Introduction
फेफड़ों के कैंसर दुनिया के आसपास 1 कैंसर से मौत का प्रमुख कारण है। रोकथाम, जल्दी पता लगाने, और फेफड़ों के कैंसर के इलाज में अनुसंधान दुनिया 2,3 भर में कई अनुसंधान केन्द्रों में चल रही है। फेफड़ों के कैंसर के लिए कई पशु मॉडल विकसित किया गया है, और वे कैंसर स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति का पता लगाने में, फेफड़ों कैंसरजनन और मूल के सेल के तंत्र के अध्ययन में उपयोगी सिद्ध कर दिया है, और विभिन्न उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों की जांच में 4। पहले मॉडल चूहों 5 के संवेदनशील उपभेदों में कैसरजन प्रेरित ट्यूमर दीक्षा पर भरोसा किया। पीटा और ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के विकास में जो फेफड़ों के कैंसर के लिए विशेष रूप से चालाकी से आनुवंशिक घावों का एक परिणाम के रूप में उठता काफी ट्यूमर प्रेरण और मानव फेफड़ों के कैंसर के 4 की नकल कई पहलुओं को नियंत्रित करने की क्षमता में सुधार हुआ है। हालांकि, फेफड़ों के कैंसर के पशु मॉडल के उपयोग में एक बड़ी चुनौती के लिए एक वास्तविक समय विधि का अभाव हैसही पहचान और माउस के फेफड़ों में शुरुआत और ट्यूमर के विकास पर नजर रखने और इस तरह उनके निरंतर विकास या उपचार के जवाब में कमी के रूप में उनके आकार, में किसी भी बाद में परिवर्तन करने के लिए दस्तावेज़। यह शोधकर्ताओं ने कई समय, प्रयास और संसाधन लेने वाली तकनीक ट्यूमर की पहचान करने और उनके प्रयोगात्मक परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए उपाय करने के लिए मजबूर किया गया है। ट्यूमर प्रेरण के जवाब में निहित अंतर-माउस भिन्नता की उपस्थिति डेटा परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में जानवरों की बड़ी संख्या के उपयोग की आवश्यकता है। वास्तविक समय में ट्यूमर के विकास या उपचार के जवाब का आकलन करने में असमर्थता शोधकर्ताओं मजबूर कर दिया है आँख बंद करके गारंटी नहीं है कि वे सही डेटा एकत्रित करेगा लंबे समय तक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में कई समय अंक पर चूहों euthanize करने के लिए, नमूने से संसाधनों की बर्बादी है, जिसके परिणामस्वरूप समय अंक है कि या तो बहुत जल्दी या बहुत देर हो चुकी हैं पर एकत्र।
वर्तमान अध्ययन में, एक विधि एक छोटे पशु सूक्ष्म-सी का फायदा उठाने के लिएomputed टोमोग्राफी (सूक्ष्म सीटी) स्कैनर का पता लगाने और अनुवर्ती फेफड़ों के ट्यूमर रहने वाले चूहों में शुरू की है करने के लिए। हम हमारे हाल ही में वर्णित Sftpc-rtTA और Tre-Fgf9-IRES-EGFP डबल ट्रांसजेनिक (डीटी) चूहों कि तेजी से डॉक्सीसाइक्लिन 6.7 के साथ प्रेरण निम्नलिखित फेफड़ों adenocarcinoma विकसित किया करते थे। सूक्ष्म सीटी का उपयोग करें (अन्य बातों के अलावा) करने के लिए हमें सक्षम बनाता है, प्रेरण से पहले न्यायपालिका फेफड़ों असामान्यताओं के साथ चूहों को बाहर फेफड़ों में ट्यूमर पिंड का विकास इस बात की पुष्टि शामिल होने के बाद, और प्रयोगात्मक उपचार के जवाब में ट्यूमर पिंड में परिवर्तन का पालन। चूहों और ऊतकीय मूल्यांकन के अंत बिंदु इच्छामृत्यु सूक्ष्म सीटी के साथ आयोजित वास्तविक समय निर्धारण की सटीकता की पुष्टि की। हम मानते हैं कि इस तकनीक को फेफड़ों के कैंसर के पशु मॉडल का उपयोग कर, बहुमूल्य संसाधनों को बचाने के अवलोकन के समय छोटा और परिणामों की सटीकता और समझ में वृद्धि करते हुए बेहतर योजना बनाई प्रयोगों के संचालन के लिए मार्ग प्रशस्त होगा।
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Protocol
पशु प्रयोगों कीयो विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
