Summary
Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.
Abstract
Muitas funções endossomo precoce, particularmente carga proteína classificação e membrana deformação, dependem de patches de curto F-Actina filamentos nucleated na membrana da CDDP. Nós estabelecemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de genética e bioquímica manipulações. CDDP frações são preparadas pela flutuação em gradientes de sacarose de celulas que expressam a início CDDP proteína GFP-RAB5. Citosólica frações são preparadas a partir de lotes separados das células. Tanto CDDP e citosólica frações podem ser armazenadas congelados em nitrogênio líquido, se necessário. No ensaio, o CDDP e frações citosólica são misturadas, e a mistura é incubada a 37 ° C, sob condições adequadas (por exemplo, força iônica, reduzindo o ambiente). No momento desejado, a mistura de reação é fixo, e a F-Actina é revelado com faloidina. Polimerização e nucleação de actina são então analisados por microscopia de fluorescência. Aqui, nós relatamos que este ensaio pode ser usado para investigar o papel dos fatores que estão envolvidos na nucleação de actina na membrana, ou no subsequente alongamento, ramificação ou reticulação de filamentos de actina-F.
Introduction
Em células eucarióticas superiores, proteínas e lipídios são internalizados em endossomos iniciais onde ocorre a classificação. Algumas proteínas e lipídios, que são destinados a ser reaproveitado, são incorporados em regiões tubulares dos endossomos iniciais e então transportados para a membrana plasmática ou para o trans-Golgi network (TGN)1,2. Em contraste, outras proteínas e lipídios são seletivamente empacotados em regiões dos endossomos iniciais que exibem uma aparência multivesiculares. Estas regiões expandir e, após descolamento de membranas de CDDP cedo, eventualmente maduro em vesículas de transportadora CDDP livre ou corpos multivesiculares (ECV/MVBs), que são responsáveis para o transporte de carga para tarde endossomos1, 2.
Actina desempenha um papel crucial no processo de remodelação de membrana associado com capacidade de classificação CDDP e biogênese endossomo. Proteína ao longo dos caminhos de reciclagem para a membrana plasmática ou para o TGN depende o retromer complexo e as proteínas associadas. Esta classificação máquinas parecem ser atrelado à formação de reciclagem túbulos através de interações do complexo, o retromer com a vespa e cicatriz homólogo (lavagem) ramificado e complexo actina3,4,5 . Em contraste, as moléculas destinados a degradação, particularmente ativado receptores de sinalização, são classificadas em vesículas intraluminal (ILVs) pelo CDDP classificação complexos necessários para transporte (ESCRT)2,6, 7. Enquanto o possível papel de actina no processo de classificação de ESCRT-dependente não é conhecido, F-Actina desempenha um papel importante na biogênese de ECV/MVBs e no transporte, além de endossomos iniciais. Em particular, encontramos que anexina A2 vincula colesterol enriquecido regiões do endossomo precoce e juntamente com spire1, nucleates polimerização F-Actina. A formação da rede ramificada actina observada no endossomos requer a atividade de ramificação da proteína actina-relacionados (ARP) 2/3 complexo, bem como a moesin de proteína ERM e o emperramento do actínio proteína ciclina8,9.
Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio. Este ensaio tem sido usado anteriormente para investigar o papel da anexina A2 na nucleação de F-Actina e da moesin e ciclina na formação da CDDP actina redes8,9. Com este protocolo em vitro , a complexa série de reações que ocorrem na endossomos durante a polimerização de actina tornam-se receptivos à análise bioquímica e molecular das etapas sequenciais do processo, incluindo a nucleação de actina, linear polimerização, ramificação e reticulação.
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Protocol
1. soluções e preparações
Nota: todos os buffers e soluções devem ser preparadas em bidestilada (dd) H 2 O. Porque varia o estado de hidratação de sacarose, a concentração final de todas as soluções de sacarose deve ser determinada usando um refratômetro.
