Summary
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स का उपयोग कर न्यूरोनल morphogenesis के अध्ययन immunofluorescence द्वारा neuronal और एपिडर्मल प्रोटीन के सीटू दृश्य में से लाभ। हम एक प्रक्रिया है कि लार्वा शरीर दीवार से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के द्वारा दा न्यूरॉन्स और आसपास के एपिडर्मल कोशिकाओं के immunofluorescence विश्लेषण में सुधार का वर्णन है।
Abstract
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स न्यूरोनल morphogenesis के तंत्र की जांच के लिए एक लोकप्रिय मॉडल हैं। दा न्यूरॉन्स एपिडर्मल कोशिकाओं वे अंदर आना और इस तरह immunofluorescence द्वारा दोनों neuronally और epidermally व्यक्त प्रोटीन के सीटू दृश्य में से उनके विश्लेषण लाभ के साथ संचार में विकसित करना। इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रयोगों के लिए लार्वा fillets तैयारी के पारंपरिक तरीकों बरकरार छोड़ मांसपेशियों के ऊतकों है कि शरीर की दीवार के सबसे शामिल हैं, इमेजिंग के लिए neuronal और एपिडर्मल प्रोटीन कई चुनौतियां पेश किया। यहाँ हम ड्रोसोफिला लार्वा fillets से मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल प्रोटीन की इमेजिंग कि अन्यथा मांसपेशियों के ऊतकों से छिप कर रहे हैं सक्षम बनाता है, शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार, और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग दा न्यूरॉन विकास का अध्ययन करने की सुविधा।
Introduction
ड्रोसोफिला लार्वा वृक्ष के समान द्रुमायण (डीए) न्यूरॉन्स आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उनके ज़िम्मा और कितनी आसानी से वे imaged किया जा सकता है की वजह न्यूरोनल विकास के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रदान करते हैं। इन संवेदी न्यूरॉन्स कई मार्ग है कि डेन्ड्राइट morphogenesis 1-3 पर नियंत्रण की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है।
दा न्यूरॉन्स के चार वर्गों (कक्षा मैं - चतुर्थ) लार्वा एपिडर्मिस अंदर आना। इन न्यूरॉन्स उनके dendrites मोटे तौर पर दो आयामी arrays 4,5 के गठन के साथ, तहखाने झिल्ली और एपिडर्मिस के बीच झूठ बोलते हैं। चार वर्गों में से, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स सबसे उच्च branched arbors और अन्य जानवरों के संवेदी न्यूरॉन्स की तरह, है, इन arbors के विस्तार पड़ोसी ऊतकों से आंतरिक कारकों के रूप में अच्छी तरह से cues, विशेष रूप से एपिडर्मिस, उनके विकास के लिए 6-9 की आवश्यकता है ।
अध्ययनों से पता है कि कैसे इस तरह के neuronal और अतिरिक्त न्यूरोनल तथ्य यह निर्धारित करने के लिएओआरएस immunofluorescence द्वारा बगल में प्रोटीन अभिव्यक्ति पता लगाने की क्षमता से डेन्ड्राइट morphogenesis लाभ नियंत्रित करते हैं। लार्वा के बाहरी छल्ली एंटीबॉडी के लिए अभेद्य है, लेकिन इस बाधा को आसानी से अच्छी तरह से स्थापित विच्छेदन तरीकों 10,11 के माध्यम से लार्वा fillets की तैयारी से दूर है। हालांकि, शरीर दीवार मांसपेशियों के ऊतकों कि तहखाने झिल्ली को सिर्फ आंतरिक निहित है दा न्यूरॉन्स और एपिडर्मल कोशिकाओं के दृश्य के प्रति कई चुनौतियों प्रस्तुत करता है। सबसे पहले, मांसपेशियों के ऊतकों, जो लाइनों शरीर दीवार की सबसे अधिक है, बहुत फ्लोरोसेंट संकेतों न्यूरोनल या एपिडर्मल ऊतक से चलाई obscures। यह काफी हद तक नमूने में शोर अनुपात करने के संकेत कम कर देता है। दूसरा, कई प्रासंगिक प्रोटीन मांसपेशियों के ऊतकों में के रूप में अच्छी तरह से न्यूरॉन्स या