Summary
نقدم بروتوكولا لاستخدام المجهري بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة التوزيع المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية في العين بشكل غير جراحي بعد الحقن تحت الملتحمة.
Abstract
الحقن تحت الملتحمة هو طريق جذاب لإدارة أدوية العين بسبب سهولة الوصول عبر الصلبة التي تتجاوز حواجز العين الأمامية ، مثل القرنية والملتحمة. في حين تم وصف الآثار العلاجية والحركية الدوائية للأدوية عند الحقن تحت الملتحمة في بعض الدراسات ، فإن عددا قليلا جدا منها يقيم التوزيع العيني للأدوية أو أنظمة توصيل الدواء (DDS). هذا الأخير أمر بالغ الأهمية لتحسين تصميم DDS داخل العين والتوافر البيولوجي للأدوية لتحقيق التوطين العيني المطلوب ومدة العمل (على سبيل المثال ، الحادة مقابل الطويلة). تثبت هذه الدراسة استخدام المجهر بالليزر البؤري الليفي البصري (CLM) لدراسة نوعية للتوزيع العيني للجسيمات الشحمية الفلورية في الوقت الفعلي في الفئران الحية بعد الحقن تحت الملتحمة. كونها مصممة للفحص البصري في الجسم الحي للأنسجة على المستوى المجهري ، وهذا هو أيضا أول وصف كامل لطريقة التصوير CLM لدراسة التوزيع المكاني والزماني للحقن في العين بعد الحقن تحت الملتحمة.
Introduction
إن إزالة الدم وتوزيع الأنسجة والإشغال المستهدف للعقاقير في الأنظمة الحية هي ركائز لفهم التصرف في الأدوية في الجسم الحي. في النماذج الحيوانية قبل السريرية ، يتم تقييم هذه المعلمات عادة عن طريق أخذ عينات الدم والأنسجة بشكل متكرر في نقاط زمنية معينة بعد إعطاء الدواء. ومع ذلك ، فإن هذه الإجراءات غازية بشكل عام ، وغالبا ما تتضمن قياسات عدم البقاء على قيد الحياة ، وتتطلب مجموعات كبيرة من الحيوانات للتشغيل الإحصائي. قد تكون هناك تكلفة إضافية ووقت متكبد ، إلى جانب المخاوف الأخلاقية للاستخدام المفرط للحيوانات. ونتيجة لذلك ، أصبح التصوير غير الجراحي بسرعة خطوة أساسية في دراسات التوزيعات الحيوية. يعد التنظير المجهري بالليزر البؤري (CLM1,2) مناسبا تماما للتطبيقات العينية لتصوير التوزيع المكاني والزماني للعلاجات بشكل غير جراحي في عيون الحيوانات الحية ذات الحساسية العالية والدقة العالية1,3,4.
لدى CLM القدرة على تسهيل الفحص القوي لأنظمة توصيل الأدوية العينية (DDS) ، مثل الجسيمات الشحمية ، قبل التحديد الكمي الشامل ل DDS والتوافر البيولوجي للأدوية. الجسيمات الشحمية جذابة لمرونتها في ضبط خصائصها الفيزيائية والكيميائية الحيوية5،6،7،8،9،10،11 لتغليف مجموعة كبيرة ومتنوعة من البضائع العلاجية والتحكم في موقع الأنسجة لإطلاق الدواء ومدة العمل. تم استخدام الجسيمات الشحمية في تطبيقات العين لتوصيل جزيئات كبيرة ، مثل الجسم المضاد أحادي النسيلة bevacizumab12 ، والجزيئات الصغيرة مثل السيكلوسبورين13 و ganciclovir14. الجسيمات الشحمية المحملة بالأدوية لها عمر نصف بيولوجي أطول وتأثيرات علاجية طويلة الأمد مقارنة بتركيبات "الدواء الحر" غير الشحمية. ومع ذلك ، عادة ما يتم استقراء توزيع الدواء في أنسجة العين من تركيزات المخدرات في المكونات السائلة للعين (أي الدم ، والفكاهة المائية ، والفكاهة الزجاجية 15،16،17). نظرا لأن المصير الأولي في الجسم الحي لشحنة الدواء المحملة يتم تحديده من خلال خصائص الناقل النانوي نفسه ، فإن تصوير CLM للجسيمات الشحمية الفلورية يمكن أن يكون بمثابة بديل للدواء للكشف عن استهداف الأنسجة وأوقات إقامة الأنسجة في الموقع. علاوة على ذلك ، يمكن للأدلة المرئية على التسليم باستخدام CLM توجيه إعادة تصميم DDS ، وتقييم الفوائد العلاجية للدواء ، وربما حتى التنبؤ بالأحداث البيولوجية الضارة (على سبيل المثال ، سمية الأنسجة بسبب التوطين غير المرغوب فيه ل DDS لفترات طويلة من الزمن).