नोट: इस अध्ययन में, हम Sftpc-rtTA और Tre-Fgf9-IRES-EGFP डीटी चूहों जिसमें फेफड़ों adenocarcinoma तेजी से डॉक्सीसाइक्लिन 6.7 युक्त चाउ खिलाने से शामिल होने के बाद विकसित किया करते थे। हालांकि, सभी मूल्यांकन प्रक्रिया अन्य फेफड़ों के कैंसर के माउस मॉडल को लागू किया जा सकता है।
1. प्रयोग रेखांकित करें:
- बेस लाइन पर फेफड़ों की स्थिति की पहचान:
- ट्यूमर शामिल होने से पहले, जब डीटी चूहों 8 - 12 सप्ताह पुरानी है, पहले सूक्ष्म सीटी स्कैन (नीचे धारा 2 और 3 देखें) प्रदर्शन करते हैं। यह फेफड़ों के आधारभूत स्कैन के रूप में कार्य करता है एक टपकाया ट्रांस्जीन की वजह से अनायास विकसित पिंड के अभाव की पुष्टि करता है, और ट्यूमर शामिल होने से पहले किसी भी मौजूदा फेफड़ों विकृति के अभाव दस्तावेज़।
- आरंभ ट्यूमर प्रेरण:
- नियमित रूप से चर्चा से डीटी चूहों स्विचडॉक्सीसाइक्लिन चाउ करने के लिए ओउ वायुकोशीय कोशिकाओं में प्रेरित करने के लिए fibroblast वृद्धि कारक (FGF) 9 अभिव्यक्ति और ट्यूमर के विकास आरंभ करें। डॉक्सीसाइक्लिन चाउ (200 पीपीएम) जी भरकर दे।
- माउस फेफड़ों में ट्यूमर पिंड के विकास की पुष्टि करें:
- पूर्व प्रेरण स्कैन की तुलना में ट्यूमर पिंड के विकास की पहचान के लिए एक सूक्ष्म सीटी स्कैन करते हैं।
- उपचार के जवाब का आकलन:
- , उपचार के जवाब में ट्यूमर पिंड में परिवर्तन का पता लगाने FGF रिसेप्टर (FGFR) अवरोध AZD4547 प्रशासन के लिए सूक्ष्म सीटी की क्षमता का परीक्षण करने के लिए, तो 5 और 10 सप्ताह के बाद अतिरिक्त सूक्ष्म सीटी स्कैन प्रदर्शन करते हैं।
- अंत बिंदु मूल्यांकन:
- सभी उपचार और नियंत्रण चूहों और histological मूल्यांकन (नीचे धारा 6 देखें) के लिए प्रक्रिया ऊतकों euthanize।
2. सूक्ष्म सीटी छवि अधिग्रहण के लिए तैयार कर रहा है चूहे:
- सूक्ष्म सीटी स्कैनर और कंप्यूटर चालू करें।
- Clic"R_m CT2" नाम की सॉफ्टवेयर पर कश्मीर, फिर "गर्म" पर क्लिक करें।
- नमूना बिस्तर जिस पर माउस सूक्ष्म सीटी कक्ष से रखा जाएगा निकालें। प्लास्टिक की चादर के साथ बिस्तर लपेटें।
- उल्लेखनीय स्तर तक संज्ञाहरण vaporizer के लिए isoflurane जोड़कर संज्ञाहरण प्रेरण बॉक्स सेट। 3 एल / मिनट में isoflurane प्रवाह की दर निर्धारित करें।
- ऑक्सीजन टैंक खुला प्रेरण बॉक्स में ऑक्सीजन का प्रवाह शुरू करते हैं और 1 एल / मिनट में प्रवाह की दर निर्धारित करने के लिए।
- संज्ञाहरण प्रेरण बॉक्स में माउस प्लेस और पुष्टि करते हैं कि यह गहरा सहज आंदोलन की और एक त्वचा चुटकी के जवाब में अनुपस्थिति (त्वचा के एक छोटे से गुना, जो ऊतकों को नुकसान या त्वचा को तोड़ने का कारण नहीं है के एक सज्जन चुटकी) द्वारा anesthetized है।
- संज्ञाहरण के दौरान कार्निया सूखापन को रोकने के लिए एक आंख का स्नेहक लागू करें।
- सूक्ष्म सीटी कक्ष खोलें और नमूना बिस्तर पर पृष्ठीय पक्ष के साथ माउस को जगह है। माउस के सिर पकड़ो और orde में निचले अंगों से नीचे शरीर खींचआर खिंचाव और संतुलित रूप से शरीर को सीधा करने के लिए।
- प्रेरण बॉक्स के लिए संज्ञाहरण प्रवाह बंद कर दें और यह ट्यूब सूक्ष्म सीटी चैम्बर को जोड़ता है कि दिशा में मोड़ पर।
- संज्ञाहरण ट्यूब माउस नाक में रखें निरंतर संवेदनाहारी प्रशासन के लिए।
- आदेश की स्थिति में माउस को ठीक करने में; माउस और प्लास्टिक की चादर के साथ नमूना बिस्तर की चादर।
नोट: यह गहरी संज्ञाहरण के तहत और नमूना बिस्तर पर लिपटे क्योंकि किसी भी मामूली आंदोलन या उसके शरीर के मोड़ स्कैन के दौरान धुंधला छवियों और व्याख्या में कठिनाई का परिणाम देगा माउस रखने के लिए महत्वपूर्ण है। - सूक्ष्म सीटी चैम्बर बंद।