एपिडर्मिस में व्यक्त किया जा सकता है। यह मांसपेशियों व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति संकेत न्यूरॉन या एपिडर्मिस से एक प्रतिदीप्ति संकेत के आगे अस्पष्ट का पता लगाने की संभावना है। अंत में, माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकियों के क्षेत्र में प्रगति कोईउप विवर्तन संकल्प पर नमूने के डब्ल्यू परमिट इमेजिंग और प्रोटीन है कि न्यूरॉन्स में व्यक्त कर रहे हैं के स्थानीयकरण समझदार और एपिडर्मल कोशिकाओं 12,13 आसपास में विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है। हालांकि, शोर अनुपात और coverslip के लिए नमूना के करीब निकटता के लिए एक मजबूत संकेत से सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी लाभ के माध्यम से इमेजिंग। शोर अनुपात करने के लिए संकेत को कम करने के अलावा, लार्वा शरीर दीवार मांसपेशियों दूरी coverslip, जिससे बेहतर छवि संकल्प है कि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के तरीकों के साथ प्राप्त किया जा सकता सीमित करने से दा न्यूरॉन्स। immunofluorescence विश्लेषण के लिए चुनौतियों के अलावा, मांसपेशियों के ऊतकों लार्वा शरीर दीवार में संवेदी न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए एक बाधा प्रस्तुत करता है। इसके हटाने इसलिए संवेदी न्यूरॉन्स 14 के neurophysiological हेरफेर फायदा होता है।
यहाँ ड्रोसोफिला लार्वा मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक विधि का वर्णन किया है। हम जानते हैं कि हमारे प्रोटोकॉल पी प्रदर्शितप्रोटीन के ermits immunofluorescence इमेजिंग कि अन्यथा मांसपेशियों के ऊतकों से छिप कर रहे हैं, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार, और बेहतर दा न्यूरॉन्स में प्रोटीन और सेलुलर संरचनाओं के स्थानिक रिश्तों भेदभाव करने के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग सक्षम बनाता है और एपिडर्मिस।
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Protocol
नोट: मांसपेशी को हटाने (चित्रा 1) के लिए प्रक्रिया लार्वा fillets तैयार करने के लिए पहले से वर्णित तरीकों में से एक संशोधन है। कदम है कि पूर्व में होना है और मांसपेशियों को हटाने का पालन संक्षेप में रेखांकित कर रहे हैं और पाठक अधिक विस्तृत विवरण के लिए पिछले काम 10, 11 के लिए जाना जाता है।
1. शीत खारा में काटना लार्वा
- ठंड HL3.1 खारा 15 या ठंड सीए 2 + मुक्त HL3.1 खारा 11 (1 टेबल) के एक काम के कमजोर पड़ने को तैयार है। डिश के तल को कवर करने के लिए अभी काफी ठंड खारा के साथ एक सिलिकॉन elastomer डिश में लार्वा रखें।
ध्यान दें: खारा के चुनाव के बारे में चर्चा देखें।
| 1x HL3.1 खारा (पीएच 7.2) |
| 5 मिमी HEPES |
| 70 मिमी NaCl |
| 1.5 मिमी 2 CaCl (सीए 2 + मुक्त खारा के लिए न आना) |
| 4 मिमी 2 MgCl |
| 10 मिमी 3 NaHCO |
| 5 मिमी trehalose |
| 115 मिमी सुक्रोज |
| बाँझ फ़िल्टर और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान |
| नोट: hemolymph कीट संरचना mimics |
तालिका 1. ठंड खारा की संरचना है।
- उदर पक्ष के साथ लार्वा स्थिति। लार्वा के उदर सतह पेट dentical बेल्ट और पूर्वकाल से पीछे करने के लिए चल रहे प्राथमिक लार्वा सांस की नली ट्यूब के द्वारा पृष्ठीय पक्ष द्वारा की पहचान की जा सकती है। पूर्वकाल पीछे दिशा में लार्वा बढ़ाकर और एक के लिए सिर और पूंछ पिनसिलिकॉन elastomer पकवान विदारक कीट पिन का उपयोग कर। उदर midline के साथ कटौती करने के लिए, एक छोर पर शुरुआत और अन्य की ओर से प्रगति ठीक विदारक कैंची का प्रयोग करें।