هنا ، يتم تفصيل إجراء خطوة بخطوة حول كيفية دراسة التوزيع الحيوي للجسيمات الشحمية في العين في الفئران الحية باستخدام نظام CLM ثنائي النطاق. يمكن لنظام CLM المحدد هذا اكتشاف التألق بلونين (مع ليزر الإثارة الأخضر والأحمر عند 488 نانومتر و 660 نانومتر) في الوقت الفعلي ، بتردد 8 إطارات / ثانية. من خلال وضع مسبار الكشف جسديا على العين ، يوضح البروتوكول الحصول على صورة وتحليل الجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء عند تناولها تحت الملتحمة في الفئران التي تم حقنها مسبقا عن طريق الوريد (IV) مع صبغة إيفانز بلو (EB) بنسبة 2٪. تساعد صبغة EB على تصور الهياكل الوعائية في قناة التألق الحمراء. نعرض نتائج تمثيلية من دراسة تقيم الجسيمات الشحمية المحايدة 100 نانومتر المكونة من الفوسفوليبيد POPC (أي 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوكولين) والمنشطات مع الفوسفوليبيد Fl-DHPE الموسوم بالفلوريسين (أي N-(فلوريسين-5-ثيوكاربامويل) -1,2-dihexa-decanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine) بنسبة 95٪ POPC: 5٪ Fl-DHPE (الشكل 1B ). CLM قادر على التقاط الجسيمات الشحمية الخضراء الموسومة بالفلوريسين عند 15 ميكرومتر محوري و 3.30 ميكرومتر جانبي عن طريق ترسيم حدود أنسجة العين الملطخة ب EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في SingHealth (سنغافورة). تم الحصول على إناث الفئران C57BL/6 J (6-8 أسابيع ؛ 18-20 جم) من InVivos ، سنغافورة ، وتم وضعها في درجة حرارة و vivarium التي يتم التحكم فيها بالضوء في كلية الطب Duke-NUS ، سنغافورة. تم التعامل مع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الصادرة عن بيان جمعية البحوث في الرؤية وطب العيون (ARVO) لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية.
ملاحظة: يظهر في الشكل 2 مخطط انسيابي يسلط الضوء على الإجراءات الرئيسية.
1. إعداد عوامل التباين: إيفانز الأزرق (EB) والجسيمات الشحمية
- للحصول على محلول صبغ EB بنسبة 2٪ ، قم بإذابة 1 غرام من EB في 50 مل من محلول ملحي معقم. قم بتصفية المحلول باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر في أنابيب معقمة سعة 1.5 مل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها لاحقا.
- بالنسبة للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء ، أضف POPC / Fl-DHPE (95: 5) ، الكلوروفورم / الميثانول (2: 1) في قارورة سفلية مستديرة 100 مل. استخدم مبخرا دوار عند 150 دورة في الدقيقة عند 40 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الحفاظ على الفراغ عند 0 مللي بار1 لإنشاء طبقة دهنية رقيقة.
ملاحظة: عند مقارنة تأثيرات الخصائص الشحمية (مثل الحجم والشحنة وتشبع الدهون وطول سلسلة الدهون) على التوزيع، حافظ على نسبة مئوية ثابتة من Fl-DHPE أو غيرها من الدهون الفلورية للتأكد من أن النتائج التي لوحظت ترجع إلى تأثير الخصائص التي تم اختبارها، وليس إلى الحمل المتغير للأصباغ الكبيرة الكارهة للماء. - قم بترطيب طبقة الدهون باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (لتحقيق 26.3 ملليمتر من الجسيمات الشحمية الفلورية) عند 40 درجة مئوية لتشكيل حويصلات متعددة الصفائح (MLV). قم بتحميل MLVs في حقنة زجاجية للبثق اليدوي (30 مرة باستخدام مرشح بولي كربونات بحجم المسام 0.08 ميكرومتر) لتحقيق الحجم المطلوب البالغ 100 نانومتر.
ملاحظة: يجب أن تكون درجة حرارة الترطيب أعلى من درجة حرارة انتقال الدهون. - قم بتصفية الجسيمات الشحمية عن طريق تمريرها عبر مرشح حقنة معقم 0.22 ميكرومتر. تأكد من القطر الهيدروديناميكي (DH) للجسيمات الشحمية باستخدام نظام تشتت الضوء الديناميكي.