- Preparar fosfato salino sem cátions divalentes (PBS-): 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4 e 6,5 mM Na 2 HPO 4. Ajuste o pH para 7,4. Esterilizar em autoclave (1 ciclo a 121 ° C por 15 min) e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare uma solução stock de imidazol 300mm: 0,204 g de imidazol em 10 mL de DDQ 2 O.Adjust o pH para 7,4 a 4 ° C, utilizando HCl. filtro-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C. Buffer de
- preparar homogeneização (HB; preparar cerca de 100 mL): sacarose de 250 mM em imidazole de 3 mM. Ajuste o pH para 7,4 a 4 ° C, usando um medidor de pH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazene a 4 ° C. complemento a HB imediatamente antes da utilização, com um coquetel de inibidores de protease em concentrações finais correspondentes a leupeptin de 10 mM, 1 mM pepstatin A e 10 ng/mL aprotinina.
- Para os gradientes de flutuação de passo, prepare-se 62%, 39% e 35% de sacarose soluções em imidazole de 3 mM, pH 7,4, conforme descrito abaixo. Determinar precisamente a concentração final de todas as soluções de sacarose, usando um refratômetro.
- Preparar 100 mL de solução de sacarose de 62% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 80,4 g de sacarose em ddH 2 O pré aquecido a 35 ° C. adicionar 1 mL de solução estoque de imidazol 300mm e fill para 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poro e loja a 4 ° C.
- Preparar 100 mL de solução de sacarose de 35% no imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dissolver agitando 40,6 g de sacarose em ddH 2 O. adicionar 1 mL de solução-mãe de imidazol 300mm e preencher a 100 mL com DDQ 2 O. ajustar o pH para 7,4 em 4 ° C. Filter-esterilizar usando um 0,22 μm filtro de tamanho de poros e armazene a 4 ° C.
- Preparar 50 mL de 39% de sacarose em imidazole de 3 mM, pH 7,4. Dilua a solução de sacarose de 62% com a solução de sacarose de 35%. Loja a 4 ° C.
- Dissolver 3 g de paraformaldeído (PFA) por agitação em 100 mL de PBS-pré-warmed a 60 ° C, enquanto a adição de 1 M de NaOH gota a gota; ajustar o pH final a 7,4 usando NaOH. Filtro-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar a -20 ° C.
Atenção: 3% PFA é um reagente tóxico. - Solução preparar 1 M KCl. Dissolver 3,73 g de KCl por agitação em 50 mL de DDQ 2 O. Filter-esterilizar usando um filtro de tamanho de poros de 0,22 μm e armazenar à temperatura ambiente.
- Preparar 50 X concentrado de solução contendo 0,625 M Hepes pH 7.0 e 75 mm MgOAc 2 em ddH 2 O. alíquota e loja em -20 ° C.
- Preparar o meio de montagem. Misture mexendo 2,4 g de poly(vinyl alcohol) M w ~ 31.000 (PVA) com 6 g de glicerol. Adicionar 6 mL de DDQ 2 O e deixe pelo menos 2 h à temperatura ambiente. Adicionar 12 mL de 0.2 M Tris-Cl (pH 8,5) e calor para aproximadamente 53 ° C, com ocasionais, mexendo até dissolver o PVA.
- Esclarecer a solução por centrifugação a 5.000 x g por 20 min em temperatura ambiente. Recolher o sobrenadante e adicionar 2,5% (p/v) 1,4 - diazabiciclo-[2.2.2] octano (DABCO) para evitar o fotobranqueamento durante a detecção de fluorescência. Vórtice por cerca de 30 s para dissolver. Alíquota em tubos plásticos de 1,5 mL e loja em -20 ° C.
2. Cultura de células
- células HeLa cultura Dulbecco ' s Modified Eagle suplementado com soro fetal bezerro de 10%, 10% não aminoácidos essenciais, 10% L-glutamina e 1% penicilina-estreptomicina. Mantê-los a 37 ° C numa incubadora 5% CO 2.
- Transfect as células 24 h antes do experimento com GFP-RAB5 10, usando o reagente de transfeccao comercial de acordo com o fabricante ' instruções de s.
- Quando necessário, preparar CDDP fracções e citoplasma de células empobrecido de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse.
3. Preparação de fração CDDP
Nota: Este protocolo descreve a preparação simples de frações subcelulares contendo endossomos e outras membranas de luz. Se necessário, purificada endossomo frações também podem ser usados 11. Prepare 2 placas de Petri (10 cm diâmetro exterior; 57 cm 2) de confluentes expressando GFP-RAB5 como material de partida. O número total de células de HeLa confluentes em 2 pratos de Petri corresponde aproximadamente 2,5 x 10 7 células. Quando necessário, os endossomos pode também ser preparados de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão forma sua ou mutante da proteína de interesse, sempre expressando GFP-RAB5.
atenção: todas as etapas do protocolo de fracionamento devem ser executadas no gelo
- Coloque os pratos de Petri em uma placa de metal molhado em um balde de gelo plano e lave imediatamente as células duas vezes com 5 mL de PBS gelado....
