada bronquio está estrechamente asociada con dos o tres vasos sanguíneos (Figura 1A).
- Empezar a examinar las exploraciones de ratones DT de la ONU inducida e identificar la presencia de cualquier anormalidad.
- Excluir ratones con sombras anormales pre-inducción de pulmón (por ejemplo, nódulos, bulas enfisematosa, etc.) de cualquier experimentos adicionales. (Figura 1C-E, G, H
4. Tumor de inducción:
- Para inducir el desarrollo de tumores en ratones experimentales mostró que las exploraciones pulmonares normales, cambiar sus alimentos de comida regular para pienso que contiene doxiciclina (200 ppm).
5. Seguimiento de las exploraciones:
- Después de 10 semanas, lleve a cabo una segunda exploración de micro-CT de todos los ratones para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones (véase la Figura 2).
- los ratones divididos en dos grupos. Administrar el AZD4547 FGFR bloqueador (125 mg / kg / día a través de una sonda gástrica durante 6 días / semana durante 10 semanas) a un grupo y un placebo para el otro grupo de control durante 10 semanas más.
- Seguimiento de los cambios en las sombras nodulares mediante la realización de un tercio de exploración 4 - 5 semanas más tarde.
- Al final de las 10 semanas de tratamiento, realizar cuarta exploración.
- La eutanasia de todos los ratones con inhalación de CO2 o con inyección intraperitoneal de 0,1 mg / 200 l de pentobarbital.
- Aidentificar los cambios dinámicos en los nódulos tumorales después de la inducción y en la respuesta al tratamiento, identificar posiciones similares dentro de las imágenes de exploración en serie del mismo ratón en dos o más diferentes puntos de tiempo a continuación, comprobar la aparición / desaparición de las sombras anormales (Figura 3 ).
- Para facilitar la identificación de el mismo plano en el mismo ratón en diferentes puntos de tiempo, trata de asociar el plano de interés con estructuras de marca anatómica dentro del pecho ratón.
- Utilizar puntos de referencia tales como la tráquea, su bifurcación, la bronquios principales derecho e izquierdo, la aorta, el diafragma y los grandes vasos sanguíneos.
Nota: los huesos del pecho, incluyendo las vértebras torácicas, costillas y el esternón son menos útiles como puntos de referencia de posicionamiento debido a las inclinaciones menores comunes en la alineación del cuerpo del ratón sobre la cama de la muestra, lo que aumenta la posibilidad de una mala interpretación de la posición de barrido. Del mismo modo, el número de serie de la imagen dentro del archivo de análisis es poco fiable para identifying la misma posición con el tiempo debido al cambio en la longitud del cuerpo del ratón de un punto de tiempo a otro. Insuficiencia o inexactitud en la identificación del mismo plano en diferentes puntos de tiempo pueden dar lugar a la interpretación falsa positiva / negativa de los resultados.
- Utilizar puntos de referencia tales como la tráquea, su bifurcación, la bronquios principales derecho e izquierdo, la aorta, el diafragma y los grandes vasos sanguíneos.
6. La eutanasia y el ratón Colección de pulmón:
- La eutanasia a los ratones con inhalación de CO2 o con la inyección intraperitoneal de 0,1 mg / 200 l de pentobarbital.
- Exponer las vísceras abdominales cortando longitudinalmente a través de la pared abdominal. Purgar el ratón para reducir el volumen de sangre en los pulmones mediante la disección de la aorta abdominal.
- Corte la membrana con unas tijeras finas; esto se traducirá en la pérdida de la presión negativa de la cavidad torácica, colapsando así los pulmones. Exponer los pulmones y el corazón por el corte y la eliminación de partes de las costillas de la pared torácica anterior. Limpiar la parte frontal del cuello cortando los tejidos de la piel y blandos para exponer la Trachea.
- Cortar el corazón y la glándula timo. Inserte fórceps detrás de la tráquea para separarlo del esófago.
- Canular la tráquea con una cánula G24 entonces fijarla en su lugar apretando un hilo alrededor de la parte insertada.
- Inflar y fijar el pulmón usando 4% de paraformaldehído enfriado con hielo (PFA) a través de la cánula traqueal utilizando una columna de 25 cm. Separar la cánula y apretar el hilo para evitar fugas PFA a continuación, cortar la tráquea superior fuera de su adhesión a la laringe.