2. إعطاء EB والجسيمات الشحمية في الفئران الحية
- حقن الفأر مع EB IV (عن طريق الوريد) عن طريق الوريد الذيل (2.5 ملغم / كغم) ، 2 ساعة قبل الحقن تحت الملتحمة.
- للحقن تحت الملتحمة ، أولا ، قم بتخدير الماوس باستخدام 5٪ isoflurane عن طريق الاستنشاق في غرفة الحث لتحقيق مستوى كاف من التخدير. انقل الماوس إلى مخروط الأنف وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -2.5٪ من الأيزوفلوران أثناء وجوده على وسادة تسخين طوال العملية.
- تقليم الشعيرات بالقرب من العين ليتم حقنها وغرس قطرة من التخدير الموضعي 0.5٪ محلول هيدروكلوريد proxymetacaine مباشرة على العين.
- قم بتحميل حقنة زجاجية سعة 10 ميكرولتر (مع إبرة 32 جم) باستخدام الجسيمات الشحمية الفلورية (Fl-DHPE: 0.78 مجم / كجم) وقم بتبديد جميع فقاعات الهواء في المحقنة قبل الحقن.
ملاحظة: يمكن استيعاب ما يصل إلى 20 ميكرولتر من الحقن في الفضاء تحت الملتحمة للفئران18,19. - باستخدام ملاقط ، ارفع الملتحمة قليلا وحقن ببطء في الفضاء تحت الملتحمة (الشكل 1A). اسحب الإبرة ببطء لمنع التدفق العكسي. تأكد من تشكيل بليب مرئي مملوء بالجسيمات الشحمية الفلورية (الشكل 1C).
- إعطاء قطرة من المضادات الحيوية 1٪ حمض الفوسيديك على العين بعد الحقن ومراقبة الماوس حتى يستعيد وعيه.
3. إعداد CLM
- قم بتشغيل نظام CLM وتأكد من نظافة كل من الموصل والطرف البعيد لمسبار المسح الضوئي.
- قم بتنظيف موصل مسبار المسح الضوئي باستخدام منظف موصل بصري باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- اضغط على الراشيت (الملون غالبا) الخاص بمنظف الموصل البصري للكشف عن شريط التنظيف.
- ضع الموصل على اتصال بشريط التنظيف وحرك الموصل على طول الشريط مع الحفاظ على التلامس.
- قم بتنظيف الطرف البعيد (المعروف أيضا باسم طرف المسح) للمسبار عن طريق غمسه في محلول التطهير ، متبوعا بمحلول الشطف الذي توفره الشركة المصنعة. يمكن أيضا استخدام قضيب طرف قطني لتنظيف أكثر شمولا إذا كان الطرف متسخا جدا.
- قم بتوصيل المسبار بنظام CLM. اختر مجال العرض (FOV) وموقع ملفات الاستحواذ في هذه المرحلة.
ملاحظة: اضبط شدة الليزر في هذه الخطوة للتأكد من أن الكشف عن التألق ل Fl-DHPE في النطاق الخطي. يجب الحفاظ على كثافة الليزر متسقة للمقارنة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة. - اسمح للنظام بالإحماء لمدة 15 دقيقة وفقا للتعليمات واستخدم مجموعة المعايرة لمعايرة النظام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
ملاحظة: في مجموعة المعايرة، توجد ثلاث قوارير لكل ليزر تحتوي على المحاليل التالية: محلول التنظيف، ومحلول الشطف، ومحلول الفلوروفور 488/660 نانومتر للمعايرة الداخلية. يتم طلب خطوات المعايرة بواسطة النظام ويجب اتباعها وفقا لذلك.- اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اتركه في الهواء لتسجيل الخلفية لكلتا القناتين.
ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة للغاية لأنها تطبيع قيم الخلفية من الألياف المختلفة للمسبار وتضمن توحيد الصورة. - اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اغمر الطرف في قارورة الفلوروفور 488 نانومتر لمدة 5 ثوان لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.
- اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اغمر الطرف في قارورة الشطف حتى تسجل إشارة التألق في 3.5.2. يختفي. اغمر الطرف في قارورة الفلوروفور 660 نانومتر لتطبيع قيم الإشارة من الألياف المختلفة في المسبار.
ملاحظة: اتبع جميع خطوات المعايرة من أجل تحقيق المعايرة المناسبة وجودة الصورة المثلى.
- اغمر الطرف في قارورة التطهير متبوعة بقارورة الشطف (5 ثوان في كل قارورة). اتركه في الهواء لتسجيل الخلفية لكلتا القناتين.