- Retire todos os PBS - a última lavagem e adicionar 3 mL de PBS gelado-por prato. Células não devem secar durante a manipulação: se necessário, coloque o balde de gelo sobre uma plataforma oscilante para cobrir adequadamente as células com fluido.
- Remover mecanicamente as células em PBS desde os pratos de Petri usando um policial de borracha flexível (ou seja, raspador de celular caseiro). Raspe as células fora os pratos primeiro em um rápido movimento circular do lado de fora do prato, seguido de um movimento para baixo no meio do prato. Raspe suavemente para obter " folhas " de células anexadas. Delicadamente, transferir as células usando uma pipeta Pasteur plástica com uma grande abertura para um tubo polipropileno cônico de 15 mL no gelo
- Centrifugue por 5 min a x 175 g e 4 ° C.
- Gentilmente remover o sobrenadante (SN) e adicionar 1-3 mL de HB ao pellet. Usando uma pipeta Pasteur plástica com uma abertura larga, suavemente Pipetar acima e para baixo uma vez para Ressuspender as células.
- Centrífuga para 7-10 min a 1.355 x g e 4 ° C. delicadamente remova o SN.
- Executar homogeneização célula.
Nota: Condições devem ser suaves para que as membranas de plasma das células estão quebradas mas os endossomos permanecem intactos.- Adicionar um volume conhecido de HB com inibidores de protease para cada centrifugado (aproximadamente 100 μL por centrifugado). Suavemente utilizando uma micropipeta de 1.000 µ l, pipete acima e para baixo até que as células são resuspended. Não introduzir bolhas de ar.
- Preparar uma seringa de tuberculina 1 mL com agulha 22g previamente enxaguada com HB e livre de ar ou bolhas.
- Encha a seringa com a suspensão de células relativamente lentamente (para evitar a criação de bolhas de ar), coloque a ponta chanfrada da agulha contra a parede do tubo e expulsar a suspensão de células rapidamente ao cisalhamento fora das membranas de plasma das células anexadas.
- Tomar uma pequena alíquota do homogeneizado (aproximadamente 3 µ l) e diluir em 50 µ l de HB sobre uma lâmina de vidro. Mix e cobrir com uma lamela de vidro. Inspecionar o homogenate sob um microscópio de contraste de fase, equipado com um X de 20 ou 40 objetivo X.
Nota: Sob condições ideais, a maioria das células são quebradas, mas não são núcleos que aparecem como cinza escuro e redonda estruturas, ( Figura 1).
Repita o passo 3.7.3 e 3.7.4 até a maioria das células de - está quebrados; geralmente, 3-6 traços ascendentes e descendentes através da agulha são necessários. Manter uma pequena alíquota (10-30 µ l) do homogeneizado para determinação de proteína.
- Centrífuga homogeneizado por 7 min em 1.355 x g e 4 ° C.
Nota: após a centrifugação, a pelota (definida como a pelota nuclear; NP) contém os núcleos e o sobrenadante (definido como o sobrenadante pós-nucleares; PNS) contém o citoplasma e as organelas, liberadas após homogeneização e em suspensão livre. - Recolher cuidadosamente o PNS. Manter pequenas alíquotas (10-30 µ l) do PNS e NP para determinação de proteína e descartar o NP.
- Ajustar o PNS para 40,6% de sacarose, diluindo a solução de sacarose de 62% com PNS usando uma relação de 1:1.1 de PNS:62% de sacarose. Misture delicadamente mas completamente, sem criar bolhas de ar. Verificar a concentração de sacarose usando o refratômetro.
- Lugar o PNS em 40,6% sacarose no fundo de um tubo de ultracentrifugação. Cuidadosamente com 2,5 mL de solução de sacarose a 35% de sobreposição e encher o tubo de centrífuga com HB.
Nota: As soluções de sacarose devem ser em camadas para que interfaces são claramente visíveis. - Se os gradientes por 1h no ̴165, 000 x g e 4 ° C.