नोट: इस उन्मुखीकरण दा न्यूरॉन्स की आमतौर पर अध्ययन किया पृष्ठीय क्लस्टर बरकरार रखता है। - लार्वा के बाद खुला कट जाता है, के रूप में हालांकि एक किताब खोलने विदारक डिश के लिए चार कोनों पिन। हड़पने के लिए और सीएनएस, आंत, और श्वासनली सहित आंतरिक अंगों को दूर करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। कीट पिन समायोजित करें ताकि पट्टिका तना हुआ नहीं बल्कि ज़्यादा से ज़्यादा फैला है।
नोट: स्नायु कमानी सीमाओं पर शरीर की दीवार पर लंगर डाले जाते हैं। हालांकि मांसपेशियों शरीर दीवार के सबसे को कवर, वे पृष्ठीय midline के पास एक संकीर्ण क्षेत्र में अनुपस्थित रहे हैं।
2. स्नायु निकालना
- लार्वा, जहां मांसपेशियों के ऊतकों अनुपस्थित है के पृष्ठीय midline लगाएँ। एक भी संदंश शूल ऐसी है कि यह सपाट संभव अभिविन्यास में मांसपेशियों के ऊतकों के नीचे डाला जा सकता है स्थिति।
- पे शुरुवातपृष्ठीय midline, खंड के पूर्वकाल सीमा के निकट है, ध्यान से मांसपेशियों और एपिडर्मिस के बीच संदंश शूल स्लाइड, संदंश और एपिडर्मिस के बीच संपर्क को कम करने के ख्याल रख रही है।
- संदंश ऊपर की ओर खींचो एक लंगर बिंदु पर शरीर की दीवार को पेशी के लगाव तोड़ने के लिए। ब्याज की शेष अर्ध-खंड (एस) के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
नोट: इस प्रोटोकॉल प्रत्येक दा न्यूरॉन डेन्ड्राइट क्षेत्र के पीछे के संरक्षण का अनुकूलन। डेन्ड्राइट क्षेत्र के पूर्वकाल हिस्सा बनाए रखने के लिए, यह प्रत्येक खंड के पीछे अंत में संदंश शूल डालने के लिए सबसे अच्छा है। - कीट पिन ऐसी है कि लार्वा पट्टिका ज़्यादा से ज़्यादा सभी दिशाओं में फैला है फिर से समायोजित।
- पट्टिका फिक्स जबकि यह अभी भी 25 मिनट के लिए ठंड, हौसले से तैयार पीबीएस में 4% formaldehyde का उपयोग कर विदारक डिश के लिए टिकी है।
- पीबीएस में 5 बार कुल्ला।
- संदंश का प्रयोग सावधानी से शेष लंगर अंक से मांसपेशियों के ऊतकों को दूर करना, conta को कम करने के ख्याल रख रही हैएपिडर्मिस के साथ सीटी।
- खोलना और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब विदारक पकवान से पट्टिका को हटा दें। बाद के सभी धोने, अवरुद्ध, और immunofluorescence धुंधला कदम है, के रूप में पहले 11 में वर्णित प्रदर्शन करना।
3. माउंट लारवल पट्टिका
- पहले के आदेश में ठीक विदारक कैंची का उपयोग नमूने के रूप में संभव के रूप में फ्लैट बनाने के लिए सिर और पूंछ को हटा दें। पट्टिका coverslip का सामना करना पड़ के भीतरी सतह के साथ antifade mountant में एक coverslip पर पट्टिका माउंट।
- coverslip पर एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस और बढ़ते मध्यम तितर-बितर करने के लिए धीरे दबाएँ। खत्म खुर्दबीन स्लाइड पलटें और नेल पॉलिश का उपयोग स्लाइड पर coverslip सील। स्लाइड्स में कम से कम एक महीने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है।
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Representative Results
हम immunofluorescence प्रयोगों में शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार पटलमय जंक्शन प्रोटीन coracle (कोरा) और डिस्क-बड़े (Dlg) एक साथ चतुर्थ श्रेणी दा झिल्ली मार्कर के साथ लेबल न्यूरॉन्स के साथ सह-कल्पना करने के लिए मांसपेशियों को हटाने की प्रक्रिया की उपयोगिता का प्रदर्शन CD4- tdTomato।