- Tire de la tráquea del hilo de sutura y analizarlo desde su fijación, y continuar hacia abajo para retirarla con el pulmón en -Block. Insertarlo en un tubo de 15 ml que contiene 5 ml de 4% PFA. Deja los pulmones en PFA O / N para asegurar la penetración del tejido completo y fijación, y luego procesar el tejido en un bloque de parafina estándar de 8.
- Cortar los bloques de parafina en 6 rebanadas um de espesor en un micrótomo y tinción con hematoxilina y eosina usando técnicas estándar. 7. Evaluación histológica:
- Encienda el instrumento escáner de diapositivas y el ordenador.
- Haga clic en el software de "exploración PND".
- Seleccione el modo de exploración "por lotes de diapositivas" y "modo semi-automático" para la digitalización de una serie de diapositivas.
Nota: El brazo robótico que recoge los portaobjetos durante la exploración secuencial es muy sensible a las irregularidades en los bordes de los portaobjetos de vidrio. - Palpar los bordes de todos los portaobjetos de vidrio antes de cargarlos en la máquina. Si hay alguna protuberancia de la cubierta de vidrio o de medio de montaje se secó, limpiarlo con un cortador o un bisturí.
- Cargar las diapositivas en un casete de diapositivas. Abrir la escotilla muestra y deslice el casete en posición de "uno";. Cierre la puerta.
- En el software del equipo, dar nombres descriptivos cortos a todas las diapositivas en su posición correspondiente en el casete continuación, haga clic en el botón "OK".
- Seleccione el modo de perfil: "Campo claro".
- Haga clic en "Inicio de lote" para iniciar el escaneado provisional.
Nota: Una vez que la máquina haya terminado de escanear todas las diapositivas, el software detectará automáticamente las áreas con tejidos en todas las diapositivas y sugerir como una región de interés. - Si es necesario, vuelva a definir la región de interés manteniendo pulsado el botón izquierdo del ratón y tirando de la región fronteriza.
Nota: La definición excesivamente grandes áreas de las diapositivas como las regiones de interés se traducirá en un tiempo mucho más largo exploración. - Una vez satisfecho con las regiones de interés en todas las diapositivas, haga clic en "Scan" para comenzar a escanear todas las diapositivas.
Nota: Los archivos escaneados se pueden observar digitalmente en alta y baja resolución, y las imágenes se pueden exportar como JPEGarchivos.
Nota: Aunque se describe el uso de un "escáner de diapositivas" para la evaluación histológica digital de aquí, el uso de microscopios comunes y evaluación histológica visual para la evaluación también es posible.
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Representative Results
Identificación de ratones con anormalidades pulmonares se realizó al inicio. Antes de la inducción del tumor, cuando los ratones DT fueron 8 - 12 semanas de edad, los pulmones de todos los ratones fueron escaneados con micro-CT. Sorprendentemente, aproximadamente el 50% de los ratones mostraron anormalidades que nos obligó a considerar que los hace inadecuados para su inclusión en el estudio posterior. Estas anomalías eran sombras de nódulos similares, amplio pequeña bullas enfisematosa únicos o múltiples y / o atelectasia lobar (Figura 1 A, C, DE, GH). Entonces, el transgén FGF9 y el tumor de inducción fue activated.Only ratones que mostraban las exploraciones pulmonares normales (sin alteraciones) fueron cambiados de Chow Chow habitual de doxiciclina para inducir la expresión FGF9 en las células alveolares y el desarrollo posterior del tumor. Para confirmar el desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones del ratón después de diez semanas desde el inicio de la inducción del tumor, el seguimiento de las exploraciones de micro-CT se realizaron. Estos revelaron la desarrollo de múltiples nódulos de tamaño variable en todos los ratones (Figura 2, comparar la A a la B y D a E). Se realizaron exploraciones de Micro-TC para evaluar la respuesta al tratamiento. Estos revelaron que los ratones que se les administró el inhibidor de AZD4547 FGFR durante 10 semanas de hecho expuestas desaparición o reducción en el tamaño de los nódulos que eran visibles en las exploraciones de pre-tratamiento (Figura 3, comparar pre-, post-inducción y post-tratamientos, AC , EG y IK). Por otra parte, los ratones de control que no recibieron el inhibidor de FGFR y recibieron placebo en lugar no mostraron ningún cambio, el aumento de tamaño de los nódulos y la apariencia de nuevos nódulos (Figura 3, MO); confirmando que la disminución en el tamaño observado en el grupo de tratamiento es un verdadero efecto de la intervención terapéutica.