- 90 केवी और 160 μA और 4.5 मिनट के लिए समय स्कैन करने के लिए सूक्ष्म सीटी प्रणाली को समायोजित करें। 50 × 50 × 50 माइक्रोन तक के लिए 24 × 19 मिमी छवि की सीमा और वॉक्सेल आकार सेट करें। दिल की धड़कन के लिए तुल्यकालिक मोड का उपयोग करें।
- आदेश है कि फ़ोल्डर में नए छवियों को बचाने के लिए "धन्यवाद" में एक नया फ़ोल्डर बनाएँ।
- स्कैन शुरू करो।
- स्कैन के पूरा होने के बाद, एक खाली पिंजरे में माउस ले जाते हैं और यह निरीक्षण जब तक यह चेतना आएगा। अन्य चूहों के साथ इसे रखा जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण के प्रभाव से उबर गए हैं मत करो।
3. पूर्व प्रेरण सूक्ष्म सीटी छवि दृश्य और विश्लेषण:
- : सूक्ष्म सीटी छवियों कल्पना करने के लिए निम्न वेब साइट से मुक्त ImageJ सॉफ्टवेयर डाउनलोड http://imagej.nih.gov/ij/ । नोट: हर सूक्ष्म सीटी डेटा फ़ाइल लगभग 500 TIF फ़ाइलों की हो चुकी है (.tif)। अन्य छवि देखने सॉफ्टवेयर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
- ओपन सीरियल सूक्ष्म सीटी चित्र फ़ाइलें और पेट या ठीक इसके विपरीत करने के लिए गर्दन से प्रत्येक माउस की छवियों के सभी के माध्यम से स्क्रॉल।
- भोले प्रकार के जंगली चूहों के स्कैन का उपयोग करना, छाती माउस शरीर रचना विज्ञान के ज्ञान के आधार पर अलग-अलग क्षेत्रों और सामान्य शारीरिक संरचनाओं के घनत्व की पहचान (चित्रा 1 ए देखें)।
- साथ कर्सर पकड़कंप्यूटर माउस और ऊपर स्क्रॉल, श्वेताभ पेट की आंत और डायाफ्राम, छाती के माध्यम से और ऊपर गर्दन के लिए शुरू।
- बोनी छाती पिंजरे स्थलों (पीठ और पक्षों पर पसलियों में सामने उरोस्थि, कशेरुकाओं) को पहचानें।
- छाती के सामने और दिल के पास और mediastinum में प्रमुख रक्त वाहिकाओं में दिल को पहचानें।
- है, जो सही में bifurcates और बाएं मुख्य ब्रांकाई तो और छोटे छोटे ब्रांकाई में शाखा करने के लिए जारी रखने के लिए (गर्दन और सीने के ऊपरी हिस्से के स्तर पर एक छोटे से काले घेरे के रूप में) श्वासनली लुमेन का निरीक्षण करें। ध्यान दें कि प्रत्येक श्वसनी बारीकी से दो या तीन रक्त वाहिकाओं (चित्रा 1 ए) के साथ जुड़ा हुआ है।
- संयुक्त राष्ट्र प्रेरित डीटी चूहों के स्कैन की जांच शुरू करने और किसी भी असामान्यताएं की उपस्थिति की पहचान।
- किसी भी आगे के प्रयोगों से असामान्य पूर्व प्रेरण फेफड़ों छाया (जैसे, पिंड, emphysematous bullae, आदि) के साथ चूहों को बाहर निकालें। (चित्रा 1 सी-ई, जी, एच
4. ट्यूमर प्रेरण:
- प्रयोगात्मक चूहों में ट्यूमर के विकास कि सामान्य फेफड़ों के स्कैन से पता चला है के लिए प्रेरित करने के लिए, डॉक्सीसाइक्लिन युक्त चाउ (200 पीपीएम) के लिए नियमित रूप चाउ से उनके भोजन के लिए स्विच।
5. अनुवर्ती स्कैन:
- 10 सप्ताह के बाद, उनके फेफड़ों (चित्रा 2 देखें) में ट्यूमर पिंड के विकास पुष्टि करने के लिए सभी चूहों के एक दूसरे सूक्ष्म सीटी स्कैन करते हैं।
- दो समूहों में चूहों विभाजित। FGFR अवरोधक AZD4547 प्रशासन एक समूह के लिए और 10 सप्ताह के लिए अन्य नियंत्रण समूह के लिए एक प्लेसबो (125 माइक्रोग्राम / किग्रा / दिन 6 दिन 10 सप्ताह के लिए / सप्ताह के लिए एक गैस्ट्रिक ट्यूब के माध्यम से)।
- 5 सप्ताह बाद - 4 एक तिहाई स्कैन प्रदर्शन से गांठदार साये में परिवर्तन का पालन करें।
- इलाज के 10 सप्ताह के अंत में, एक चौथाई स्कैन करते हैं।
- सीओ 2 साँस लेना के साथ या 0.1 मिलीग्राम / pentobarbital के 200 μl की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ सभी चूहों euthanize।