- بعد معايرة المسبار، تحقق للتأكد من أن قيم الخلفية للمجسات منخفضة قدر الإمكان. بالنسبة لنظام CLM المستخدم، احتفظ بقيم الخلفية أقل من 100. قم بإجراء التنظيف المتكرر للمسبار باستخدام قضيب طرف قطني ومعايرة إذا كانت القيم أعلى من 100 / قيمة مستخدم محددة أو إذا بدا أن المسبار متسخ. هذا هو التأكد من أن ضوضاء الخلفية يتم الاحتفاظ بها حول نفس القيمة.
ملاحظة: من المهم تحديد الحد الأقصى لقيمة الخلفية (على سبيل المثال، 100 كما هو مذكور في الخطوة 3.6) للتأكد من أن ظروف التحقيق متشابهة. سيسمح ذلك بإجراء مقارنة كمية مناسبة بين الصور الملتقطة في نقاط زمنية مختلفة. قد تختلف القيمة في الأنظمة المختلفة وظروف التحقيق. - قم بتشغيل وحدة التحكم في درجة حرارة الحيوان (ATC). اضبط ATC على 37 درجة مئوية. قم بتغطية وسادة التدفئة بستارة جراحية وقم بإصلاح مخروط الأنف على وسادة التدفئة.
ملاحظة: مطلوب ATC مع وسادة تدفئة مرفقة لضمان الحفاظ على دفء الحيوان طوال مدة التصوير. - قم بتثبيت حامل المجهر التشريحي على سطح الطاولة لتثبيته. قم بتدوير وضبط عدسة المجهر لعرض عين الماوس بشكل مريح من خلال العدسة عندما يكون المستخدم جالسا (قم بإجراء التعديلات بعد وضع الحيوان).
- تخدير الماوس باستخدام 5 ٪ isoflurane في غرفة الحث. انقل الماوس إلى مخروط الأنف بمجرد أن يكون الحيوان غير مستجيب وحافظ على التخدير بنسبة 2٪ -2.5٪ isoflurane أثناء وجوده على وسادة تسخين طوال العملية.
- تقليم شعيرات الماوس وغرس قطرة من مخدر 0.5 ٪ من محلول هيدروكلوريد المخدر الوكيل على العين.
- للتأكد من نظافة العينين ، أسقط بضع قطرات من المياه المالحة لغسل سطح العين.
- اضبط المجهر بحيث تكون عين الماوس في بؤرة تركيز مباشرة عند تكبير 0.67x.
ملاحظة: تأكد من تليين العينين بمحلول ملحي. إذا لم يتم تشحيم العينين طوال جلسة التصوير ، فقد تجف ، مما يتسبب في تبلور العدسة. نتيجة لذلك ، أثناء تصوير CLM ، يمكن للعدسة أن تنبعث منها فلورة حمراء في الخلفية.
4. التصوير الحي لعيون الفئران مع CLM والاستحواذ
- قم بتشغيل الليزر ، وضع المسبار على العين وابدأ في تسجيل الاكتساب لمراقبة التألق في العين في المناطق المشار إليها على خريطة العين في الشكل 3.
ملاحظة: أمسك المسبار مثل القلم مع الطرف البعيد من المسبار مباشرة على المنطقة المراد تصويرها. - أوقف التسجيل عند وضع علامة على جميع المناطق وتصنيفها. سيتم حفظ ملفات الاستحواذ تلقائيا في موقع الملف المحدد في الخطوة 3.4.
ملاحظة: سيتم حفظ الملف كملف فيديو يمكن تصديره إلى صور فردية. قم بتسمية العلم وفقا لخريطة العين لمعرفة موقع المسبار بالضبط في الإطار الدقيق الذي تم فيه التسجيل.
5. تحليل الصور
- باستخدام نفس برنامج الحصول على CLM ، قم بتصدير ملفات الحصول على الصور لمزيد من التحليل. انقر على ملف | تصدير واختيار التنسيق المراد التصدير إليه. ستسمح ملفات تنسيق Mkt بتعديلات جدول البحث (LUT) والمزيد من الصادرات إلى تنسيقات ملفات الصور باستخدام برنامج عارض CLM.
- للمقارنة الدقيقة لشدة التألق ، استخدم نفس LUT المعدل لكل قناة عند تصدير جميع ملفات الصور.
ملاحظة: اختر الحد الأدنى والحد الأقصى لعتبة LUT فيما يتعلق بعتبة ماوس التحكم (بدون حقن الجسيمات الشحمية) لتقليل قراءات التألق في الخلفية. - افتح الصورة في برنامج مناسب لمعالجة الصور /برنامج مجاني (على سبيل المثال ، ImageJ). ارسم منطقة الاهتمام (ROI).
