Summary
Zebrafish 배아는 화학 화합물의 독성을 평가하는 데 사용됩니다. 그들은 외부에서 개발하고 미묘한 자형기능 변화의 검출을 허용, 화학 물질에 민감하다. 실험은 배아를 함유하는 플레이트에 직접 첨가되는 소량의 화합물만을 필요로 하므로 테스트 시스템이 효율적이고 비용 효율적입니다.
Abstract
제브라피쉬는 질병 및 표현형 기반 약물 발견을 위해 널리 사용되는 척추동물 모델 유기체이다. 얼룩말 물고기는 많은 자손을 생성, 투명 한 배아와 빠른 외부 개발. 따라서 Zebrafish 배아는 소중하고 소량으로 사용할 수 있는 약물의 독성을 신속하게 평가하는 데에도 사용할 수 있습니다. 본 기사에서는, 1-5일 후 수정 배아를 이용한 화학 화합물의 독성을 효율적으로 스크리닝하는 방법에 대해 설명한다. 배아는 화합물의 다른 농도에 노출에 기인한 현상형 결함을 조사하기 위하여 입체 현미경에 의해 감시됩니다. 화합물의 반 최대 치명적인농도 (LC 50)도 결정 됩니다. 본 연구는 억제제 화합물의 3-6 mg을 요구했으며, 전체 실험은 기본 시설을 갖는 실험실에서 개인에 의해 완료되기까지 약 8-10 시간이 소요됩니다. 현재 프로토콜은 약물 발견의 초기 단계에서 화합물의 참을 수 없는 독성 또는 오프 타겟 효과를 식별하고 세포 배양 또는 다른 동물 모델에서 놓칠 수 있는 미묘한 독성 효과를 검출하기 위해 임의의 화합물을 테스트하는 데 적합하다. 이 방법은 절차 지연 및 약물 개발 비용을 줄입니다.
Introduction
약물 개발은 비용이 많이 드는 과정입니다. 단일 화학 화합물이 식품 의약국 (FDA)과 유럽 의약품 기구 (EMA)에 의해 승인되기 전에 수천 개의화합물이 10 억 달러 이상의 비용으로 선별됩니다 1. 전임상 개발 동안, 이 비용의 가장 큰 부분은동물 실험에 필요한 2. 비용을 제한하기 위해, 약물 개발 분야의 연구자들은 화학 화합물의 안전성 스크리닝을위한 대체 모델이 필요합니다 3. 따라서, 약물 개발의 초기 단계에서, 적합한 모델에서 화합물의 안전성 및 독성을 신속하게 평가할 수 있는 방법을 사용하는 것이 매우 유익할 것이다. 동물 및 세포 배양 모델을 포함하는 화학 화합물의 독성 스크리닝에 사용되는 여러 프로토콜이 있지만 검증되고 공통사용되는단일 프로토콜은 없다 4,5. zebrafish를 이용한 기존 프로토콜은 길이가 다양하며 편의요건6, 7,8,9에 따라 독성을 평가한 개별 연구자들이 사용하고 있습니다. 10개 , 11세 , 12.
최근, 제브라피쉬는 배아 개발 시 화학물질의 독성을 평가하는 편리한 모델로 대두되어있다6,7. 제브라피쉬는 화학화합물(13)의 평가에많은 내장장점을 갖는다. 심지어 대규모 실험은 제브라피쉬 여성이 200-300 개의 계란을 배치 할 수 있기 때문에 급속하게 생체 내생체 내에서 발달할 수 있으며 최대 1 주일 동안 외부 먹이가 필요하지 않으며 투명합니다. 화합물은 물 속으로 직접 첨가 될 수 있으며, 여기서 (화합물의 특성에 따라) 융모를 통해 확산되고 부화 후 피부, 아가미 및 유충의 입을 통해 확산 될 수 있습니다. 실험은 배아의 작은 크기 로 인해 풍부한 양의 화학 화합물(14)을 필요로하지 않는다. 제브라피시 배아를 개발하는 것은 정상적인 발달 결과를 달성하는 데 필요한 대부분의 단백질을 표현합니다. 따라서, 제브라피쉬 배아는 잠재적인 약물이 발달적으로 유의한 단백질 또는 신호 분자의 기능을 방해할 수 있는지 여부를 평가하는 민감한 모델이다. 제브라피쉬의 장기는 2-5 dpf15사이의 기능적이 되고, 배아 발달의 이 민감한 기간 동안 독성이 있는 화합물은 제브라피시 유충의 현상형 결함을 유발한다. 이러한 현상형 변화는 침습적 기술11없이 간단한 현미경을 사용하여 쉽게 검출될 수 있다. Zebrafish 배아는 세포 배양 모델16,17을사용하여 시험관내 약물 스크리닝에 비해 훨씬 더 큰 생물학적 복잡성으로 인해 독성 연구에서 널리 사용된다. 척추동물로서, 제브라피쉬의 유전적, 생리학적 구성은 인간과 비교할 수 있으며, 따라서 화학물질의 독성은 제브라피시와 인간8,18,19, 20개 , 21세 , 22. Zebrafish는, 따라서, 화학 화합물의 독성 및 안전성의 평가를 위한 약물 발견의 초기 단계에서 귀중한 도구이다.