- सेवा मेरेप्रेरण के बाद और उपचार के जवाब में ट्यूमर पिंड में गतिशील परिवर्तन की पहचान दो या दो से अधिक अलग-अलग समय-बिंदुओं पर एक ही माउस के धारावाहिक छवियों स्कैन के भीतर इसी तरह की स्थिति की पहचान तो उपस्थिति / किसी भी असामान्य छाया के लापता होने (चित्रा 3 के लिए जाँच )।
- अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही माउस में एक ही विमान की पहचान की सुविधा के लिए, माउस छाती के भीतर संरचनात्मक मील का पत्थर संरचनाओं के साथ ब्याज के विमान संबद्ध करने के लिए प्रयास करें।
- ऐसे श्वासनली, अपने विभाजन, सही और बाएँ मुख्य ब्रांकाई, महाधमनी, डायाफ्राम, और बड़े रक्त वाहिकाओं के रूप स्थलों का प्रयोग करें।
नोट: थोरैसिक कशेरुकाओं, पसलियों, और उरोस्थि सहित छाती हड्डियों, क्योंकि नमूना बिस्तर पर माउस शरीर संरेखण में आम नाबालिग tilts, जो स्कैन स्थिति की गलत व्याख्या की संभावना में वृद्धि की स्थिति स्थलों के रूप में कम उपयोगी होते हैं। इसी तरह, फ़ाइल स्कैन के भीतर छवि सीरियल नंबर identifyin के लिए अविश्वसनीय हैछ समय के साथ एक दूसरे के लिए समय बिंदु से माउस शरीर की लंबाई में परिवर्तन की वजह से एक ही स्थिति। अलग अलग समय बिंदुओं पर एक ही विमान की पहचान करने में विफलता या अशुद्धि के निष्कर्षों की झूठी सकारात्मक / नकारात्मक व्याख्या में परिणाम हो सकता है।
- ऐसे श्वासनली, अपने विभाजन, सही और बाएँ मुख्य ब्रांकाई, महाधमनी, डायाफ्राम, और बड़े रक्त वाहिकाओं के रूप स्थलों का प्रयोग करें।
6. माउस इच्छामृत्यु और फेफड़े संग्रह:
- सीओ 2 साँस लेना के साथ या 0.1 मिलीग्राम / pentobarbital के 200 μl की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ चूहों euthanize।
- पेट की दीवार के माध्यम से longitudinally काटने से पेट की आंत बेनकाब। माउस उदर महाधमनी विदारक द्वारा फेफड़ों में रक्त की मात्रा को कम करने के लिए भरो।
- ठीक कैंची के साथ डायाफ्राम भट्ठा; इस छाती गुहा से नकारात्मक दबाव के नुकसान में परिणाम होगा, इस प्रकार फेफड़ों टूट। काटने और पूर्वकाल छाती दीवार की पसलियों के कुछ हिस्सों को हटाने के द्वारा फेफड़े और दिल को बेनकाब। trache बेनकाब करने के लिए त्वचा और कोमल ऊतकों काटने से गर्दन के ललाट भाग को साफए।
- दिल और थाइमस ग्रंथि दूर कटौती। घेघा से अलग श्वासनली के पीछे संदंश डालें।
- एक G24 प्रवेशनी साथ श्वासनली Cannulate तो डाला हिस्से के चारों ओर एक धागा कस द्वारा सुरक्षित स्थान में।
- फुलाना और सांस की नली प्रवेशनी के माध्यम से ठंडा 4% paraformaldehyde (पीएफए) का उपयोग कर एक 25 सेमी स्तंभ का उपयोग फेफड़ों को ठीक। प्रवेशनी को अलग करें और पीएफए रिसाव तब रोकने गला करने के लिए अपने लगाव बंद ऊपरी श्वासनली में कटौती करने के लिए धागा कस लें।
- सिवनी धागे से श्वासनली खींचो और अपने लगाव से यह काटना, और एन -block फेफड़ों के साथ इसे दूर करने के लिए नीचे बने हुए हैं। 4% पीएफए के 5 मिलीलीटर युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में डालें। पीएफए हे / एन में फेफड़ों छोड़ दो पूरा ऊतक प्रवेश और निर्धारण सुनिश्चित करने के लिए है, तो एक मानक आयल ब्लॉक 8 में ऊतक की प्रक्रिया।
- एक microtome और hematoxylin और eosin मानक तकनीक का उपयोग कर के साथ दाग पर 6 उम-मोटी स्लाइस में पैराफिन ब्लॉक में कटौती। 7. histological मूल्यांकन:
- स्लाइड स्कैनर साधन और कंप्यूटर चालू करें।
- "एनडीपी स्कैन" सॉफ्टवेयर पर क्लिक करें।
- मोड स्कैन "स्लाइड के बैच" और स्लाइड्स की एक श्रृंखला स्कैनिंग के लिए "अर्द्ध ऑटो मोड" का चयन करें।