(Figura 1 B, F, I). Los ratones después de 10 - 12 semanas de inducción con doxiciclina: se observaron nódulos múltiples con adenocarcinoma de tamaños y posiciones variables en todos los animales (Figura 2 C, F). Los ratones después de 10 - 12 semanas de inducción doxiciclina, seguido de 10 - 12 semanas de un bloqueador de FGFR: Los nódulos eran mucho menores en número y más pequeñas (Figura 3D, H, L) en comparación con los observados después de la inducción. Los ratones después de 10 - 12 semanas de inducción doxiciclina, seguido de 10 - 12 semanas de placebo: grandes nódulos múltiples son visibles (Figura 3P) similares a éstos visto en el punto de tiempo después de la inducción.
Figura 1. Micro-CT Identifica Pre-inducción de pulmón anormalidades. Todos los ratones se examinaron con micro-CT antes de la iniciación de la inducción de la doxiciclina. Cuando se detectaron anormalidades de pulmón, los ratones fueron sacrificados para la confirmación histológica. Imágenes representativas de micro-CT scan para (A) un pulmón normal, (c) los pulmones con un área atelectásico; (DE) pulmones con bullas enfisematosa y los pulmones (GH) con una sombra nodular anormal. La evaluación histológica confirmó la exactitud de los resultados micro-CT: (B) la histología pulmonar normal; (F) múltiples áreas de enfisema; y I) múltiples nódulos tumorales. Barra de escala: 200 micras.53904fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Micro-CT Identifica el desarrollo de nódulos tumorales después de la inducción. Los ratones que mostraron un pre-inducción limpia exploración fueron alimentados con pienso doxiciclina durante 10 semanas luego re-evaluados con micro-CT, tras lo cual fueron sacrificados para la evaluación histológica. Representativos imágenes de escáner micro-CT de dos ratones diferentes muestran la aparición de múltiples sombras nodulares 10 semanas después del inicio de pienso doxiciclina. (A, D) Pre-inducción de pulmón limpio, (B, E)-misma posición de escaneo de imágenes que muestran el desarrollo de múltiples nódulos (flechas rojas). Las pequeñas flechas amarillas señalan los puntos de referencia anatómicos utilizados para identificar la misma posición en diferentes puntos temporales. (C, F) nódulos observados en el análisis de micro-CT fueron confirmed en secciones histológicas de pulmón. Barra de escala:. 200 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los micro-CT identifica los cambios en los nódulos tumorales en respuesta al tratamiento. Los ratones que mostró exploraciones pre-inducción limpias fueron alimentados con comida para doxiciclina durante 10 semanas, y luego se realizó un post-inducción de micro-CT. A continuación, se les administró el inhibidor de AZD4547 FGFR durante 10 semanas más y re-evaluados con micro-CT (post-tratamiento). Los ratones de control se les administró placebo en lugar del inhibidor de FGFR para aclarar el efecto real de la intervención terapéutica. Finalmente, los ratones fueron sacrificados para la evaluación histológica.
Representativos de escaneo de imágenes de micro-CT de cuatro ratones diferentes. (A, E, I, M) (B, F, J, N) scans de los mismos ratones después de que se indujeron con Chow doxiciclina durante 10 semanas.; todos mostraron múltiples nódulos (flechas rojas, el óvalo rojo rodea un área que había sido completamente eclipsado por nódulos). (C, G, K) scans de los mismos ratones después de 10 semanas adicionales de tratamiento con el inhibidor de FGFR que muestra la desaparición completa o marcada reducción en el tamaño de los nódulos. (O) Escaneado de un ratón de control para representar el grupo de control que se administró un placebo en lugar de la FGFR inhibidor que muestra aumento en el tamaño y el número de nódulos tumorales. Las pequeñas flechas amarillas apuntan a los puntos de referencia anatómicos utilizados para identificar la misma posición en diferentes puntos de tiempo. (D, H, L) secciones histológicas confirmó la marcada reducción en el tamaño del nódulo y el número (comparar con la Figura 2 C y F). (P) muestra la presena vez de múltiples nódulos tumorales cuando se administró placebo. Barra de escala:. 200 micras Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método basado en micro-CT se describe aquí para la identificación en tiempo real de las alteraciones pulmonares y el seguimiento del desarrollo de nódulos tumorales y la respuesta al tratamiento en modelos animales de cáncer de pulmón permitirá a los científicos que están llevando a cabo experimentos relacionados con el cáncer de pulmón para planificar más experimentos precisos y eficientes, ahorrando tiempo y recursos. Hemos utilizado anteriormente MRI para el mismo propósito 6. La claridad de la exploración y el umbral para la detección de nódulos pulmonares con MRI eran inferiores a los de las exploraciones micro-CT descritos en este estudio 6.