ملاحظة: يشير عائد الاستثمار هنا إلى المنطقة التي تحظى باهتمام برنامج المعالجة. في معظم الحالات ، سيكون عائد الاستثمار هو الصورة بأكملها الممسوحة ضوئيا. ومع ذلك ، في حالة تصوير النسيج ، لا يمكن للمسبار الحصول على صورة النسيان بشكل منفصل. لذلك ، يجب رسم عائد استثمار "لقياس" التألق في منطقة limbus ، كما هو موضح في الشكل 4. للحفاظ على اتساق عائد الاستثمار، استخدم نفس عائد الاستثمار عبر جميع الصور. - قياس وتسجيل قيم عائد الاستثمار للتألق الأخضر. أدخل القيم في جدول بيانات. جدولة متوسط وقيم شدة التألق (a.u) لعائد الاستثمار.
6. تقييم الأنسجة
- القتل الرحيم للماوس باستخدام طريقة معتمدة من قبل IACUC المحلي.
- قم باستئصال العين وإصلاح العين في 1 مل من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ أو محلول الفورمالين بنسبة 10٪ بين عشية وضحاها.
- قم بتقليم الدهون الزائدة وتضمين العين في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT) واحتفظ بها مجمدة في فريزر -80 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل.
- قطع أجزاء بسماكة 5 ميكرومتر في cryostat مع الحفاظ على درجة حرارة القطع عند 20 درجة مئوية. انقل القسم إلى شريحة مجهر مغلفة ب Poly-L-Lysine.
ملاحظة: يمكن أن يكون علم الأنسجة بمثابة التحقق الإضافي من توزيع DDS. ومع ذلك ، فإنه يتطلب تحسينا إضافيا وخبرة تقنية وتضحية بالحيوانات التي تهدف الدراسة إلى تقليلها باستخدام CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يوضح البروتوكول فائدة CLM لتقييم التوزيع العيني المكاني الصدغي للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء التي تدار عن طريق الحقن تحت الملتحمة. للاستفادة من القدرة المزدوجة اللون (488 نانومتر و 660 نانومتر من الأطوال الموجية للإثارة) لنظام CLM ، تم تخدير الجسيمات الشحمية POPC المحايدة التي سيتم حقنها ب 5٪ Fl-DHPE (تظهر بيانات التركيب والتوصيف في الشكل 1B) ، وتم حقن EB IV لتحديد المعالم في العين. إن وجود طبقة رقيقة من episclera والملتحمة ، وكلاهما ذو أوعية دموية عالية ، يسمح لمنطقة الصلبة بأن تكون ملطخة باللون الأحمر مع EB (الشكل 4A ، المسمى باسم S) ، في حين أن القرنية التي لا تحتوي على أي أوعية وعائية (الشكل 4A ، المسمى C) ، لا تتلطخ وتظهر سوداء. وهذا يتيح تمييزا واضحا بين المنطقتين أثناء التصوير الفلوري.
النتائج التمثيلية هي من دراسة توزيع تمتد على مدى 7 أيام (ن = 4 فئران). نظرا لأن كثافة التألق في الصور لليوم 1 واليوم 3 كانت عالية (الشكل 5B) ، فقد تم تقليل كثافة البكسل لتحسين التصور. تنعكس القيم الفعلية لشدة التألق في الرسوم البيانية (الشكل 6). ولضمان أن تكون الملاحظات من الصور ناتجة عن التألق من الجسيمات الشحمية وليس الصبغة الحرة، التي ربما تكون قد أزاحت من الجسيمات الشحمية، تم تضمين الفئران الضابطة التي تم حقنها بصبغة الفلوريسين (Fl) (الشكل 5A).