- Remova com cuidado a camada branca de lipídios no topo do gradiente. Em seguida, recolher a interface contendo endossomos, entre o HB e 35% de sacarose, utilizando uma micropipeta 200 μL com uma ponta de corte.
Nota: As frações CDDP pode ser usadas diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C. - Determinar a concentração de proteína das frações PNS e CDDP.
Nota: Esta concentração deve ser de pelo menos 100 µ g/mL. Aproximadamente 2,5 x 10 7 células cultivadas em 2 placas de Petri são necessárias para obter um PNS pelo menos 100 µ g/mL (ver observação acima).
4. Preparação do citosol
Nota: preparar 2 placas de Petri (10 cm de diâmetro; 57 cm 2) de células de HeLa confluentes como material de partida. Quando necessário, o citosol também pode ser preparado de células empobrecidas de uma proteína de interesse (ou seja, usando o RNAi ou CRISPR/Cas9) e/ou superexpressão uma sua ou forma mutante da proteína de interesse. Quanto ao protocolo de fraccionamento do endossomo, todas as etapas devem ser executadas no gelo
- Repita os passos 3.1-3.8.
- Colocar o PNS num tubo de centrífuga e se por 45 min em ̴250, 000 x g e 4 ° C.
- Cuidadosamente remover a camada branca por cima e coletar o SN (fração do citosol) sem perturbar o sedimento do microsome. Manter uma alíquota da fração citosol para determinação de proteína.
Nota: O citosol pode ser usado diretamente no ensaio de polimerização de actina em vitro ou pode ser aliquotadas no gelo, congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 ° C. - Determinar a concentração de proteínas do citosol.
Nota: Deve ser pelo menos de 3 mg/mL.
5. Ensaio de medição de polimerização de actina endossomo-dependente In Vitro
Nota: polimerização de actina endossomo-dependente pode ser realizada usando duas abordagens alternativas. Na primeira abordagem, os materiais são misturados em um tubo de ensaio, fixo e transferidos para uma lamela e analisados. Na segunda abordagem, descrita aqui, o ensaio pode ser realizado diretamente na câmara de imagem e pode ser fixo e analisado sem perturbação mecânica ( Figura 2). Nesta segunda abordagem, a mistura de ensaio não é transferida de um tubo de ensaio para uma lamela e assim permanece imperturbável, diminuindo o perigo das redes de F-Actina fisicamente ser perturbado durante a transferência. Além disso, esta segunda abordagem é compatível com uma análise de lapso de tempo de polimerização de F-Actina. Note-se que não há diferença na análise da polimerização de F-Actina foi observada com qualquer abordagem.
Nota: Uso corte dicas em todo o protocolo.
- Em um tubo de ensaio
- delicadamente mistura gelada purificada GFP-RAB5 endossomos (etapa 3) com o citosol (passo 4) em uma proporção de 01:10 (concentração de proteína) em um tubo de ensaio cónico 1,5 mL gelado.
Nota: Um experimento típico é realizado com aproximadamente 40-50 µ l. - Ajustar a mistura de reação gelada para concentrações finais de KCl (usando a solução KCl 1 M) de 125 mM, 12,5 mM Hepes e 1,5 mM MgOAc 2 (usando o 50 x solução estoque). Em seguida, ajuste a mistura com inibidores de protease para concentrações finais de 10 mM leupeptin, pepstatin de 1 mM A e 10 ng/mL aprotinina. Misture suavemente todos os componentes.
- Coloque o tubo de ensaio contendo a mistura de reação a 37 ° C, sem agitação e incubar durante o tempo desejado.
Nota: Normalmente, vai demorar cerca de 3 min para detectar a polimerização de actina no endossomos e 30 min. para a formação de uma extensa rede. - Ao tempo desejado (i.e., 3 min ou 30 min), parar a reação, colocando o tubo de ensaio no gelo e adicione 1/10 (vol: Vol) da solução pré-resfriada 3% PFA.
- Adicionar 0.3:10 (vol: Vol) de 200 unidades/mL (~6.6 μM) faloidina conjugada com corante vermelho-alaranjado para manchar a actina polimerizada.
- Lugar 12 μL da mistura para 12 μL de meio de montagem de PVA em um slide de vidro micro. Colocar um tampo de coverslipon de vidro 18 x 18 mm 2.