본 기사에서는, 단일 연구자가 1-5일 후 수정(dpf) 제브라피시 배아를 사용하여 탄산 무수효소(CA) 억제제 화합물의 안전성 및 독성을 평가하는 데 사용되는 방법에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 프로토콜은 화학 억제제 화합물의 다른 농도에 제브라피시 배아를 노출하고 배아 발달 도중 사망과 현상형 변경을 공부하는 관련시킵니다. 화학 화합물에 대한 노출이 끝나면, 화학 물질의 LC50 투여량이 결정된다. 이 방법은 개인이 1-5 개의 시험 화합물을 효율적으로 선별 할 수 있게하고 방법을 가진 사람의 경험에따라 약 8-10 시간이 걸립니다 (그림 1). 화합물의 독성을 평가하는 데 필요한 각 단계는 도2에 설명되어 있다. CA 억제제의 독성 평가는 8 일이 필요하며, 짝짓기 쌍의 설정 (1 일째)을 포함한다; 사육 탱크에서 배아의 수집, 청소 및 28.5 °C 인큐베이터로 전송 (2 일); 24 웰 플레이트의 우물에 배아의 분포와 희석 CA 억제제 화합물의 추가 (3 일째); 유충의 phenotypic 분석 및 이미징 (일 4-8), LC의 결정50 투여량 (day8). 이 방법은 신속하고 효율적이며 소량의 화학 화합물과 실험실의 기본 시설만 필요합니다.
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Protocol
탐페레 대학의 제브라피시 핵심 시설은 국립 동물 실험 위원회(ESAVI/7975/04.10.05/2016)에서 부여한 설립 허가를 받았습니다. 제브라피시 배아를 이용한 모든 실험은 핀란드 동부 지방 정부, 탐페레 지역 서비스 단위 프로토콜의 사회 보건부에 따라 수행되었다 # LSLH-2007-7254/Ym-23.
1. 하룻밤 얼룩말 짝짓기 탱크 의 설정
- 2-5 성인 수컷 얼룩말과 3-5 성인 암컷 얼룩말어를 하룻밤 짝짓기 탱크에 넣습니다. (사육은 밤새 자동 어둡고 가벼운 사이클에 의해 아침에 유도된다).
- 두 개 이상의 화학 화합물의 독성을 평가하기위한 충분한 배아를 얻기 위해 여러 십자가를 설정합니다. 독성평가를 위해, 각 농도는 최소 20개의 배아23을필요로 한다.
- 동물에게 스트레스를 받지 않으려면, 동물이 번식을 위해 동일한 개인을 사용하기 전에 2 주 동안 휴식을 취하도록 하십시오.
2. 배아 수집 및 화학 화합물에 대한 노출을위한 플레이트 준비
- 배아를 수집, 다음날 정오, 미세 메쉬 여과기를 사용하여 E3 배아 배지 [5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2,0.33 mM MgSO4,및 0.1% w/v 메틸렌 블루]를 포함하는 페트리 접시에 옮니다.
- 플라스틱 파스퇴르 파이펫(예: 음식물 및 고체 폐기물)을 사용하여 이물질을 제거합니다. 스테레오현미경 의 밑에 배아의 각 배치를 검토하여 비수정/죽은 배아를 제거합니다(불투명한 외관으로 확인됨).
- 배아를 인큐베이터에 28.5°C로 유지합니다. 다음날 아침, 입체 현미경으로 배아를 검사하고 건강에 해롭거나 죽은 배아를 제거하십시오. 또한 기존 E3 매체를 신선한 E3 매체로 교체하십시오.