لوحظ انخفاض في الجسيمات الشحمية (بالوكالة عن الانخفاض في إشارة الفلورسنت الخضراء) في كل من منطقتي الأطراف والصلبة مع مرور الوقت. عندما تم حقن الجسيمات الشحمية من المنطقة الصدغية إلى المنطقة العليا من الفضاء تحت الملتحمة (الشكل 3) ، تم وضعها بشكل طبيعي فوق الصلبة الصدغية والعلوية (الشكل 4B) قبل الوصول إلى مناطق أخرى من الفضاء تحت الملتحمة. في اليوم 1 بعد الحقن ، كان التألق المكتشف في الصلبة أعلى ب 6 مرات من الحوفي لكل من المناطق الزمنية والعليا (الشكل 6). بحلول اليوم 3 واليوم 7 ، لوحظ انخفاض كبير في الجسيمات الشحمية في الصلبة (60 ٪ من اليوم 1 إلى اليوم 3 (اليوم 1→3) و 88 ٪ من اليوم 3 إلى اليوم السابع (اليوم3→7)) في المنطقة الزمنية ، مع انخفاض بنسبة 66 ٪ و 93 ٪ لليوم 1→3 واليوم 3 →7 في المناطق العليا ، على التوالي ، p < 0.001) (الشكل 6). ويعزى هذا الانخفاض إلى آليات إزالة العين من خلال الدم و / أو الأوعية اللمفاوية الموجودة في الملتحمة و episclera. يمكن أن تكون الجسيمات الشحمية قد انتشرت أيضا عبر الصلبة ويتم تطهيرها بواسطة المشيمية ، والتي هي أيضا وعائية للغاية.
تم العثور على الجسيمات الشحمية قد تم تطهيرها بطريقة أبطأ في النسيان. بالنسبة للحرف الصدغي والأطراف العليا، لم تكن التغيرات في إشارات التألق من اليوم 1 إلى اليوم 3 بعد الحقن كبيرة، مما يشير إلى أن الجسيمات الشحمية المحايدة لها تفضيل لمنطقة النسيان، وخاصة محيط القرنية (الشكل 5 ب). بدأت الجسيمات الشحمية في منطقة النسيان في التطهير من اليوم الثالث (d3→7: -89٪ للصدغي (p < 0.01) ، و -53٪ للأعلى (p < 0.05)). بحلول اليوم 7 ، تم تطهير أكثر من 90٪ من الجسيمات الشحمية من جميع مناطق الأطراف (p < 0.05) باستثناء الأطراف العليا 1S ، حيث لا يزال من الممكن اكتشاف 50٪ من الجسيمات الشحمية (p > 0.05). وهذا مؤشر على أن وقت إقامة الجسيمات الشحمية المحايدة أعلى بكثير في محيط الأطراف/القرنية العلوي (الشكل 5 والشكل 6) بالمقارنة مع المناطق الأخرى. تم الكشف عن أقل كمية من التألق في المناطق الأنفية والسفلية في جميع النقاط الزمنية بسبب بعدها عن موقع الحقن (الشكل 6A ، B).
في دراسات أكثر شمولا لإزالة الجسيمات الشحمية في العين التي تم الإبلاغ عنها سابقا1 ، ناقشنا بعض الطرق التي يمكن من خلالها إزالة الجسيمات الشحمية من أنسجة العين بعد الحقن تحت الملتحمة. في حين يمكن تطهير الجسيمات الشحمية عن طريق الدورة الدموية الجهازية والتصفية اللمفاوية من خلال الملتحمة ، episclera ، والمشيمية ، والتي هي عالية الأوعية الدموية ، فإنها يمكن أن تصل أيضا إلى الأنسجة العميقة داخل العين عن طريق الانتشار السلبي من خلال الصلبة. يمكن أن ينقل تدفق السوائل أيضا الجسيمات الشحمية من خلال الشبكة التربيقية أو تدفق الأجسام الغريبة ، والتي يمكن أن تعيد الجسيمات الشحمية إلى الصلبة. القضاء من خلال الدموع ممكن أيضا ، ويمكن أن تسمح التسربات الطفيفة في موقع الحقن باختراق القرنية من خلال الانتشار السلبي.