नोट: रोबोट भुजा कि अनुक्रमिक स्कैनिंग के दौरान स्लाइड ऊपर उठाता गिलास स्लाइड के किनारों पर किसी भी अनियमितताओं के लिए बहुत संवेदनशील है। - उन्हें मशीन में लोड करने से पहले सभी गिलास स्लाइड के किनारों टटोलना। अगर वहाँ कवर कांच के किसी भी फलाव या सूखे बढ़ते मध्यम है, यह साफ एक कटर या एक छुरी के साथ।
- एक स्लाइड कैसेट में स्लाइड लोड। नमूना हैच खोलें और स्थिति "एक" में कैसेट स्लाइड;। दरवाज़ा बंद करो।
- कंप्यूटर सॉफ्टवेयर पर, तो क्लिक करें "ठीक" बटन कैसेट में उनके इसी स्थिति में सभी स्लाइड्स के लिए कम वर्णनात्मक नाम दे।
- "Brightfield": प्रोफ़ाइल मोड का चयन करें।
- पर "प्रारंभ बैच" पर क्लिक अनंतिम स्कैनिंग शुरू करने के लिए।
नोट: एक बार मशीन सभी स्लाइड्स स्कैनिंग समाप्त हो गया है, सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से सभी स्लाइड्स पर ऊतकों के साथ क्षेत्रों का पता लगाने और ब्याज की एक क्षेत्र के रूप में यह सुझाव देगा। - यदि आवश्यक हो, बाईं माउस बटन नीचे पकड़ रहा है और इस क्षेत्र की सीमा खींच कर ब्याज के क्षेत्र को फिर से परिभाषित।
नोट: स्लाइड की जरूरत से ज्यादा बड़े क्षेत्रों के रूप में ब्याज के क्षेत्रों में एक बहुत लंबे समय तक स्कैन समय में परिणाम होगा परिभाषित। - एक बार जब स्लाइड्स के सभी पर हितों के क्षेत्रों से संतुष्ट हैं, सभी स्लाइड्स स्कैनिंग शुरू करने के लिए "स्कैन" पर क्लिक करें।
नोट: स्कैन फ़ाइलों निम्न और उच्च संकल्प में डिजिटल मनाया जा सकता है, और छवियों जेपीईजी के रूप में निर्यात किया जा सकताफ़ाइलें।
ध्यान दें: हालांकि डिजिटल ऊतकीय मूल्यांकन के लिए एक "स्लाइड स्कैनर" के उपयोग यहाँ वर्णित है, मूल्यांकन के लिए नियमित रूप से माइक्रोस्कोप और दृश्य histological मूल्यांकन का उपयोग भी संभव है।
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Representative Results
फेफड़ों असामान्यताओं के साथ चूहों की पहचान बेस लाइन पर प्रदर्शन किया गया था। ट्यूमर प्रेरण, जब डीटी चूहों 8 थे इससे पहले कि - उम्र के 12 सप्ताह, सभी चूहों के फेफड़ों सूक्ष्म सीटी के साथ स्कैन किया गया। हैरानी की बात है, चूहों का लगभग 50% असामान्यताएं उन्हें बाद के अध्ययन में शामिल किए जाने के लिए अनुपयुक्त समझे करने के लिए हमें मजबूर कर दिया है कि पता चला है। ये असामान्यताएं गुत्थी की तरह छाया, बड़े एक या कई छोटे emphysematous bullae और / या लोबार श्वासरोध (चित्रा 1 ए, सी, डी, जी एच) थे। फिर, FGF9 ट्रांस्जीन और ट्यूमर प्रेरण था activated.Only चूहों कि सामान्य फेफड़ों स्कैन (असामान्यताओं के बिना) से पता चला वायुकोशीय कोशिकाओं और बाद में ट्यूमर के विकास में FGF9 अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने डॉक्सीसाइक्लिन चाउ करने के लिए नियमित रूप से चाउ से बंद कर दिया गया। ट्यूमर प्रेरण की दीक्षा से दस सप्ताह के बाद माउस फेफड़ों में ट्यूमर पिंड का विकास इस बात की पुष्टि करने के लिए, सूक्ष्म सीटी स्कैन अनुवर्ती कार्रवाई प्रदर्शन किया गया। ये डी का पता चलासभी चूहों में चर आकार के कई पिंड के evelopment (चित्रा 2, ई करने के लिए बी और डी के लिए एक तुलना)। माइक्रो-सीटी स्कैन उपचार के लिए प्रतिक्रिया का आकलन करने प्रदर्शन किया गया। ये पता चला कि चूहों कि 10 सप्ताह वास्तव में पिंड है कि पूर्व उपचार स्कैन (3 चित्र में दिखाई दे रहे थे के आकार में लापता होने या कमी का प्रदर्शन के लिए FGFR अवरोध AZD4547 दिलाई गई, पूर्व की तुलना, पोस्ट-प्रेरण और बाद के उपचार, एसी ईजी और इंद्रकुमार)। दूसरी ओर, नियंत्रण चूहों कि FGFR अवरोध नहीं दिया गया और placebo दिए गए बजाय कोई परिवर्तन नहीं, पिंड आकार और नए पिंड की उपस्थिति में वृद्धि देखी गई (चित्रा 3, एमओ); इस बात की पुष्टि है कि आकार में कमी इलाज के समूह में मनाया चिकित्सकीय हस्तक्षेप की एक वास्तविक प्रभाव है।