- Analisar a amostra com microscopia confocal.
- delicadamente mistura gelada purificada GFP-RAB5 endossomos (etapa 3) com o citosol (passo 4) em uma proporção de 01:10 (concentração de proteína) em um tubo de ensaio cónico 1,5 mL gelado.
- Na câmara de imagens
- para fazer câmaras de imagens microscópicas, utilize plasma limpa por 1 min para limpar uma lamela rodada 18-mm de diâmetro e um diâmetro de 35mm redondo equipado com um fundo de vidro de 20 mm placa de Petri (0.16-0,19 mm).
- Incubar as superfícies limpas com 1% de β-caseína por 20 min minimizar o emperramento da proteína para o vidro. Lave duas vezes com imidazol de 3 mM.
- Add endossomo e citoplasma, no mesmo ensaio mistura como em etapas 5.1.1 e 5.1.2, para um tubo de ensaio pré-resfriado 1,5 mL e complementar a mistura de ensaio com 0,1 μg/μL rodamina-actin.
- Ajustar o índice de refração final da mistura para 1.375 (26,5% de sacarose) usando a solução de sacarose de 39%.
Nota: Normalmente, o mesmo volume é adicionado; no entanto, isso tem que ser re-ajustada empiricamente dependendo da concentração de sacarose da fração coletada, determinada usando um refractomer, uma vez que a concentração de sacarose pode alterar um pouco de experimento para experimento. - Coloque a mistura sobre o prato de 35mm pré-tratamento (etapa 5.2.1) e cubra-o com a lamela de 18mm pré-tratamento (etapa 5.2.1).
- Coloque a câmara a 37 ° C, sem agitação.
- Analisar a amostra usando microscopia de fluorescência confocal.
6. Imagem Acquisition e análise de redes de actina
- aquisição de imagem
- adquirir as imagens em um microscópio confocal invertido.
Nota: Definições de aquisição de imagem foram otimizadas para um invertido microscópio confocal com um objectivo de óleo at 63 X 1,25. Ajustar a potência do laser (geralmente em torno de 50%) para alcançar uma boa relação sinal-ruído.
- adquirir as imagens em um microscópio confocal invertido.
- Quantificação da rede actina
- analisar as micrografias fluorescentes. Use o software opensource CellProfiler (2.1.1) 12 para medir a quantidade de actina por endossomo (alternativa de software pode ser usada).
- Em primeiro lugar, identificar endossomos como objeto primário usando o sinal de GFP-RAB5. Em seguida, quantificar a F-Actina associada com endossomos individuais usando a propagação do sinal de actina (corante vermelho-laranja conjugados faloidina) como um objeto secundário.
- Média e normalizar o número de material associado para cada objeto à condição controle.
- analisar as micrografias fluorescentes. Use o software opensource CellProfiler (2.1.1) 12 para medir a quantidade de actina por endossomo (alternativa de software pode ser usada).
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Representative Results
Para obter insights sobre a formação de manchas de F-Actina nas membranas de endossomo precoce, seguimos o protocolo descrito na Figura 2. Resumidamente, as células foram transfectadas com GFP-RAB5 e então endossomos iniciais foram preparados pelo fraccionamento subcelular. Estes purificada endossomos iniciais foram incubados com o citosol a fim de proporcionar a actina, em si, bem como outros fatores possivelmente envolvidos na reação. No final do período de incubação, a reação foi interrompida pela fixação da mistura. Uma amostra foi então coletada e depositada em uma lâmina microscópica. Finalmente, F-Actina foi revelado com a faloidina (Figura 3A). A nucleação de F-Actina no início CDDP membranas, bem como o processo de polimerização subsequentes ocorreu rapidamente. Na verdade, F-Actina já pode ser visualizado no endossomos dentro de 1min após o início da reação (Figura 3A). Estas estruturas de actina, que eram inicialmente curtas, rapidamente tornou-se mais tempo, ramificadas e ligados um ao outro levando à formação de uma rede entrelaçada de filamentos de actina (Figura 3A), presumivelmente refletindo a dinâmica de actina desequilibrada in-vitro. Taxas de nucleação e polimerização semelhantes foram observadas quando o ensaio foi realizado com actina purificada rodamina-rotulados, além do citosol da célula. Isso foi feito em pratos com fundo de vidro para que estruturas poderiam ser fotografadas diretamente, na ausência de qualquer perturbação (Figura 3B). No ensaio descrito aqui, endossomos iniciais nucleada de polimerização de actina novo seletivamente. Com efeito, a polimerização de actina não ocorreu quando a reação em vitro foi realizada na ausência de endossomos ou citosol. Assim, pode-se concluir que os endossomos iniciais possuem a habilidade fundamental para apoiar a nucleação e posterior polimerização de filamentos de actina9,11.
