Summary
Estudos da morfogênese neuronal usando Drosophila arborização dendrítica larval (da) neurônios beneficiar na visualização situ de proteínas neuronais e epidérmicas por imunofluorescência. Descreve-se um processo que melhora a análise de imunofluorescência de Da neurónios e células epidérmicas vizinhas através da remoção de tecido do músculo da parede do corpo larval.
Abstract
Neurônios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) é um modelo popular para a investigação de mecanismos de morfogênese neuronal. Da neurónios desenvolver em comunicação com as células epidérmicas que inervam e, portanto, os seus benefícios de análise de visualização em in situ de ambas as proteínas neuronalmente e epidermicamente expressas por imunofluorescência. Os métodos tradicionais de preparação de filetes de larvas para experiências de imunofluorescência deixar intacto o tecido muscular que cobre a maior parte da parede do corpo, apresentando vários desafios à imagem latente proteínas neuronais e epidérmicas. Descrevemos aqui um método para a remoção de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo permite imagiologia de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído, e facilita o uso de microscopia de super-resolução para estudar da Desenvolvimento neurônio.
Introduction
Neurónios Drosophila larval arborização dendrítica (DA) fornecer um modelo válido para o estudo do desenvolvimento neuronal, devido à sua receptividade para a manipulação genética e a facilidade com que eles podem ser visualizados. Esses neurônios sensoriais têm sido fundamentais para a identificação de inúmeros caminhos que controlam dendrite morfogênese 1-3.
Quatro classes de da neurônios (Classe I - IV) inervam a epiderme larval. Estes neurônios situar-se entre a membrana basal da epiderme e, com as suas dendrites formando matrizes bidimensionais largamente 4,5. Das quatro classes, classe IV da neurônios têm os mandris mais altamente ramificada e, como neurônios sensoriais dos outros animais, a elaboração desses mandris exige fatores intrínsecos, bem como sugestões de tecidos vizinhos, em particular a epiderme, para o seu desenvolvimento 6-9 .
Estudos para determinar como tal neuronal e fato extra-neuronalRUP controlar benefício morfogénese dendrite de a capacidade de detectar a expressão de proteínas in situ por imunofluorescência. A cutícula externa da larva é impenetrável para os anticorpos, mas este impedimento é facilmente superada pela preparação de filetes de larvas através de métodos bem estabelecidos de dissecação 10,11. No entanto, o tecido do músculo da parede do corpo que se encontra logo interior para a membrana basal apresenta vários desafios para visualização dos neurónios de da e as células epidérmicas. Primeiro, o tecido muscular, que a maioria das linhas de parede do corpo, obscurece grandemente sinais fluorescentes que emanam a partir de tecido neuronal ou epidérmica. Isto reduz substancialmente a relação sinal-ruído na amostra. Em segundo lugar, muitas proteínas relevantes pode ser expresso em tecido muscular, assim como nos neurónios ou epiderme. Este sinal de fluorescência derivadas de músculo é provável que mais obscura a detecção de um sinal de fluorescência a partir do neurónio ou epiderme. Finalmente, os avanços nas tecnologias de microscopia semw autorização de imagem de amostras com resolução sub-difração e pode ser especialmente útil para discernir a localização de proteínas que são expressas em neurônios e em torno de células epidérmicas 12,13. No entanto, a imagem latente através de benefícios de microscopia de super-resolução de uma forte relação sinal-ruído e proximidade da amostra com a lamela. Além de reduzir a relação sinal-ruído, as distâncias da parede do corpo do músculo larval da neurônios da lamela, limitando assim a resolução da imagem melhorada que pode ser conseguida com métodos de microscopia de super-resolução. Além desafios para análise de imunofluorescência, tecido muscular apresenta uma barreira para gravação electrofisiológico de neurónios sensoriais na parede do corpo larval. Portanto, a sua remoção beneficia manipulação neurofisiológica de neurônios sensoriais 14.
Aqui, um método para a remoção manual de Drosophila tecido muscular larval é descrito. Nós demonstramos que nosso protocolo pErmits imagem imunofluorescência de proteínas que são de outra forma obscurecido por tecido muscular, melhora a relação sinal-ruído para a visualização de classe IV da neurônios, e permite o uso de microscopia de super-resolução para melhor discriminar relações espaciais de proteínas e estruturas celulares no da neurônios e a epiderme.