कोरा पहले इलाकों जहां दा न्यूरॉन dendrites एपिडर्मल कोशिकाओं से घिरा है और कई पहचान एपिडर्मल कारकों में से एक है कि संघ में morphogenesis और दा न्यूरॉन के समारोह के साथ अध्ययन किया गया है 4,6-9,16 dendrites है रहे हैं की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। विरोधी DsRed साथ Immunostaining का पता लगाने के न्यूरॉन्स (लाल) और विरोधी कोरा एंटीबॉडी (हरा) मांसपेशी को हटाया (मांसपेशी बंद) के साथ लार्वा fillets पर प्रदर्शन किया गया था और मांसपेशियों के साथ बरकरार (पेशी पर)। हर हालत के लिए, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन के पीछे डेन्ड्राइट क्षेत्र एक लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन का उपयोग imaged किया गया था। छवियाँ आईडी का उपयोग कर प्राप्त किया गयादोनों स्थितियों के लिए entical इमेजिंग मापदंडों। हम इसके अतिरिक्त imaged वृद्धि हुई लेजर शक्ति का उपयोग मांसपेशियों के ऊतकों से हस्तक्षेप की भरपाई के लिए fillets पेशी पर।
पेशी बंद नमूने में, कोरा स्पष्ट रूप से चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन dendrites साथ रुक-रुक कर इलाकों में एपिडर्मल सेल सीमाओं पर पता लगाया जा सकता है, और चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन सोमा (चित्रा -2) रूपरेखा। इसके विपरीत, इन डोमेन के लिए अपनी स्थानीयकरण काफी हद तक (चित्रा 2A-2 बी) मांसपेशी पर नमूनों में छिप गया था, तब भी जब लेजर शक्ति बढ़ गया था। में पेशी पर नमूने, कोरा मुख्य रूप से मांसपेशियों, श्वासनली में कल्पना की गई थी, और neuromuscular जंक्शन (NMJ) है, जो मांसपेशियों को हटाने की प्रक्रिया का एक परिणाम के रूप में शरीर की दीवार से अलग हो जाते हैं। प्रतिदीप्ति संकेत इन ऊतकों से चलाई कोरा सेल सीमाओं एपिडर्मल करने और शरीर वाल की संकरी पट्टी में इलाकों डेन्ड्राइट करने के लिए, के अलावा localizes कि अधिकांश छिपपृष्ठीय midline, जहां मांसपेशी अनुपस्थित है पास एल। कोरा कि चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन सोमा की रूपरेखा पेशी पर नमूने (चित्रा 2A-2 बी) में कल्पना नहीं की गई थी। ऐसे Dlg रूप epidermally व्यक्त प्रोटीन भी उच्च पेशी अभिव्यक्ति है, के दृश्य, विशेष रूप से समस्याग्रस्त है। पेशी पर नमूने में, epidermis में Dlg का वितरण लगभग पूरी तरह से मांसपेशियों और NMJ (चित्रा 2 डी) से प्रतिदीप्ति से छिप गया था। पेशी हटाने के बाद, Dlg आसानी दा न्यूरॉन dendrites साथ रुक-रुक कर इलाकों में एपिडर्मल सेल सीमाओं पर पता लगाया है, और चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन सोमा (चित्रा 2 ई) की रूपरेखा तैयार की है। इस प्रकार, मांसपेशियों हटाने epidermally और neuronally व्यक्त प्रोटीन अन्यथा मांसपेशियों और जुड़े ऊतकों से छिप के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।
इसके अलावा, यह देखा गया है कि चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन मार्कर के प्रतिदीप्ति तीव्रता में कमी दिखाई पेशी पर filletsपेशी बंद fillets की तुलना में जब इमेजिंग पैरामीटर दो नमूने की तैयारी (चित्रा 2A, 2 सी) के बीच लगातार आयोजित किया गया। बढ़ी हुई लेजर शक्ति के साथ, चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन मार्कर के स्पष्ट प्रतिदीप्ति तीव्रता के नमूने पेशी बंद करने के लिए मिलान किया जा सकता है, लेकिन पृष्ठभूमि शोर (चित्रा 2 बी, 2 सी) की वृद्धि हुई थी। इसलिए, मांसपेशियों हटाने हमारे नमूने में शोर अनुपात करने के लिए संकेत सुधार।