الشكل 1: الحقن تحت الملتحمة للجسيمات الشحمية في العين. (أ) التمثيل الرسومي للجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء والحقن تحت الملتحمة. (ب) تكوين وخصائص تركيبة الجسيمات الشحمية المنشطة FL-DHPE لتصوير CLM العيني. (ج) الجسيمات الشحمية الفلورية الخضراء التي تشكل بليب عند الحقن تحت الملتحمة. وقد عدل هذا الرقم بإذن من تشاو س. ي. وآخرون 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الجدول الزمني لإجراء CLM العيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: خريطة العين لمسح CLM. تشير المنطقة 1 إلى منطقة النسيان ، بينما تشير المنطقة 2 إلى منطقة الصلبة. تم التقاط مقاطع الفيديو والصور من 1T في اتجاه عكس اتجاه عقارب الساعة ، تليها 2T في اتجاه مماثل عكس اتجاه عقارب الساعة. نظرا لأنه تم إدخال الإبرة للحقن من 2T إلى 2S ، فإن مجالات الاهتمام هي بشكل رئيسي 1T و 1S و 2T و 2S. يظهر الإدراج حجم المسبار بالنسبة لعين الماوس. وقد عدل هذا الرقم بإذن من تشاو س. ي. وآخرون 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحليل الصور. (أ) تم إجراء تحليل ImageJ للجسيمات الشحمية الموسومة بالفلورسنت باستخدام مناطق الاهتمام (ROI) المحددة للعرف (L) والصلبة (S) (B) مناطق العين المحددة كميا في منطقة limbus لوجود الجسيمات الشحمية. المواقع المحتملة للجسيمات الشحمية المكتشفة في العضل هي 1) محيط القرنية ، 2) العضل أو 3) محيط الصلبة. وقد عدل هذا الرقم بإذن من تشاو س. ي. وآخرون 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: توزيعات التباين عند الأطراف والصلبة. توزيع التباين في الحافة (1S: أعلى ، 1N: الأنف ، 1I: السفلي ، 1T: الصدغي) والصلبة (2S: أعلى ، 2N: الأنف ، 2I: السفلي ، 2T: الصدغي) مناطق فأر ممثل واحد من كل مجموعة (n = 4) على مدى 7 أيام للتحكم في الفلوريسين (Fl) ، (B) 100 نانومتر من الجسيمات الشحمية المحايدة (POPC-100). يشير اللون الأحمر إلى تلطيخ EB. شريط المقياس = 50 ميكرومتر (C) يتم تجميع الصور الملتقطة على خريطة العين لفهم أفضل. وقد عدل هذا الرقم بإذن من تشاو س. ي. وآخرون 1. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: حركية إزالة الجسيمات الشحمية المحايدة POPC 100 نانومتر في منطقتي الصلبة (A) والليمبوس (B) على مدى 7 أيام (n = 4 فئران لكل مجموعة). تمت مقارنة متوسط شدة التألق بواسطة ANOVA 2-way مع مقارنات متعددة فيما يتعلق بالنقطة الزمنية السابقة ؛ d1→3 و d3→7 ؛ * ص < 0.05 ، ** ص < 0.01 ، * * ص < 0.001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: صور نسيجية تمثيلية للمقاطع المستعرضة (5 ميكرومتر) من عين الفأر بعد يوم واحد من حقن الجسيمات الشحمية Fl-DHPE. تشير الخطوط المنقطة إلى المكان الذي يمكن فيه ملاحظة الجسيمات الشحمية ، ويشار إليها باللون الأخضر. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
كما هو موضح من النتائج ، يوفر CLM طريقة بسيطة ومجدية لتصوير التوزيع العيني للجسيمات الشحمية في العين. لقد أظهرنا سابقا استخدام CLM لتوصيف توطين التركيبات الشحمية المختلفة داخل عين الفأر بمرور الوقت1. بالنسبة للتطبيقات غير الغازية ، يسمح CLM بالتصوير في الوقت الفعلي لسطح العين الأمامي للحصول على رؤى حول كيفية توزيع الجسيمات الشحمية في العين من نفس الحيوان. وهذا يجعل CLM مناسبا للفحص المسبق لناقل النانو / DDS قبل إجراء تحديد كمي أكثر شمولا. بالنظر إلى الخصائص الفيزيائية الكيميائية الفريدة ل DDS المتنوعة ، من الصعب إلى حد ما توصيف توزيعها الفرعي بواسطة علم الأنسجة التقليدي. وسيتطلب هذا الأخير تقسيما شاملا للعين بأكملها وأقسام التصوير الفردية بواسطة المجهر الفلوري للحصول على إحساس شامل بإزالة DDS.
بالاتفاق مع صور CLM (الشكل 5B ، C) ، يمكننا ملاحظة إشارات الفلورسنت الخضراء بواسطة علم الأنسجة في مناطق القرنية والأطراف والصلبة في العين التي تم جمعها في اليوم 1 بعد حقن الجسيمات الشحمية (الشكل 7). والجدير بالذكر أن CLM أظهر حساسية أفضل من المجهر الفلوري - يمكن اكتشاف الجسيمات الشحمية في الصلبة بوضوح باستخدام CLM (الشكل 5) ولكن بالكاد يتم اكتشافها بواسطة المجهر الفلوري (الشكل 7). يمكن أن يكون فقدان الإشارة بسبب إجراءات الغسيل والتقسيم التي أثرت على الاحتفاظ بالجسيمات الشحمية في أقسام الأنسجة. على الرغم من أن CLM محدود في تحديد طبقة الأنسجة الدقيقة التي تتراكم فيها الجسيمات الشحمية ، إلا أنها بالتأكيد طريقة مجدية ومباشرة نسبيا لفحص وتقييم علاجات العين المرشحة بشكل غير جراحي في الوقت الفعلي.