Para analisar a quantidade de actina polimerizada de endossomos, imagens adquiridas em momentos diferentes foram analisadas usando CellProfiler (Figura 4A). A quantidade de actina polimerizada por endossomo foi medida como a área de actina em torno de um único endossomo precoce. A taxa de polimerização de actina foi maior no início do processo e diminuiu com o tempo (Figura 4B). A rede de actina poderia ser analisada mais detalhadamente no início de pontos de tempo após o início da reação. A estes primeiros pontos de tempo, estruturas individuais contendo actina poderia ser ainda ser diferenciados uns dos outros. A fim de avaliar a organização complexa das redes de actina, foi contado o número de filamentos de actina, emanando cada endossomo (i.e., filamentos primários). Da mesma forma, o número de filamentos de actina provenientes de filamentos primários (ou seja, filamentos secundários) foram contado, bem como o número de todos os outros filamentos de actina que puderam ser identificados nas redes e que não se originou de endossomos ( ou seja, outros filamentos) (Figura 4-E. Uma vez que levavam os filamentos de actina, outros parâmetros, tais como o comprimento dos filamentos de actina individuais e número de endossomos ligados para os filamentos de actina mesmo, poderia ser facilmente calculado (Figura 4F).
Figura 1: Micrografia de contraste de uma célula HeLa Homogenate de fase. Após a homogeneização, o extrato foi montado entre uma lâmina microscópica e uma lamela. Para publicação, micrografias foram capturadas com um objetivo X 100 após imersão de óleo. Para inspeção de rotina, no entanto, o extrato do celular foi visualizado sob um 20 X ou um objectivo X 40 sem imersão de óleo. Dois exemplos de alta ampliação vistas sobre o homogenate são mostrados (A-B). Núcleos (estrela) aparecem como estruturas redondas escuro cinza-, sem restos de célula anexado. As setas apontam para os grânulos característicos de diferentes tamanho, forma e translucidez, que são liberados após homogeneização de célula e correspondem aos materiais intracelulares (i.e., organelas). Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: representação esquemática do protocolo. Descrição esquemática dos protocolos usados para preparar os extratos de CDDP (A) e citosol extratos (B) e monitorar a polimerização de actina de endossomos em vitro (C). Sobrenadante (SN), tampão de homogeneização (HB), pós-nucleares sobrenadante (PNS), pelota nuclear (NP) e paraformaldeído (PFA). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Nucleação e polimerização de F-Actina no início endossomos In Vitro. (A) endossomos purificado de Hela células expressando GFP-Rab5 (verde) e citosol de HeLa foram preparados separadamente. No ensaio, endossomos iniciais (EEs) foram misturados com citoplasma, e a mistura foi incubada para o indicado vezes. A mistura então foi corrigida, rotulada com faloidina (vermelha), a etiqueta de F-Actina e analisada por microscopia confocal de fluorescência. Barras: 10 µm (painel superior) e 5 µm (painel inferior). (B) EEs purificados de Hela, células expressando GFP-Rab5 (verde) e citosol de HeLa foram preparadas separadamente. Estes extratos de células foram incubados com rodamina-actina purificado (vermelho) para o indicado vezes nos aposentos de microscópio e foram analisados por microscopia confocal. Barra de escala = 10 µm. (C) o experimento foi realizado como em A. HeLa citosol (sem EEs) e HeLa endossomos (verde) rotulados com GFP-Rab5 (sem citosol) foram incubados separadamente (painéis esquerdos e meio) ou em conjunto (painel direito) para 30 min, fixo, rotulado com faloidina (vermelho), a etiqueta de F-Actina e analisados por microscopia confocal de fluorescência. Barra de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise da actina rede. (A) fluxo de trabalho de análise de CellProfiler. (B) número de actina polimerizada foram quantificados em relação ao número de endossomos usando o software CellProfiler. Dados são média ± no MEV mostrou (n = 3). Dados são meios ± s.d. (n = 3). 