참고: 얼룩말 배아는 항상 실험실 조건하에서 28.5 °C에서 유지됩니다. - 1개의 배아를 배아를 덮기 위하여 충분한 E3 배지를 포함하는 24 웰 플레이트의 각 우물으로 조심스럽게 옮기는다.
3. 화학 화합물의 주식 용액 준비 및 희석 화합물을 우물에 분배
- 4°C에 저장된 억제제 화합물을 함유하는 바이알을 꺼내.
참고: 화합물의 특성에 따라 다른 온도에서 저장됩니다. - 화합물의 몇 밀리그램 (mg)을 정확하게 계량 할 수있는 분석 균형을 사용하여 화합물을 계량하십시오.
- 화합물의 용해도 특성에 기초하여 적절한 용매(예를 들어, E3 물 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 각 화합물에 대해 적어도 250 μL(100 mM)의 스톡 용액을 준비한다.
참고: 위의 단계는 편리한 시간에 실험시작 하루 전에 4 °C에 보관할 수 있습니다. - 15 mL 원심분리튜브에서 E3 물을 사용하여 스톡 솔루션(예: 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 150 μM, 150 μM, 500 μM)의 직렬 희석을 만듭니다.
참고: 농도 및 일련 희석의 수는 독성 수준에 따라 하나의 화합물에서 다른 화합물에 따라 다릅니다. - 배아를 함유하는 24개의 웰 플레이트에서, 파스퇴르 피펫과 1 mL 파이펫(1 dpf 배아 를 함유함)을 사용하여 우물에서 E3 물을 한 번에 제거한다.
- 각 우물에 각 희석제 1 mL을 분배하십시오 (낮은 곳에서 시작하여 더 높은 농도로 이동)를 24 웰 플레이트의 우물에 분배하십시오.
- 동일한 배아 배치에서 대조군을 설정하고 해당 양의 희석제를 추가합니다.
- 화합물의 이름과 농도를 가진 24웰 플레이트에 라벨을 부착하고 플레이트를 인큐베이터에 28.5°C로 유지한다.
4. 입체 현미경을 사용하여 배아의 현상형 분석 및 이미징
- 화학 화합물에 노출 된 후 매개 변수 24 시간 동안 입체 현미경으로 배아를 검사하십시오.
- 사망률, 부화, 심장 박동, 노른자 자루의 활용, 수영 방광 발달, 물고기의 움직임, 심낭 부종 및 신체 모양(23)과같은 매개 변수를 주목한다.
- 화합물의 각 농도에 노출된 애벌레를 취하여 금속 프로브를 사용하여 3% 고분자량 메틸 셀룰로오스를 함유하는 작은 페트리 접시에 옆으로 놓는다.
참고: 3 % 메틸 셀룰로오스 (고분자)는 미세한 검사에 필요한 방향으로 물고기를 포함시키는 데 필요한 점성 액체입니다. 이 액체에서 물고기의 방향을 지정하려면 금속 프로브가 필요합니다. - 카메라에 부착된 스테레오현미경을 사용하여 이미지를 찍습니다. 실험이 끝날 때까지 매일 별도의 폴더에 이미지를 저장합니다.
- 매일 테이블이나 인쇄된 시트에 모든 관측작은 테이블에 입력합니다.
- 화합물이 신경 독성인 경우, 4 내지 5 dpf 애벌레는 변경된 수영 패턴을 보여줄 수 있고, 비정상적인 운동 패턴을 나타내는 유충의 짧은(30 내지 1분) 비디오를 캡처하여 그러한 변화의 기록을 만들 수 있다.
- 화학 화합물에 5 일 동안 노출 된 후, 배아의 절반이 각 화학 물질의 절반 최대치명적인 농도 50 (LC 50)을 계산하기 위해 죽는 농도를 주목하십시오.
참고: LC50은 배아의 50 %가 화학 화합물에 노출 된 5 일 후에 죽는 농도입니다. 화합물23의각 농도의 독성을 시험하기 위해 최소 20개의 배아를 사용한다. - 적합한 프로그램을 사용하여 모든 농도에 대한 배아의 사망률에 대한 곡선을 구성합니다.