(चित्रा 1 बी, एफ, आई) सहित विभिन्न ऊतकीय परिवर्तन किया था। 10 चूहों के बाद - डॉक्सीसाइक्लिन के साथ प्रेरण के 12 सप्ताह: चर आकार और स्थिति के साथ एकाधिक ग्रंथिकर्कटता पिंड सभी जानवरों (चित्रा -2 सी, एफ) में मनाया गया। उन मनाया पोस्ट-प्रेरण की तुलना पिंड संख्या में बहुत कम और छोटे थे (चित्रा 3 डी, एच, एल): - डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण के 12 सप्ताह 10 से पीछा - एक FGFR अवरोधक के 12 सप्ताह 10 चूहों के बाद। डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण के 12 सप्ताह 10 से पीछा - - 10 के बाद चूहों प्लेसबो के 12 सप्ताह: कई बड़े पिंड दिखाई दे रहे हैं (चित्रा 3 पी) इन पोस्ट-प्रेरण समय बिंदु पर देखा के समान है।
चित्रा 1. सूक्ष्म सीटी पहचानता पूर्व प्रेरण फेफड़े असामान्यताएं। सभी चूहों डॉक्सीसाइक्लिन प्रेरण की दीक्षा से पहले सूक्ष्म सीटी के साथ जांच की गई। जब फेफड़ों असामान्यताओं का पता लगाया गया, चूहों ऊतकीय पुष्टि के लिए euthanized थे। (ए) एक सामान्य फेफड़ों के लिए प्रतिनिधि सूक्ष्म सीटी स्कैन छवियों, (सी) एक atelectatic क्षेत्र के साथ फेफड़ों, (डे) emphysematous bullae और (जीएच) एक असामान्य गांठदार छाया के साथ फेफड़ों के साथ फेफड़ों। Histological मूल्यांकन सूक्ष्म सीटी निष्कर्षों की सटीकता की पुष्टि की: (एफ) कई emphysematous क्षेत्रों (बी) के सामान्य फेफड़ों के ऊतक विज्ञान; और मैं) कई ट्यूमर पिंड। स्केल पट्टी: 200 माइक्रोन।53904fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. सूक्ष्म सीटी कि 10 सप्ताह तो सूक्ष्म सीटी के साथ फिर से मूल्यांकन किया है, जिसके बाद वे ऊतकीय मूल्यांकन के लिए euthanized थे के लिए एक साफ पूर्व प्रेरण स्कैन डॉक्सीसाइक्लिन चाउ खिलाया गया पता चला है प्रेरण। चूहे के बाद ट्यूमर पिंड के विकास की पहचान करता है। दो अलग अलग चूहों से प्रतिनिधि सूक्ष्म सीटी स्कैन छवियों कई गांठदार छाया 10 सप्ताह डॉक्सीसाइक्लिन चाउ की शुरुआत के बाद की उपस्थिति दिखाने के लिए। (ए, डी) पूर्व प्रेरण साफ फेफड़े, (बी, ई) उसी स्थिति स्कैन छवियों के विकास दिखा कई पिंड (लाल तीर)। छोटे पीले तीर अलग समय बिंदुओं पर एक ही स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल संरचनात्मक स्थलों को इंगित। (सी, एफ) सूक्ष्म सीटी स्कैन थे ग में देखा पिंडफेफड़ों के histological वर्गों में onfirmed। स्केल पट्टी:। 200 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. सूक्ष्म सीटी पहचानता परिवर्तन ट्यूमर पिंड में उपचार। चूहों प्रतिक्रिया में साफ है कि पूर्व प्रेरण स्कैन से पता चला है 10 सप्ताह के लिए डॉक्सीसाइक्लिन चाउ खिलाया गया, और फिर एक के बाद प्रेरण सूक्ष्म सीटी प्रदर्शन किया गया था। इसके बाद, वे 10 सप्ताह के लिए FGFR अवरोध AZD4547 दिलाई गई और सूक्ष्म सीटी (बाद इलाज) के साथ फिर से मूल्यांकन किया है। चूहों पर नियंत्रण के बजाय प्लेसबो FGFR अवरोध दिलाई गई चिकित्सकीय हस्तक्षेप के वास्तविक प्रभाव स्पष्ट करने के लिए। अंत में, चूहों ऊतकीय मूल्यांकन के लिए euthanized थे।