في حين أن أنظمة التصوير الأخرى مثل أنظمة التصوير في الجسم الحي ومقاييس الفلورومتر تمكن أيضا التصوير الحي أو القياس الكمي الحي للتألق في العين ، إلا أنها ليست مناسبة لغرض هذه الدراسة. لا توفر أنظمة التصوير في الجسم الحي الدقة المكانية المطلوبة لتحديد مكان العلاجات في مساحة العين. يمكن للمرء فقط الحصول على فكرة عما إذا كانت العلاجات لا تزال موجودة في الفضاء العيني وتوزيعها الحيوي عند استخدامها في نظام التصوير الحي20. يسمح مقياس الفلورومتر بقياس التألق على طول المحور البصري للعين ويستخدم على نطاق واسع لدراسة التغيرات الفسيولوجية في العين. نظرا لوجود صعوبة في مسح نفس المحور البصري بالضبط في كل نقطة زمنية ، لا يمكن الحفاظ على بقعة تصوير متسقة. وهذا أمر بالغ الأهمية، لا سيما عند دراسة توزيع نظم توصيل الأدوية التي يكون فيها وقت إقامتهم ومعدل إجازتهم من موقع الحقن غير معروفين تماما. علاوة على ذلك ، فإن موقع الحقن والتوزيع المتوقع للحقن تحت الملتحمة ليسا أيضا ضمن نطاق المحور البصري.
تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول اتباع خريطة تصوير مشابهة لخريطة العين الموضحة في الشكل 3 بدقة ووضع علامات على المواقع بدقة. ومن شأن سوء وضع العلامات أو الانحراف عن موقع التصوير أن يؤدي إلى عدم اتساق النتائج. نظرا لأنه يمكن ضبط شدة الليزر لكل فحص ، فمن المهم أن تكون الكثافة متسقة حتى يكون القياس الكمي للنقاط الزمنية المختلفة قابلا للمقارنة. من المهم أيضا أن يبقى المسبار خاليا من الحطام أثناء عملية التصوير. نظرا لأن مخاط العين يمكن أن يتم القبض عليه على المسبار أثناء التصوير ، يوصى بشطف المسبار في محلول ملحي إذا ارتفعت قيم الخلفية فوق القيمة المحددة من قبل المستخدم.
بخلاف الحقن تحت الملتحمة ، فإن نظام CLM هذا لديه أيضا القدرة على استخدامه لدراسة طرق توصيل العين الأخرى مثل إعطاء قطرة العين والحقن داخل الجسم الزجاجي (IVT). ومع ذلك ، نظرا للحد من عمق التصوير ، قد لا يكون من المفيد ل IVT إذا كان موقع الحقن وأنسجة العين الأعمق هي مجالات الاهتمام الرئيسية. يمكن أيضا استخدام CLM كشكل من أشكال التصوير داخل الجسم لدراسة توزيع DDS في الأعضاء أو الأنسجة الأخرى. على الرغم من أنه نادرا ما تم استخدامه لدراسة توزيع DDS ، فقد تم استخدام المجهر البؤري بالمنظار لتصوير الالتهاب الناجم عن التهاب اللثة21 ، ومراقبة الالتهاب الرئوي والالتهابات22,23 وتأثير الأدوية على تكوين الأوعية الدموية في الأورام24 ، مما يشير إلى مجموعة من التطبيقات المحتملة الأخرى لنظام CLM هذا.
وعموما، يمكن أن يكون هذا البروتوكول بمثابة خطوة فحص لمعرفة كيف تؤثر التعديلات في تركيبات DDS على مكان وجودها أو تراكمها، وهو ما يمكن أن يكون حاسما في تصميم DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل منحة NTU-Northwestern Institute for Nanomedicine (NNIN) الممنوحة (إلى SV) وجزئيا من قبل منحة مؤسسة سنغافورة الوطنية للبحوث AG/CIV/GC70-C/NRF/2013/2 ومنحة صندوق محاذاة الصناعة للصحة والعلوم الطبية الحيوية (HBMS) في سنغافورة H18/01/a0/018 التي تديرها وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A*STAR) (إلى AMC). شكرا لأعضاء من مختبر Duke-NUS للتصوير الانتقالي والجزيئي (LTMI) لتسهيل الخدمات اللوجستية وتنفيذ الدراسات والتدريب على المعدات. شكر خاص للسيدة ويسنا نوفيرا على مساعدتها التحريرية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