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Protocol
Nota: O procedimento para a remoção muscular (Figura 1) é uma modificação dos métodos anteriormente descritos para a preparação de filetes de larvas. As etapas que precedem e seguem a remoção do músculo são descritas de forma breve e o leitor é remetido ao trabalho anterior 10, 11 para descrições mais detalhadas.
1. Dissecar Larva em Saline Fria
- Prepare uma diluição de trabalho de frio solução salina HL3.1 15 ou Ca 2 + livre frio HL3.1 salina 11 (Tabela 1). Coloque a larva em um prato de elastómero de silicone com uma solução salina fria apenas o suficiente para cobrir a parte inferior do prato.
NOTA: Ver discussão sobre a escolha de uma solução salina.
| 1x HL3.1 salina (pH 7,2) |
| 5 mM de HEPES |
| NaCl 70 mM |
| 1,5 mM de CaCl2 (omitir de Ca2 + salina -livre) |
| 4 mM de MgCl2 |
| 10 mM de NaHCO3 |
| 5 mM de trealose |
| sacarose 115 mM |
| Filtro de esterilizar e armazenar a 4 ° C |
| imita Composição de insetos hemolinfa: Nota |
Tabela 1. Composição de Cold Saline.
- Posicionar a larva com o lado ventral para cima. A superfície ventral da larva pode ser identificada pelos cintos abdominais e dentical lado dorsal por os tubos traqueais larvais primárias que funcionam no sentido antero-posterior. Estique a larva no sentido ântero-posterior e fixar a cabeça ea cauda a umelastômero de silicone dissecar prato utilizando os pinos de insetos. Use tesouras de dissecação fino para cortar ao longo da linha média ventral, começando numa extremidade e progredindo no sentido da outra.
NOTA: Esta orientação preserva o cluster dorsal comumente estudada da neurônios. - Após a larva é cortado, fixar os quatro cantos para o prato de dissecação como se abrir um livro. Use uma pinça para agarrar e remover os órgãos internos incluindo o sistema nervoso central, do intestino, traqueia e. Ajuste os pinos de insetos para que o filé é tensa, mas não maximamente esticado.
NOTA: Os músculos são ancoradas à parede do corpo em limites segmentares. Embora músculos cobrir a maior parte da parede do corpo, que estão ausentes numa região estreita perto da linha média dorsal.
Remoção 2. Muscle
- Localizar a linha média dorsal da larva, onde o tecido muscular está ausente. A posição de uma única pinça pino de tal forma que ele pode ser inserido por baixo do tecido muscular na orientação mais plana possível.
- Começando àsa linha média dorsal, perto do limite anterior do segmento, deslize cuidadosamente o pino de uma pinça entre o músculo e da epiderme, tendo o cuidado para minimizar o contacto entre a pinça e epiderme.
- Puxar as pinças para cima para quebrar a fixação do músculo da parede do corpo em um ponto de ancoragem. Repetir este processo para o hemi-segmento (s) restante de interesse.
NOTA: Este protocolo otimiza preservação da posterior de cada campo dendrite da neurônio. Para preservar a parte anterior do campo dendrítico, que é melhor para inserir o pino de uma pinça na extremidade posterior de cada segmento. - Reajustar os pinos de insetos de modo a que o filé larval é maximamente se estendiam em todas as direções.
- Corrigir o filé enquanto ele ainda está preso ao prato de dissecação usando frio, preparados na hora formaldeído 4% em PBS durante 25 min.
- Lavar 5 vezes em PBS.
- Use uma pinça para retirar cuidadosamente o tecido muscular dos restantes pontos de ancoragem, tendo o cuidado para minimizar Contact com a epiderme.
- Soltar e remover o filete do prato de dissecação para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Executar todas as lavar, bloqueio e passos imunofluorescência posteriores, como descrito anteriormente 11.
3. Monte o larval Fillet
- Primeiro retire a cabeça ea cauda usando tesouras de dissecação finas, a fim de fazer a amostra o mais plano possível. Montar o filete sobre uma lamela em antifade montagem com a superfície interior do filete de frente para a lamela.
- Coloque uma lâmina de microscópio sobre a lamela e pressione suavemente para dispersar o meio de montagem. Virar a lâmina de microscópio mais e selar a lamela na lâmina usando unha polonês. As lâminas podem ser armazenadas a -20 ° C durante pelo menos um mês.