5 min contra 15 min (ns P= 0.0736), 5 min contra 30 min (* P = 0,0195) e 15 min e 30 min (ns P = 0.3129). (C)Endossomos iniciais (EEs) purificados de células Hela expressando GFP-Rab5 e HeLa citosol foram preparados separadamente, e o ensaio foi realizado como na Figura 2A. As amostras foram fixadas depois de 7 min. O painel do meio mostra a micrografia mesma, com a sobreposição dos traços de estruturas de F-Actina desenhados usando o plugin NeuronJ13 do software ImageJ. O painel direito mostra apenas os vestígios. Barra de escala = 10 µm. (D) representação da F-Actina estrutura sequência de numeração utilizada na quantificação com software ImageJ. (E) a quantificação do número de filamentos de actina, conforme definido em C-D. Dados são meios ± s.d. (n = 3). Ramos primários versus ramos secundários (ns P = 0.5262), ramos secundários contra outros ramos (ns P = 0.6815) e ramos primários contra outros ramos (ns P = 0.2254). (F), o comprimento da F-Actina estruturas e o número de EEs, por estrutura de actina são mostrados como exemplos de outros parâmetros que podem ser analisados com a quantificação definida em C-D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Actina desempenha um papel crucial na endossomo membrana dinâmica4,14. Informamos anteriormente que a polimerização e a nucleação de actina ocorrem em endossomos iniciais, formando pequenas manchas de F-Actina ou redes. Estas redes de F-Actina são absolutamente necessários para o transporte de membrana além endossomos iniciais ao longo da via de degradação. Interferir em qualquer etapa deste processo de nucleação e polimerização impede endossomo maturação e, portanto, a jusante dos transportes em direção a tarde endosomes andlysosomes9,11,15. Em particular, usamos o ensaio descrito acima para analisar as etapas sequenciais de polimerização de F-Actina no início endossomos e caracterizar o processo a nível molecular.
Nesses experimentos, endossomos iniciais são rotulados com GFP-RAB5 na vivo, purificados por fraccionamento subcelular e incubados em um tubo de ensaio na presença do citosol para permitir a F-Actina polimerização em vitro. No momento desejado, a reação é interrompida e a mistura de reação é transferida numa lâmina microscópica para a análise por microscopia de fluorescência, usando faloidina para rotular a F-Actina. Usando essa estratégia experimental, mostramos que a anexina A2 é necessária para a nucleação de F-Actina no início endossomos, juntamente com SPIRE1, enquanto ARP2/3 Medeia F-Actina, ramificando-se, como esperado. Também mostramos que moesin e ciclina são necessários para a formação de redes de F-Actina que medeiam a biogênese ECV/MVB e maturação ao longo da via de degradação de pilhas mamíferas9,11.
É importante ter em mente que, apesar de baixos níveis de ectopically expressa RAB5 não alteram endossomos para qualquer grande medida10, esta pequena GTPase é um regulador chave de início endossomo membrana dinâmica16,17 . Em alguns experimentos, portanto, pode ser apropriado para rótulo endossomos no ensaio usando protocolos alternativos. Por exemplo, endossomos iniciais podem ser convenientemente rotulados usando marcadores fluorescentes endocytosed, tais como epidérmico fator de crescimento ou transferrina4,14.
Também deve ser notado que é tecnicamente difícil de filamentos de actina individual de imagem com microscopia confocal convencional. Portanto, nos referimos às estruturas de F-Actina em todo o texto para descrever redes de actina no endossomos. Como consequência, sentimos que a formação de uma rede de F-Actina pode ser quantificada com mais precisão, medindo a área de superfície de fluorescência das redes ao invés de sua intensidade.
Não é fácil excluir totalmente a possibilidade de que a atividade de nucleação de actina observados em vitro é mediada por alguma outra estrutura ou organela que permanece ligada ao RAB5 endossomos durante a purificação. No entanto, tal contaminação é altamente improvável. Enquanto algumas organelas co purificam em gradientes devido às propriedades físicas semelhantes, eles não tendem a permanecer quantitativamente ligados uns aos outros depois da purificação. Além disso, a atividade de nucleação de actina estritamente depende anexina A24,14, que está presente no início endossomos contendo RAB514. Finalmente, descobrimos que estruturas de F-Actina associam seletivamente RAB5 endossomos na vivo e não são encontradas em outros endossomos ou em outras membranas celulares4,14. Em conclusão, é mais provável atividade de nucleação de actina associados RAB5 endossomos, desde que essa atividade purifica co e co localiza com RAB5 endossomos.