अन्त में, हम सुधार मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के द्वारा प्राप्त की उप-विवर्तन संकल्प पर चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स की इमेजिंग के लिए लागू किया जा सकता है कि क्या परीक्षण किया। ऐसा करने के लिए, 3 डी संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) इमेजिंग प्रदर्शन किया गया था, लगभग 120 एनएम पार्श्व संकल्प 13 को प्राप्त होता है। confocal इमेजिंग साथ के रूप में, हम पहले समान इमेजिंग शर्तों के तहत और फिर लेजर शक्ति के अनुकूलन के बाद, कोरा और चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स के लिए immunostained पेशी पर पेशी और बंद पट्टिका, Expos तुलनाUre समय है, और मांसपेशियों पर नमूने के लिए छवि प्रसंस्करण। इसी तरह confocal माइक्रोस्कोपी के लिए, मांसपेशियों में बंद fillets (चित्रा 3 ए -3 सी) की तुलना में पेशी पर शोर अनुपात करने के लिए एक काफी हद तक कम संकेत मनाया गया। इसके अतिरिक्त, छवि पुनर्निर्माण के नमूने पेशी ऑफ में तेज दिखाई दिया। की तुलना में पेशी पर नमूने, कम स्पष्ट कलाकृतियों मनाया गया और कोरा डेन्ड्राइट इलाकों में अधिक आसानी से सुलझाया गया (चित्रा 3 बी, 3 सी)। डेन्ड्राइट झिल्ली पेशी बंद fillets में चौड़ाई में लगभग 114 एनएम पर मापा जा सकता है, लेकिन पेशी पर fillets (चित्रा 3 डी, 3E) में 272 एनएम विस्तृत हो दिखाई दिया। इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स के दृश्य के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के आवेदन सक्षम बनाता है।
चित्रा 1. स्नायु उठाने की प्रक्रिया का अवलोकन। लार्वा विच्छेदित और एक सिलिकॉन पर टिकी हैइलास्टोमेर पकवान विदारक। मांसपेशियों के ऊतकों को निकालने के लिए एक संदंश शूल मांसपेशियों और एपिडर्मल सेल परत के बीच डाला जाता है, एक खंड सीमा (2.2) के पास पृष्ठीय midline से शुरू। संदंश मांसपेशियों और शरीर की दीवार (2.3) के बीच लगाव तोड़ने के लिए ऊपर की ओर खींच लिया है। यह ब्याज के क्षेत्रों के लिए दोहराया है और फिर लार्वा formaldehyde (2.5) में तय हो गई है। निर्धारण के बाद, संदंश शरीर दीवार (2.7 - 2.8) से शेष मांसपेशियों के ऊतकों को अलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं लार्वा छल्ली और एपिडर्मिस लाल, नारंगी में चित्रित कर रहे हैं हरे रंग में चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स, और मांसपेशियों। (2.2) और (2.7) में insets एक भी लार्वा अर्ध-खंड के पार के अनुभागीय विचारों का प्रतिनिधित्व करते। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. स्नायु निकालना। (; एसी हरा) या Dlg (हरी; डे) मांसपेशियों के ऊतकों (ए, बी, डी) और मांसपेशियों के ऊतकों (सी, ई) के बिना के साथ पाया गया दा न्यूरॉन्स और कोरा की एपिडर्मिस इम्यूनोफ्लोरेसेंस के Confocal इमेजिंग बढ़ाता है। चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स GAL4 '477 ड्राइवर का उपयोग कर यूएएस सीडी 4 व्यक्त करने के लिए चिह्नित किया गया: tdTomato और एक विरोधी dsRed एंटीबॉडी (लाल) के साथ पाया। कोरा के लिए लेबल स्नायु-ऑन और मांसपेशियों में बंद नमूने पहली समान परिस्थितियों (ए, सी) के तहत एक confocal खुर्दबीन के साथ imaged थे और फिर पेशी हस्तक्षेप (बी) के लिए क्षतिपूर्ति के लिए बढ़ा लेजर शक्ति के साथ। Dlg के लिए लेबल स्नायु-ऑन और मांसपेशियों में बंद नमूने व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित की शर्तों के तहत imaged थे। सभी छवियों confocal जेड अनुमानों हैं। बीच (हरा) और नीचे (लाल) पैनलों व्यक्तिगत चैनल दिखाने; शीर्ष पैनल विलय कर दिया चैनल हैं। मांसपेशियों के ऊतकों की सीमा (धराशायी लाइनों), चतुर्थ श्रेणीदा न्यूरॉन सोमा (सियान तीर), कोरा और Dlg इलाकों (सफेद तीर), एपिडर्मल सेल सीमाओं (मैजेंटा तीर), NMJ (पीले तीर), और श्वासनली (नारंगी तीर) संकेत कर रहे हैं डेन्ड्राइट। स्केल बार = 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. स्नायु हटाने दा न्यूरॉन्स और epidermal कोशिकाओं। मांसपेशी बरकरार (ए, बी) और बाद मांसपेशियों को हटाने (सी) के साथ चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स में कोरा (हरा) के immunofluorescence का पता लगाने की इमेजिंग के सुपर संकल्प सक्षम बनाता है। चतुर्थ श्रेणी दा न्यूरॉन्स चित्रा 2 के रूप में चिह्नित किया गया स्नायु-ऑन और मांसपेशियों में बंद नमूने पहली समान परिस्थितियों (ए, सी) के तहत एक संरचित रोशनी माइक्रोस्कोप के साथ imaged थे। पेशी पर नमूना(ए) में वृद्धि हुई तो लेजर शक्ति और जोखिम समय के साथ फिर से imaged किया गया था पेशी हस्तक्षेप (बी) के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए। सभी छवियों जेड अनुमानों हैं। बीच (हरा) और नीचे (लाल) एसी के पैनल व्यक्तिगत चैनल दिखा। एसी के शीर्ष पैनल एक मर्ज है। एपिडर्मल सेल सीमाओं (मैजेंटा तीर), कोरा डेन्ड्राइट इलाकों (सफेद तीर), और एक छवि पुनर्निर्माण विरूपण साक्ष्य (पीला नोक) संकेत कर रहे हैं। बी और सी के नीचे पैनल में insets क्रमश: डी और ई के अनुरूप हैं। डेन्ड्राइट झिल्ली के स्पष्ट चौड़ाई पेशी पर (डी) और मांसपेशियों बंद (ई) के नमूनों में दिखाया गया है। स्केल सलाखों = 3 माइक्रोन (एसी) और 0.5 माइक्रोन (डी, ई)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।
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Discussion
यहाँ एक प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला लार्वा fillets से मांसपेशियों के ऊतकों के मैनुअल हटाने के लिए वर्णित है। इस प्रोटोकॉल पहले से लार्वा विच्छेदन तकनीक 10,11 वर्णित संशोधित करता है। बाद लार्वा एक सिलिकॉन elastomer डिश में विच्छेदित है, पृष्ठीय midline स्थित है। एक एकल संदंश शूल, उसके समतल संभव अभिविन्यास में, ध्यान से मांसपेशियों के ऊतकों और एपिडर्मिस के बीच, पृष्ठीय midline के पास डाला जाता है। संदंश धीरे ब्याज की प्रत्येक लार्वा क्षेत्र में एक लंगर बिंदु से अलग मांसपेशियों के ऊतकों को ऊपर की ओर खींच रहे हैं। लार्वा पट्टिका फिर ठंडे formaldehyde जिसके बाद संदंश फिर से उपयोग किया जाता है शेष लंगर अंक से मांसपेशी खींच दूर करने के लिए तय हो गई है।
यह मांसपेशियों को हटाने की प्रक्रिया के बाद निर्धारण की सम्पूर्णता प्रदर्शन करने के लिए आकर्षक है, हम पाते हैं कि बढ़ाकर पेशी, एक बार तय, चपटा प्रतिपादन रहता है और बारीकी से एक लंगर बिंदु से सेना की टुकड़ी के बाद भी एपिडर्मिस के लिए apposed,यह मुश्किल अंतर्निहित ऊतकों को नुकसान पहुँचाए बिना हेरफेर करने के लिए। इसके अतिरिक्त, हमारे अनुभव में, तय मांसपेशियों के ऊतकों भंगुर है और आसानी से आँसू, शरीर की दीवार से पूरी तरह हटाने को रोकने। इसके विपरीत, जब पेशी निर्धारण करने से पहले एक लंगर बिंदु से अलग है, यह शेष लंगर बात की ओर निर्धारण के दौरान अनुबंध, ऊतक स्टब्स कि और अधिक आसानी संदंश से पकड़ा जा सकता है और लार्वा शरीर दीवार से निकाला छोड़ने होंगे।
क्रम में सबसे अच्छा नमूनों की रक्षा में, काफी देखभाल की मांसपेशी को हटाने की प्रक्रिया के दौरान संदंश और एपिडर्मिस के बीच संपर्क को कम करने के लिए लिया जाना चाहिए। नतीजतन, हमारे प्रोटोकॉल पहले से वर्णित विच्छेदन तकनीक 10,11 करने के लिए कई मिनट जोड़ सकते हैं। ऊतक गिरावट से बचने के लिए, कि निर्धारण करने से पहले विच्छेदित कर रहे हैं लार्वा की संख्या सीमित किया जाना चाहिए कि इस तरह के गुजरे समय मिनट कोई 25 से अधिक है। इसके अतिरिक्त, हम संदंश के कई जोड़े का परीक्षण करने की सिफारिश - एक ही मो संदंशडेल आकार और तीव्रता में काफी भिन्न हो सकते हैं - और हद को एडजस्ट जो fillets ऊतक संरक्षण और विच्छेदन की गति में सुधार करने के क्रम में पेशी हटाने से पहले फैला रहे हैं करने के लिए।