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Representative Results
Nós demonstrar a utilidade do procedimento de remoção do músculo para melhorar a relação sinal-ruído em experiências de imunofluorescência para co-visualizar as proteínas de junções septadas Coracle (Cora) e discos de grande (GMD) em conjunto com classe IV da neurônios marcados com o marcador de membrana CD4- tdTomato.
Cora foi previamente usada para identificar trechos onde a Dinamarca dendrites neuronais são delimitados por células epidérmicas e é um dos muitos fatores epidérmicos identificados que foram estudadas em associação com a morfogênese e função do neurônio da dendrites 4,6-9,16. Imunocoloração com anti-DsRed para detectar os neurônios (vermelho) e anticorpos anti-Cora (verde) foi realizada em filetes larval com músculo removido (músculo-off) e com o músculo intacta (músculo-on). Para cada condição, o campo dendrítico posterior da classe IV da neurónio foi fotografada utilizando um microscópio de laser confocal de varrimento. As imagens foram obtidas usando IDparâmetros de imagem entical para ambas as condições. Nós adicionalmente trabalhada músculo-em filetes utilizando aumento de potência do laser para compensar a interferência do tecido muscular.
Em amostras de músculo-off, Cora pode ser claramente detectado em limites de células epidérmicas, em intervalos intermitentes ao longo classe IV da neurônios dendrites, e delineando a classe IV da neurônio soma (Figura 2C). Em contraste, a sua localização, para estes domínios foi em grande parte obscurecido no músculo-em amostras, mesmo quando a energia do laser foi aumentado (Figura 2A-2B). No músculo-em amostras, Cora foi visualizado principalmente no músculo, a traqueia, e na junção neuromuscular (JNM), que se separa da parede do corpo como um resultado do procedimento de remoção muscular. O sinal de fluorescência que emana destes tecidos obscurecido a maior parte do Cora, que se localiza epidérmica limites da célula e dendrite tratos, exceto na faixa estreita do corpo wall perto da linha média dorsal, em que o músculo está ausente. Cora que descreve a classe IV da neurônio soma não foi visualizado no músculo-on amostras (Figura 2A-2B). Visualização de proteínas expressas epidermicamente que também têm expressão muscular elevada, como Dlg, é particularmente problemático. Em amostras de músculo-on, a distribuição de Dlg na epiderme foi quase completamente obscurecida por fluorescência a partir do músculo e JNM (Figura 2D). Após a remoção do músculo, Dlg é facilmente detectada em limites de células epidérmicas, em intervalos intermitentes ao longo da neurônio dendrites, e delineando a classe IV da neurônio soma (Figura 2E). Assim, a remoção do músculo permite a visualização de proteínas epidermicamente e neuronal expressos de outra forma obscurecido pelo músculo e tecidos associados.
Além disso, observou-se que a intensidade de fluorescência da classe IV da neurónio marcador apareceu reduzido no músculo-em filetesem comparação com filetes musculares-off quando parâmetros de imagem foram mantidas constantes entre as duas preparações de amostra (Figura 2A, 2C). Com o aumento da potência do laser, a intensidade de fluorescência aparente da classe IV da neurônio marcador poderia ser compensada com amostras de músculo-off, mas o ruído de fundo foi aumentada (Figura 2B, 2C). Portanto, a remoção do músculo melhora a relação sinal-ruído em nossas amostras.
Por último, testamos se as melhorias obtidas através da remoção de tecido muscular poderia ser aplicada a imagem da classe IV da neurônios com resolução sub-difração. Para fazer isto, microscopia de iluminação estruturada 3D (SIM) de imagem foi realizada, que atinge cerca de 120 nm resolução lateral 13. Tal como acontece com imagem confocal, comparamos filetes musculares-on e músculo-off imunocoradas por Cora e classe IV da neurônios, em primeiro lugar, em condições idênticas de imagem e, em seguida, depois de optimizar a potência do laser, exposiçõestempo ure, e processamento de imagem de amostras de músculo-on. Da mesma forma a microscopia confocal, observou-se um sinal substancialmente reduzida para relação de ruído no músculo-na em comparação com os filetes de músculo-off (Figura 3A-3C). Além disso, a reconstrução da imagem apareceu mais nítida nas amostras de músculo-off. Comparado ao músculo-on amostras, menos defeitos aparentes foram observadas e Cora extensões dendríticas foram mais prontamente resolvido (Figura 3B, 3C). Membranas Dendrite poderia ser medido aproximadamente 114 nm de largura em filetes musculares-off, mas parecia ser 272 nm de largura no músculo-on filetes (Figura 3D, 3E). Assim, o nosso protocolo permite a aplicação de microscopia de super-resolução para visualização de classe IV da neurônios.