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Representative Results
독성 평가의 중요한 부분은 단일 실험에서 하나 또는 여러 화학 화합물의 서로 다른 농도를 테스트하는 것입니다. 처음에는, 독성평가를 위한 화합물을 선택하고, 각 화합물에 대해 시험할 농도의 수를, 그에 따라, 차트를 만든다(도 3). 우리는 샘플을 구성하기 위해 각 화합물에대한 고유 한 색상을 사용했다 (그림 3). 나중에 혼합을 피하기 위해 용매 내성 마커의 사용과 플레이트의 바닥 이나 측면에 라벨링하는 것이 중요합니다. 화합물이 억제제의 상이한 농도에 노출된 유충내의 어떤 현상형 결함을 유도하는 경우에, 결함은 1-5 dpf의 기간 동안 매 24 시간마다 기록된다 (그림4A,B, C,D). 500 μM의 농도에서 공지된 CA IX 억제제로 처리된 배아는 화학 화합물에 노출된 1-5일 동안 어떠한명백한 현상기 변화를 나타내지 않았다(도 4B). 그림 4C 및 도 4D는 3일째(화살표 머리), 곡선형 신체 구조(화살표), 활용되지 않은 노른자 자루 및 심낭 부종(화살표 머리)에서도 다양한 현상형 결함을 유도한 β-CA 억제물로 처리된 배아를 나타낸다. 및 화학 화합물 (화살표)로 처리 후 5 일 에서 유충에 이오스 낭이 없습니다. 또 다른 연구에서는, CA 억제제(도4E)로치료된 배아들은 이오스 낭과 수영 방광(화살표 머리)의 부재를 나타낸다. 우리의 연구 결과에서, (그림4C,D), 우리는 CA 억제제에 노출의 1 일 후에도 표현형 결함 (깨지기 쉬운 배아 및 착색의 부재)를 문서화했습니다. 자형질 분석은 억제제 화합물의 일부가 치명적이며 인간 사용을위한 약물로 개발 될 수 없다는 것을 보여주었다 (그림4C,D 및 표1).
실험은 배아 발달 동안 최소한의 또는 전혀 현상학적 변화를 유도하는 대표적인 화합물을 확인하고높은 LC50 용량을 보였다 (그림 5), 화합물이 추가 특성화에 안전하다는 것을 시사하고 잠재적으로 인간의 사용을위한 약물 후보로 개발 될 수있다16. 화합물에 노출된 유충의 스틸 영상을 살펴보면 자형질 결체가 나타나지 않았다(도4B). 그러나, 동일한 화합물은 CA 억제제에 노출된 지 5일 후에 애벌레에서 신경독성 및 유도운동실조인 것으로 나타났다(도 6). 이 표현형은 현미경의 밑에 제브라피시 유충의 수영 행동을 직접 관찰하여서만 검출될 수 있었습니다. 이러한 연구는 제브라피시 유충의 신경 발달이 화합물16,17에민감하다는 것을 시사한다.
그림 1: 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 신속한 스크리닝에 필요한 시간: 한 세트의 실험에서, 실습 경험이 있는 사람은 24웰 플레이트에 제브라피시 배아를 사용하여 약 5가지 화합물(각 화합물은 최소 6개의 희석을 필요로 함)을 스크리볼 수 있습니다. 총, 그것은 8 일의 기간 동안 LC50 결정을 수행 하기 위해 십자가의 설정에서 약 8-10 시간 걸립니다.