Neste ensaio, bem como em outros ensaios que reconstituir as reações bioquímicas complexas que controlam que a dinâmica de endossomos16 ou outras membranas18 e que é executada em um tubo de ensaio, é importante assegurar que a preparação dos extratos celulares são o ideais. As células devem ser homogeneizadas sob condições suaves para limitar os danos de endossomos e outras organelas, particularmente os núcleos e lisossomos. Além disso, endossomo frações devem ser mantidas no gelo sob condições que minimizem o estresse osmótico e iônico, bem como a polimerização de actina espontânea. Em adicionais, relativamente altas concentrações de fração endossomo (≥0.1 mg/mL) e citoplasma (≥3 mg/mL) são necessários para adequada polimerização de F-Actina no endossomos e detecção, conforme indicado nas etapas 3.13 e 4.4, respectivamente. Da mesma forma, é importante realizar o ensaio com um 01:10 proporção de endossomo ao citosol (proteína: proteína), como indicado no ponto 5.1.1. Finalmente, pipetagem após a polimerização de actina (ou seja, adicionar PFA e faloidina) deve ser feito cuidadosamente para evitar o colapso ou quebra da rede de actina.
Se necessário, o ensaio de polimerização de actina em vitro também pode ser realizado diretamente em um microscópio de imagem câmara, após a adição de rodamina-actina purificado para a mistura de ensaio, para limitar as perturbações mecânicas das redes de actina polimerizadas em endossomos (ver passo 5.2.3 e Figura 2). Neste caso, é melhor ajustar o extrato para difusão limitante de 26,5% (0,85 M) sacarose (índice refrativo de 1.375) e como browniano movimento (passo 5.2.3), e remover possíveis agregações de purificado rodamina-actina pela ultracentrifugação antes do uso. Nossas observações que moesin controla a formação de redes de F-Actina no endossomos foram totalmente recapituladas usando esta versão alternativa do nosso ensaio4,14.
Tanto a versão do nosso protocolo, o tubo de ensaio ou na câmara de imagem, é ideal para uma análise global da F-Actina nucleação e polimerização em endossomos. No entanto, não é fácil de seguir o processo de polimerização de actina através do tempo usando essa abordagem, em parte porque endossomos não são imóveis. Por conseguinte, não é fácil de controlar o crescimento de filamentos individuais e, portanto, para determinar a história da rede de actina. Por exemplo, pode ser difícil discriminar F-Actina ramificando de reticulação. No entanto, estamos confiantes de que condições de monitorar a polimerização de F-Actina em tempo real podem ser melhoradas na câmara de imagens por meio da otimização das condições para imobilizar endossomos. Da mesma forma, será interessante monitorar a polimerização de F-Actina de membranas artificiais usando componentes purificados. Na verdade, mostramos anteriormente que polimerização e nucleação de F-Actina podem ocorrer em lipossomas após ligação tfator de nucleação anexina A2 para o lipossoma BICAMADA11. Esta estratégia será útil para dissecar ainda mais o papel de lipídios específicos e proteínas no processo de nucleação e polimerização de F-Actina e caracterizar os componentes mínimos necessários para formar uma rede de F-Actina nas membranas CDDP. Finalmente, acreditamos que esta estratégia vai ser muito útil para estudar outros processos F-Actina-dependente que ocorrem nas membranas do endossomo, particularmente o recrutamento e mobilização da maquinaria retromer/lavagem.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Apoio recebido dos Swiss National Science Foundation; o programa Sinergia suíço; os polonês-Swiss investigação programa (PSPB-094/2010); o NCCR em biologia química; e LipidX da iniciativa Suíça SystemsX.ch, avaliada pela Swiss National Science Foundation (a G.). O. M. foi apoiado por uma comunhão de longo prazo EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22 μm | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10 cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-mL polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1mL Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18 x 18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μL yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1,000-μL Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-mL test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16 - 0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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