Figura 1. Visão Geral do Procedimento de remoção do músculo. A larva é dissecado e fixado a um siliconeelastómero dissecando prato. Para remover o tecido muscular, um pino de pinça é inserida entre a camada epidérmica de células de músculo e, a partir da linha média dorsal, perto de um limite do segmento (2,2). A pinça é puxada para cima para quebrar a ligação entre a parede do músculo e do corpo (2.3). Isto é repetido para os segmentos de interesse e, em seguida, a larva é fixada em formaldeído (2.5). Após a fixação, pinças são usadas para separar o tecido muscular remanescente da parede do corpo (2,7-2,8) A cutícula larval e da epiderme estão representados na laranja, classe IV da neurônios em verde, e os músculos em vermelho. Inserções em (2.2) e (2.7) representam vistas em corte transversal de uma única hemi-segmento larval. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Remoção 2. MuscleMelhora Imagem Confocal de da neurônios ea epiderme Imunofluorescência de Cora. (Verde; AC) ou Dlg (verde; DE) foi detectado com o tecido muscular (A, B, D) e sem tecido muscular (C, E). Classe IV da neurônios foram marcados utilizando o condutor de GAL4 '477 para expressar UAS-CD4: tdTomato e detectado com um anticorpo anti-dsRed (vermelho). As amostras de músculo-on-off e músculo marcadas por Cora foram primeiro fotografada com um microscópio confocal sob condições idênticas (A, C) e, em seguida, com o aumento da potência do laser para compensar as interferências muscular (B). amostras de músculo-on e músculo-off rotulados para Dlg foram fotografadas em condições optimizadas individualmente. Todas as imagens são Z-projeções confocal. O meio (verde) e inferior (vermelho) painéis mostram canais individuais; os painéis de topo são os canais mescladas. O contorno do tecido muscular (linhas a tracejado), a classe IVda neurônio soma (setas ciano), Cora e Dlg dendrite tratos (setas brancas), limites de células da epiderme (setas magenta), MNJ (setas amarelas) e traquéia (setas laranja) são indicados. Barra de escala = 20 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Remoção Muscle Permite Super-resolução de imagem das da neurônios e células epidérmicas. Detecção de imunofluorescência de Cora (verde) na classe IV da neurônios com músculo intacto (A, B) e após a remoção do músculo (C). Classe IV da neurônios foram marcadas como na Figura 2 As amostras de músculo-on-off e musculares foram fotografadas com um microscópio de iluminação estruturada primeiro sob condições idênticas (A, C).; a amostra de músculo-onem (A) foi então re-trabalhada com tempos de aumento de potência de laser e de exposição para compensar a interferência muscular (B). Todas as imagens são Z-projeções. Os painéis do meio (verde) e inferior (vermelho) de AC mostrar canais individuais. O painel superior do AC é uma mesclagem. limites da célula epidérmica (setas magenta), intervalos dendríticos Cora (setas brancas), e um artefato de reconstrução de imagem (seta amarela) são indicados. As inserções nos painéis inferiores de B e C correspondem a D e E, respectivamente. A largura aparente da membrana dendrítico é mostrado no músculo-em (D) e (E) amostras de músculo-off. Barras de escala = 3 mm (AC) e 0,5 mm (D, E). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui é descrito um protocolo para a remoção manual de tecido muscular de Drosophila filetes larval. Este protocolo modifica previamente descrito técnicas de dissecação larvais 10,11. Depois que a larva é dissecado em um prato de elastómero de silicone, a linha média dorsal está localizado. Um único pino de pinça, na sua orientação mais plana possível, é cuidadosamente inserida entre o tecido muscular e da epiderme, perto da linha média dorsal. As pinças são delicadamente puxado para cima para o tecido muscular separados um ponto de ancoragem em cada segmento larval de interesse. O filé larval é então fixado em formol frio após o qual uma pinça são utilizados novamente para se afastar do músculo dos restantes pontos de ancoragem.