अन्त में, हम लार्वा विच्छेदन के दौरान बनाम मानक HL3.1 खारा सीए 2 + मुक्त HL3.1 खारा के उपयोग के साथ प्रयोग करने की सिफारिश। कैल्शियम के अभाव में, लार्वा मांसपेशियों में संकुचन बहुत कम हो जाता है। इस प्रकार, लार्वा fillets जब सीए 2 + मुक्त HL3.1 खारा में विच्छेदित हेरफेर करने के लिए आसान हो सकता है। हालांकि, हम यह है कि मांसपेशियों के संकुचन मांसपेशियों और एपिडर्मिस के बीच जगह बनाता है और जब तक एपिडर्मिस को होने वाले नुकसान के जोखिम को कम यह इन ऊतकों के बीच संदंश की प्रविष्टि की सुविधा कर सकते हैं। नतीजतन, मानक HL3.1 एपिडर्मिस और दा न्यूरॉन्स की अखंडता बनाए रखने के लिए बेहतर हो सकता है। हम अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए या तो खारा और विकल्प के साथ उपयोगकर्ता के लिए छोड़ दिया है।
जबकि हमारे प्रोटोकॉल बढ़ जाती हैअवधि और पहले से वर्णित विच्छेदन तकनीक 10,11 की जटिलता, यह कई सुधार कि इमेजिंग लार्वा संवेदी न्यूरॉन्स और एपिडर्मल कोशिकाओं के लिए उपयोगी होते हैं प्रदान करता है। सबसे पहले, यह neuronally और epidermally व्यक्त प्रोटीन है कि अन्यथा मांसपेशियों के ऊतकों से छिप कर रहे हैं की इमेजिंग परमिट। दूसरा, यह शोर अनुपात करने के लिए प्रतिदीप्ति संकेत सुधार। अंत में, यह दा न्यूरॉन्स और एपिडर्मिस में प्रोटीन स्थानिक रिश्तों के बेहतर भेदभाव के लिए सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का उपयोग सक्षम बनाता है। सुधार इमेजिंग गुणवत्ता कि हम मांसपेशी को हटाने के बाद निरीक्षण की संभावना कम हो फोटोन अवशोषण और बिखरने के साथ ही नमूना और coverslip के बीच कम दूरी का परिणाम है। हालांकि यहां प्रदर्शन नहीं, मांसपेशियों को हटाने की संभावना भी एपिडर्मिस और दा न्यूरॉन्स के लिए एंटीबॉडी का उपयोग, बेहतर बनाता है immunofluorescence की गुणवत्ता में सुधार। ग्रेटर एंटीबॉडी पहुंच Absen में प्रदर्शन इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो सकता हैएक ऊतक permeabilizing एजेंट 4 के सीई।
सुधार इस प्रोटोकॉल के उपयोग के द्वारा प्राप्त की neuronal और एपिडर्मल कारक है कि संवेदी न्यूरॉन्स में dendrite morphogenesis को विनियमित के अध्ययन के लाभ होने की संभावना हैं। इसके अलावा, मांसपेशी को हटाने के पहले लार्वा शरीर दीवार में संवेदी न्यूरॉन्स की electrophysiological अध्ययन में मदद की है और इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण भविष्य के अध्ययनों कि लार्वा संवेदी न्यूरॉन्स की neurophysiological हेरफेर को रोजगार के लिए उपयोगी हो सकता है। अन्त में, इस प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण में इस तरह के जीन अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए एकल दा न्यूरॉन्स के अलगाव के रूप में अन्य अनुप्रयोगों की दिशा में उपयोगी हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम माइक्रोस्कोपी पर उपयोगी विचार विमर्श के लिए गैरी Laevsky धन्यवाद। यह काम एनआईएच द्वारा वित्त पोषित किया गया R01GM061107 और R01GM067758 अनुदान एर्ग करने के लिए
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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