그림 2: 화학 화합물의 독성 평가의 분해를 나타내는 차트. 화합물의 독성 스크리닝은 8 일이 필요하며 5 단계로 나눌 수 있습니다. (1일차) 탱크에서 제브라피시 짝짓기 쌍의 설정으로 구성되어 있습니다. (2일차) 결합 탱크에서 배아를 페트리 접시로 수집한 다음 밤새 28.5°C 인큐베이터로 보관합니다. (3일차) 입체 현미경을 사용하여 배아를 검사하고 배아를 청소합니다. 배아를 24웰 플레이트에 분포시키고 시험 화합물의 희석을 추가한다. (4-8일차) 발달 결함에 대한 유충의 Phenotypic 분석. 수영 패턴 연구 및 LC50 결정은 화합물에 노출된 마지막 날에 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 독성 평가에 관여하는 실험의 개략적 프리젠테이션. 독성 평가는 화학 화합물, 희석 화합물 및 평가할 매개 변수에 대한 정보를 포함하는 표로 된 차트를 준비하는 것으로 구성됩니다. 15 mL 원심분리기 튜브에서 원하는 농도로 스톡 용액의 희석을(24웰 플레이트의 각 행에 첨가되는 하나의 튜브로부터의 희석). 시험 화합물의 이름, 각 행의 농도 및 노출 날짜가있는 방수 마커로 표시된 24 웰 플레이트. 3% 고분자량 메틸 셀룰로오스를 함유하는 작은 페트리 접시에 애벌레를 옮기고 배아의 검사 및 이미징. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 대조군 및 시험 화합물 처리군에서 유충의 자형질 분석의 예. (a) 어떤 화합물로도 처리되지 않은 대조군 애벌레의 Phenotypic 분석은 현미경 하에서 어떠한 현상형 결함도 나타내지 않았다. (B) 500 μM CA 억제제(탄산 무수효소 IX의 알려진 억제제)로 처리된 유충은 관찰 가능한 현상학적 결함을 나타내지 않았다. (C, D) β-CA 억제제와 함께 각각 250 μΜ 및 125 μM의 농도로 처리된 개발 유충. 화합물은 구부러진 바디, 심낭 부종 및 이용되지 않는 노른자 낭 (화살표 및 화살표 머리)와 같은 현상형 결함을 유도했습니다. 패널 A와 B는 Aspatwar 외16에서수정되었습니다. 패널 C, D 및 E는 이전에 게시되지 않은 이미지를 보여 주며, 이는 다른 현미경을 사용하여 수득되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 1-5 dpf제브라피쉬 유충을 사용하여 치명적인 농도 50(LC 50)의 결정. 제브라피시 배아를 이용한 독성 평가를 통해 연구자들은 실험이 끝날 때 화학 화합물의 최소 치명적인 농도를 결정할 수 있습니다. 화합물(공지된 CA IX 억제제)의 LC50 농도는 3.5 mM이었다. 높은 LC50 농도는 화합물의 추가 특성화를 허용한다. 이 그림은 Aspatwar 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 유충의 미처리(A) 및 억제제(B) 군 모두에서 수영 패턴 분석의 예. 패널 B에서 처리된 제브라피쉬 유충은 300 μM 시험 억제제 화합물(인간 탄산 무수효소 IX의 알려진 억제제)을 통해 비정상적인(ataxic) 운동 패턴(화살표 헤드)을 보였으며, 이는 화합물이 발달 중인 배아에서 신경독성을 유발한다는 것을 시사합니다. . 화살촉은 수영 하는 동안 꼬리의 정상적인 곡률을 가리킵니다. 패널 A에서 화살표는 수영하는 동안 꼬리의 일반 곡률을 가리킵니다. 이 그림은 Aspatwar 외16에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| CA 억제제 | 독성 검사 | LC50 | 생체 내 | 독성 CAI | 참조 |
| 카르바메이트 | 24 | 모든 | 1a | 3b | 24, 게시되지 않은 |
| 쿠마린스 | 10 | 모든 | - | 2 | 게시되지 않은 경우 |
| 니트로이미다졸스 | 2 | 모든 | 2 | 2c | 16 |
| 설포나미드 | 5 | 모든 | - | 3 | 25 |
| 총 | 41 | 모든 | 3 | 10 | - |
| a. 독성 스크리닝에 기초하여, 제브라피시 모델에서 마이코박테리움 마리눔의 억제를 위해 억제제에 사용되었다. b 치명적인 억제제, c300 μM 농도 이상의 신경 독성 | |||||
표 1: 스크리니드 화합물의 안전성 및 독성에 대한 요약. 독성 평가 실험은 연구원이 테스트 된 화학 화합물의 안전성에 대한 결론에 도달하는 데 도움이됩니다. LC50 농도는 추가 특성화를 위한 안전한 농도를 정의할 수 있게 합니다. 연구원은 화합물이 조사 중인 화합물에 배아의 노출의 24 시간 후에도 치명적인 지 결정할 수 있습니다. 이 예에서 신경 독성으로 인한 수영에 대한 미묘한 영향은 중요한 정보이며, 이는 추가 실험을 설정하는 데 도움이됩니다. 이에 따라, 독성 스크리닝에 기초하여, 생체내 의 특성화를위한 CA 억제제의 안전한 농도를 사용할 수 있었다 24.