चार अलग-अलग चूहों से प्रतिनिधि सूक्ष्म सीटी स्कैन छवियों। (ए, ई, मैं, एम) (बी, एफ, जे, एन) एक ही चूहों से स्कैन। सभी एकाधिक पिंड से पता चला है (लाल तीर, लाल अंडाकार एक क्षेत्र है कि पूरी तरह से पिंड द्वारा shadowed गया था घेरे रहते हैं)। (सी, जी, कश्मीर) पूरी गायब या दिखा FGFR अवरोध के साथ इलाज के लिए एक अतिरिक्त 10 सप्ताह के बाद ही चूहों से स्कैन पिंड के आकार में उल्लेखनीय कमी। (ओ) नियंत्रण समूह है कि ट्यूमर पिंड 'आकार और संख्या में वृद्धि हुई है अवरोध के बजाय एक placebo दिलाई FGFR का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक नियंत्रण माउस से स्कैन करें। छोटे पीले तीर अलग समय बिंदुओं पर एक ही स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल संरचनात्मक स्थलों को इंगित। (डी, एच, एल) histological वर्गों गुत्थी आकार और संख्या में उल्लेखनीय कमी की पुष्टि की (2 सी और एफ चित्रा की तुलना)। (पी) prese शोकई ट्यूमर पिंड के nce जब प्लेसबो दिलाई। स्केल पट्टी:। 200 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यहां फेफड़ों असामान्यताओं के वास्तविक समय की पहचान और ट्यूमर पिंड के विकास और फेफड़ों के कैंसर के पशु मॉडल में उपचार के जवाब वैज्ञानिकों ने फेफड़ों के कैंसर से संबंधित प्रयोगों अधिक योजना के लिए चलाये जा रहे हैं सक्षम हो जाएगा की निगरानी के लिए वर्णित सूक्ष्म सीटी आधारित पद्धति सटीक और कुशल प्रयोगों जबकि समय और संसाधनों की बचत। हम पहले से ही उद्देश्य के 6 के लिए एमआरआई का इस्तेमाल किया है। स्कैन और एमआरआई के साथ फेफड़ों पिंड का पता लगाने के लिए सीमा की स्पष्टता सूक्ष्म सीटी इस अध्ययन 6 में वर्णित स्कैन के साथ उन लोगों के लिए अवर थे।
पिछले अध्ययनों से पता है कि (विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि और ट्यूमर प्रेरण के तरीकों के साथ) समान फेफड़ों adenocarcinoma चूहों मॉडल का इस्तेमाल किया जाहिर है कि कई नुकसान कर सकता है या सुधार से बचा वे सूक्ष्म सीटी स्कैनिंग 9,10 इस्तेमाल किया था कर दिया गया है था। वे किसी भी पूर्व प्रेरण फेफड़ों असामान्यताएं या पिंड की पहचान के लिए कोई मतलब था, इस प्रकार confounding खतरे में डालअनुपयुक्त जानवरों के शामिल किए जाने से उनके परिणाम। उन्होंने यह भी शामिल होने के बाद या जंगली प्रकार चूहों में कैंसर की कोशिकाओं का प्रचार (माध्यमिक ट्यूमर को उत्पन्न करने के लिए) के बाद ट्यूमर के विकास पुष्टि करने के लिए कोई साधन नहीं था, इसलिए वे 4-8 महीने के लिए इंतजार करने के लिए फिर आँख बंद करके के histological पहचान के लिए चूहों euthanize था ट्यूमर। जब इन मॉडलों एक दवा की चिकित्सीय क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया, शोधकर्ताओं ने कई समूहों का आवंटन करना पड़ा ऊतक विज्ञान के साथ ट्यूमर पिंड पर उपचार के प्रभाव का पता लगाने के लिए और अधिक से अधिक प्रभाव के समय बिंदु की पहचान करने में सक्षम होने के लिए एक कालानुक्रमिक अनुक्रम में euthanized किया जाना है 11।
हमारे विधि की एक सीमा है, तथापि, धुंधला छाया है कि फेफड़ों में पिंड का पता लगाने के अस्पष्ट जब कुछ विदेशी तत्वों इंजेक्शन हैं intratracheally 7 (नहीं दिखाया डेटा) की उपस्थिति है। कुछ चूहों इंजेक्शन पदार्थ के लिए एक लंबे समय तक सूजन प्रतिक्रिया और इस reacti की छाया विकसित करने के लिए लग रहा थापर और साथ मध्य शोफ मौजूदा पिंड नकाबपोश। ऐसे मामलों में, एमआरआई के लिए एक विकल्प के रूप में करने की कोशिश की जा सकती है।
हाल ही में, अन्य इमेजिंग तौर तरीकों छोटे जानवरों में विभिन्न विकृतियों का आकलन करने के लिए शुरू किया गया है; bioluminescence इमेजिंग 12 और पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) की तरह 13 स्कैन। हमारे ज्ञान करने के लिए, इन चूहों इमेजिंग सिस्टम मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर का मूल्यांकन करने के लिए अभी तक इस्तेमाल नहीं किया गया है ताकि दक्षता का पता लगाने और छोटे जानवर एमआरआई और सूक्ष्म सीटी छवियों के साथ छवि स्पष्टता की तुलना में अभी तक संभव नहीं है। उपलब्धता और इन मशीनों की लागत उनके बड़े पैमाने पर उपयोग करने के लिए एक सीमित कारक हैं।