Los estudios previos que utilizaron modelos de ratones adenocarcinoma de pulmón similares (con diferentes antecedentes genéticos y métodos de inducción del tumor), obviamente, tenían varias desventajas que podrían haberse evitado o mejorados que habían utilizado la exploración micro-CT 9,10. No tenían medios para identificar cualquier anormalidad o nódulos pulmonares pre-inducción, poniendo en riesgo de confusiónsus resultados por la inclusión de animales no adecuados. También tenía medios para confirmar el desarrollo de tumores después de la inducción o después de propagarse a células cancerosas en ratones de tipo salvaje (para inducir tumores secundarios), por lo que tuvieron que esperar durante 4-8 meses después ciegamente la eutanasia a los ratones para la identificación histológica de tumores. Cuando se utilizaron estos modelos para evaluar el potencial terapéutico de un fármaco, los investigadores tuvieron que asignar varios grupos que ser sacrificados en una secuencia cronológica para detectar el efecto de los tratamientos sobre nódulos tumorales con la histología y para ser capaz de identificar el punto de efecto máximo tiempo 11.
Una limitación de este método, sin embargo, es la aparición de sombras borrosas que oscurecen la detección de nódulos en los pulmones cuando se inyectan por vía intratraqueal algunas sustancias extrañas 7 (datos no presentados). Algunos ratones parecían desarrollar una reacción inflamatoria prolongada a la sustancia inyectada y la sombra de este reactien y edema intersticial que acompaña enmascarado los nódulos existentes. En tales casos, la RM puede ser juzgado como una alternativa.
Recientemente, se han introducido otras modalidades de imagen para evaluar diversas patologías en animales pequeños; como imágenes de bioluminiscencia 12 y la tomografía por emisión de positrones (TEP) 13. A nuestro entender, estos sistemas de formación de imágenes no han sido aún utilizado para evaluar tumores de pulmón en modelos de ratones lo que la comparación de la eficiencia de la detección y la claridad de imagen con resonancia magnética animal pequeño y las imágenes micro-CT todavía no es posible. La disponibilidad y el coste de estas máquinas son un factor limitante para su uso generalizado.
Detectamos anormalidades pulmonares en aproximadamente el 50% de los ratones en la investigación de pre-inducción y en consecuencia estos ratones fueron excluidos de los nuevos experimentos. Esta alta incidencia de anormalidades podría ser el resultado de un transgén FGF9 "leaky" en algunos animales que resulta en el desarrollo de nódulo tumoralEs aún antes de que se inducen 14. De hecho, aproximadamente la mitad de los animales excluidos cuando se examina histológicamente mostró la presencia de múltiples nódulos pequeños. Estos también pueden ser causados por un efecto aberrante del transgén insertado en los genes vecinos en el genoma del ratón 14. El desarrollo de este tipo de anomalías son de ninguna manera específica al SFTPC-rtTA y Tre-Fgf9-IRES-EGFP ratones transgénicos doble y por lo tanto otros modelos de cáncer de pulmón podría estar sufriendo de situaciones similares. Esta alta incidencia de los puntos destacados de anormalidad, incluso, más la importancia de la investigación del pre-inclusión de los ratones utilizando micro-CT. Los ratones de tipo salvaje tratados previamente nunca mostró ningún sombras anormales en la micro-CT (Figura 1A).
En conclusión, hemos descrito un método que se aprovecha de una pequeña máquina de micro-CT animales para la detección precisa y el seguimiento del desarrollo de nódulos tumorales en los pulmones de un modelo de adenocarcinoma de ratón. Porutilizarlo para monitorear los cambios en los nódulos lo largo del tiempo, los datos más precisos pueden ser recogidos, y un coste y evolución en el tiempo eficiente en el tiempo pueden ser adaptados.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención-en-Ayudas de JSP KAKENHI de AEH (Grant número 25461196) y la tuberculosis (Grant números 23390218 y 15H04833) y los Institutos Nacionales de Salud de subvención HL111190 (DMO). Los autores desean reconocer Miyuki Yamamoto por sus esfuerzos en ayudar con la determinación del genotipo de los animales y la preparación de las secciones histológicas. Estamos muy agradecidos a los recursos de investigación en colaboración, Facultad de Medicina, Universidad de Keio de apoyo técnico y reactivos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
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