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Discussion
배양된 세포를 이용한 시험관내 독성 시험은 시험 화합물에 의해 유도된 독성에 대한 제한된 정보를 제공하는 세포의 생존 및 형태학적 연구를 검출할 수 있다. 제브라피시 배아를 이용한 화학 화합물의 독성 스크리닝의 장점은 관련 모델 유기체에서 배아 개발 동안 전체 동물에서 화학적으로 유도된 현상형 변화를 신속하게 검출하는 것이다. 단백질 코딩 인간 유전자의 약 70%는 제브라피시 게놈25에서직교 에 대응되어 있다. 신호 전이 및 발달을 제어하는 유전적 경로는 인간과 제브라피시(26) 사이에 고도로 보존되며, 따라서, 화학화합물은 인간25에서유사한 독성 효과를 가질 가능성이 있다.
Zebrafish는 독성 연구의 최전선에 있으며 이미 물 샘플에서 독소를 검출하고 환경 독소의 작용 메커니즘과 동물27에미치는 영향을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. 이 문서에서는, 우리는 약물 발견의 초기 단계에서 잠재적 인 화합물의 독성을 평가하기 위해 제브라피시 배아 개발의 사용을 보여줍니다. 우리의 신속하고 다각적 인 독성 평가는 1) 배아 중 유기체의 표현형 (부화, otolith sacs, 심낭 부종, 노른자 낭 활용, 노토 코드 발달, 심장 박동, 수영 방광 발달, 운동)의 변화에 기초합니다. 5 일, 및 2) 치명적인 농도의 결정에 걸쳐개발 (LC 50). 실습 작업의 합리적인 시간 (8 일 동안 나누어 8-10 시간)이 절차를 사용하여 화합물의 독성 프로파일을 결정하기에 충분하다. 제한된 양으로 제공되는 새로 합성된 화합물의 경우, 독성은 최소 3 mg의 화합물을 사용하여 평가될 수 있다. 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 절차는, 따라서, 잠재적으로 인간 사용을 위한 약물로 개발될 수 있는 임의의 화합물의 독성 효과를 평가하는 신속하고 저렴한 방법이다.
배아 배치의 품질은 실험 결과에 큰 영향을 미칩니다. 계란의 품질 (수정속도 포함)은 번식 탱크 (0-4 hpf)에서 수집 한 직후에 명확하지 않습니다. 화합물을 추가하기 전에 실험을 위해 정상적으로 발달하는 배아만을 얻기 위해, 우리는 배아가 번식 탱크에서 수집 한 후 24 시간 동안 28.5 °C에 남아 있게합니다. 24 hpf 후, 어떤 죽은 또는 건강에 해로운 보이는 태아는 폐기. 이 외에도, 각 실험에서 배아의 모의 처리 그룹이 실험에 사용된 계란의 배치의 질을 더욱 제어하고 LC50을 정확하게 결정하기 위해 기준선 사망률을 확인하는 것이 바람직하다.
모의 처리 된 그룹은 또한 선택의 차량의 독성을 제어하는 데 필요합니다. 많은 화학 물질은 물에 불용성이며 DMSO는 종종 시험 화합물의 전달을위한 비히클로 사용됩니다. DMSO는 일반적으로 낮은 배아에 의해 잘 용납된다 (0.1%) 농도28. 때로는 화합물이 DMSO에서도 완전히 용해되지 않으며 용액이 흐려서 독성 평가를 어렵게 만듭니다. 이러한 경우, 화합물의 재고 용액을 완전히 용해및 투명하게 얻으려면, 0.1% NaOH의 드롭을 추가하면 문제가 해결될 것이다. 화합물의 독성을 정확하게 평가하기 위한 적절한 대조군을 설정할 필요가 있다. 다른 차량을 사용하는 경우, 그들의 고유 독성은 실험에 영향을 미칠 수 있습니다.
24 웰 플레이트의 각 웰은 1mL의 총 부피에 잠긴 1-10 개의 배아를 함유합니다. 시험 화합물은 소량에서만 유효하다면, 그것의 독성을 평가하기 위하여 우물 당 10의 배아까지 사용하는 것이 필요할 지도 모릅니다. 각 분석16,24,29에대해 우물 당 1 개의 배아만 사용하는 것이 좋습니다. 플레이트는 28.5°C 인큐베이터에서 5일 동안 보관된다. 때로는 유의한 증발이 주어진 웰(16)에서 화합물의농도에 현저한 변화를 일으키는 것으로 관찰된다. 모든 면에서 파라핀 필름으로 24 웰 플레이트를 밀봉하고 배아를 중간 우물에만 넣고 림을 따라 다른 우물을 물로 채우면 증발로 인한 문제를 피할 수 있습니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 24 웰 플레이트24,29에서화학 물질의 희석제의 증발을 관찰하지 않았다. 또한, 문제의 화합물이 주변 온도하에서 불안정한 것으로 알려진 경우, 신뢰할 수있는 결과를 위해 신선한 화합물로 물의 일일 변화가 필요합니다.