हम पूर्व प्रेरण स्क्रीनिंग में चूहों का लगभग 50% में फेफड़ों के असामान्यताओं का पता चला है और उसके अनुसार इन चूहों आगे के प्रयोगों से बाहर रखा गया। असामान्यताओं के इस उच्च घटना एक "टपका हुआ" FGF9 कुछ पशुओं में ट्यूमर गुत्थी के विकास में जिसके परिणामस्वरूप ट्रांस्जीन का परिणाम हो सकता हैपहले भी वे 14 प्रेरित कर रहे है। दरअसल, बाहर रखा जानवरों की लगभग आधा जब histologically जांच कई छोटे पिंड की उपस्थिति देखी गई। ये भी माउस जीनोम 14 में पड़ोसी जीन पर डाला transgene की एक न्यायपालिका प्रभाव की वजह से हो सकता है। असामान्यताओं के इन प्रकार के विकास के लिए कोई Sftpc-rtTA और Tre-Fgf9-IRES-EGFP डबल ट्रांसजेनिक चूहों और इस प्रकार अन्य फेफड़ों के कैंसर मॉडल इसी तरह की परिस्थितियों से पीड़ित हो सकता है के लिए विशिष्ट ढंग से कर रहे हैं। विषमता पर प्रकाश डाला गया की यह उच्च घटना भी अधिक सूक्ष्म सीटी का प्रयोग चूहों के पूर्व शामिल किए जाने की स्क्रीनिंग के महत्व। भोले जंगली प्रकार चूहों सूक्ष्म सीटी (चित्रा 1 ए) पर किसी भी असामान्य छाया से पता चला कभी नहीं।
अंत में, हम एक तरीका है कि सटीक पता लगाने और एक ग्रंथिकर्कटता माउस मॉडल के फेफड़ों में ट्यूमर पिंड के विकास की निगरानी के लिए एक छोटा सा जानवर सूक्ष्म सीटी मशीन कारनामे का वर्णन किया है। द्वाराइसे का उपयोग समय के साथ पिंड में परिवर्तन की निगरानी करने के लिए, और अधिक सटीक डाटा एकत्र किया जा सकता है, और एक लागत और समय कुशल समय बेशक अनुकूलित किया जा सकता है।
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Acknowledgments
यह काम एक ग्रांट-इन-एड JSPS KAKENHI से AEH (अनुदान संख्या 25461196) और टीबी के लिए (अनुदान नंबर 23390218 और 15H04833) और राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य अनुदान HL111190 की (DMO) द्वारा समर्थित किया गया। लेखकों पशु जीनोटाइपिंग और histological वर्गों की तैयारी के साथ मदद करने में उसके प्रयासों के लिए मियुकी यामामोटो स्वीकार करना चाहते हैं। हम तकनीकी सहायता और अभिकर्मकों के लिए सहयोगात्मक अनुसंधान संसाधन, स्कूल ऑफ मेडिसिन, कीयो विश्वविद्यालय के लिए आभारी हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| micro-X-ray–computed tomography | Rigaku | R_mCT2 | |
| NanoZoomer RS Digital Pathology System | Hamamatsu | RS C10730 | |
| NDP.view2 Viewing software | Hamamatsu | U12388-01 | http://www.hamamatsu.com/jp/en/U12388-01.html |
| Isoflurane Vaporizer - Funnel-Fill | VETEQUIP | 911103 | |
| Induction chamber, 2 L W9.5 × D23 × H9.5 | VETEQUIP | 941444 | |
| Isoflurane | Mylan | ES2303-01 | |
| AZD 4547 | LC Labratories | A-1088 | |
| Pentobarbital | Kyoritsu | SOM02-YA1312 | |
| G24 cannula | Terumo | SP-FS2419 | |
| Paraformaldehyde | Wako | 163-20145 | |
| Microtome | Leica | RM2265 | |
| Doxycycline | SLC Japan/PMI Nutrition International | 5TP7 | |
| ImageJ software | National Institute of health | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Puralube vet ointment (Occular lubricant) | Dechra | NDC 17033-211-38 |
References
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