Embora seja tentador para executar a totalidade da remoção do músculo procedimento pós-fixação, descobrimos que músculo alongado, uma vez fixado, permanece achatada e estreitamente apposed para a epiderme, mesmo depois de desprendimento de um ponto de ancoragem, tornandotorna difícil de manipular sem danificar o tecido subjacente. tecido muscular Além disso, na nossa experiência, fixo é quebradiço e rasga facilmente, impedindo a sua remoção completa da parede do corpo. Em contraste, quando o músculo é separado de um ponto de ancoragem antes da fixação, ele irá contrair para o ponto de ancoragem restante durante a fixação, deixando topos de tecido que pode ser mais facilmente agarrado por fórceps e removido a partir da parede de corpo de larvas.
A fim de melhor preservar amostras, bastante cuidado deve ser tomado para minimizar o contato entre a pinça e a epiderme durante o procedimento de remoção muscular. Como resultado, nosso protocolo pode adicionar vários minutos para técnicas de dissecação anteriormente descritos 10,11. Para evitar a degradação do tecido, o número de larvas que são dissecados antes da fixação deve ser limitada de tal modo que o tempo decorrido é não mais de 25 minutos. Além disso, recomendamos testar vários pares de fórceps - forceps do mesmo model pode variar consideravelmente em forma e nitidez - e ajustando a medida em que os filetes são estirados antes da remoção do músculo, a fim de melhorar a preservação do tecido e velocidade de dissecção.
Por último, recomendamos experimentar com o uso de Ca2 + salina HL3.1 -livre contra soro fisiológico HL3.1 padrão durante a dissecção larval. Na ausência de cálcio, contracções musculares larvas são grandemente reduzidas. Assim, filetes larval pode ser mais fácil de manipular quando dissecado em Ca 2 + livre HL3.1 salina. No entanto, descobrimos que a contração do músculo cria espaço entre o músculo e epiderme, e isto pode facilitar a inserção de uma pinça entre estes tecidos, minimizando o risco de dano para a epiderme. Como resultado, HL3.1 padrão pode ser preferível para preservar a integridade da epiderme e da neurônios. Nós obter bons resultados com solução salina e a escolha é deixado para o utilizador.
Enquanto nosso protocolo aumentaa duração e a complexidade da dissecção com técnicas anteriormente descritas 10,11, que oferece vários melhoramentos que são úteis para imagiologia de neurónios sensoriais de larvas e as células epidérmicas. Primeiro, ele permite imagiologia de proteínas neuronal e epidermicamente expressas que são de outra forma obscurecido pelo tecido muscular. Em segundo lugar, melhora o sinal de fluorescência à relação de ruído. Por último, permite o uso de microscopia de super-resolução para a discriminação superior de relações espaciais de proteína em Da neurônios e da epiderme. A qualidade de imagem melhorada que observamos após a remoção do músculo é provável que o resultado da absorção reduzida de fótons e dispersão, bem como reduzida distância entre a amostra e a lamela. Embora não demonstrado aqui, a remoção muscular provavelmente também melhora o acesso do anticorpo para a epiderme e da neurônios, melhorando a qualidade de imunofluorescência. Uma maior acessibilidade de anticorpo pode ser particularmente útil para protocolos de imunofluorescência realizadas no Absence de um tecido agente 4 permeabilização.
As melhorias obtidas pela utilização deste protocolo são susceptíveis de beneficiar estudos sobre os fatores neuronais e epidérmicas que regulam a morfogênese dendritos nos neurônios sensoriais. Além disso, a remoção do músculo já havia facilitado estudo eletrofisiológico dos neurônios sensoriais na parede do corpo larval e uma versão modificada deste protocolo pode ser útil para futuros estudos que empregam a manipulação neurofisiológica de neurônios sensoriais de larvas. Por último, uma versão modificada deste protocolo pode ser útil para outras aplicações, tais como o isolamento de da neurônios individuais para perfis de expressão gênica.
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Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Agradecemos Gary Laevsky de votos discussões sobre microscopia. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01GM061107 e R01GM067758 para ERG
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
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