제브라피시 유충의 수영 패턴은 화합물에 노출된 지 5일 후에 분석된다. 5 dpf 유충을 포함하는 24 웰 플레이트의 웰은 웰의 제한된 크기로 인해 목적에 이상적이지 않습니다. 따라서 수영 패턴의 정확한 분석을 위해 유충은 E3 물 50 mL을 함유 한 페트리 접시로 옮겨야하며 분석 전에 2 분 동안 정착 할 수 있습니다. 본 연구에서는 안전성 및 독성을 위해 스크리너가 선별된 52개의 α-CA 및 β-CA 억제제 중 에서 만 2개의 억제제가 수영 패턴16에 미치는 영향을 보여주었으며, 우리의 경험에 기초하여 이 시험은 유충의 온화한 변통운동을 포함한 미묘한 변화를 검출할 수 있다.
이 연구는 현재 방법에 대한 유일한 제한은 물리적 손재주임을 입증했다. 사람의 기술이 연습으로 향상됨에 따라 이러한 우려는 반복을 통해 극복 할 수 있습니다. 전문 지식이 달성되면 제브라피시 배아를 사용하여 화합물의 평가는 윤리적이고, 쉽고, 효율적이며, 유익합니다. 따라서 당사는 제브라피시 배아를 이용한 이러한 신속한 분석이 약물 개발 초기 단계에서 생체 내 독성 스크리닝을 위한 인기 있는 도구가 될 것으로 기대합니다.
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Disclosures
저자에 의해 잠재적 인 이해 상충이보고되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 작품은 시그리드 주셀리우스 재단(SP, MP), 핀란드 문화 재단(AA, MH), 핀란드 아카데미(SP, MP), 오리온 파노스 재단(MH), 탐페레 결핵 재단(SP, MH 및 MP), 제인 과 아토스 에르코 재단(SP 및 MP)의 보조금으로 지원되었습니다. ). 우리는 항결핵 및 항암 제 개발 목적을 위한 안전성 및 독성 평가를 위한 탄산 아수드라아제 억제제를 제공한 이탈리아와 프랑스 협력자, 수푸란 교수 및 Winum 교수에게 감사드립니다. 아울릭키 레무스와 마리안 쿠슬라티에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 또한 제브라피시 사육과 배아 수집에 도움을 준 리나 메키넨과 한날리나 피포에게 감사를 표합니다. 우리는 진심으로 원고와 통찰력있는 의견의 비판적 평가 할란 바커에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well plates | Nunc | Thermo Scientific | |
| Balance (Weighing scale) | KERN | PLJ3000-2CM | |
| Balance (Weighing scale) | Mettler Toledo | AB104-S/PH | |
| CaCl2 | JT.Baker | RS421910024 | |
| Disecting Probe | Thermo Scientific | 17-467-604 | |
| DMSO | Sigma Aldrich, Germany | D4540 | |
| Falcon tubes 15 mL | Greiner bio-one | 188271 | |
| High molecular weight methylcellulose | Sigma Aldrich, Germany | M0262 | |
| Incubator for zebrafish larvae | Termaks | B8000 | |
| KCL | Merck | 1.04936.0500 | |
| Methyl Blue | Sigma Aldrich, Germany | 28983-56-4 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich, Germany | M7506 | |
| Microcentrifuge tubes | Starlab | S1615-5500 | |
| NaCl | VWR Chemicals | 27810.295 | |
| Paraffin Histoplast IM | Thermo Scientific | 8331 | |
| Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171 | |
| Petri dish | Thermo Scientific | 101R20 | |
| Petri plates | Sarstedt | 82.1473 | |
| Pipette (1 mL and 200 μL) | Thermo Scientific | 4641230N, 4641210N | |
| Plates 24-Well | Thermo Scientific | 142485 | |
| Steriomicroscope/Camera | Zeiss | Stemi 2000-C/Axiocam 105 color | |
| Vials (1.5 mL) | Fisherbrand | 11569914 | |
| Zebrafish AB strains | ZIRC | ZL1 |
References
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