Summary
Представлен протокол применения фиброоптической конфокальной лазерной микроскопии (КМЛМ) для неинвазивного изучения пространственно-временного распределения липосом в глазу после субконъюнктивальной инъекции.
Abstract
Субконъюнктивальная инъекция является привлекательным способом введения глазных препаратов из-за легкого транссклерального доступа, который обходит передние глазные барьеры, такие как роговица и конъюнктива. В то время как терапевтические эффекты и фармакокинетика лекарств при субконъюнктивальной инъекции были описаны в некоторых исследованиях, очень немногие оценивают глазное распределение лекарств или системы доставки лекарств (DDS). Последнее имеет решающее значение для оптимизации внутриглазной конструкции DDS и биодоступности препарата для достижения желаемой глазной локализации и продолжительности действия (например, острого и пролонгированного). Данное исследование устанавливает использование волоконно-оптической конфокальной лазерной микроэндоскопии (CLM) для качественного изучения глазного распределения флуоресцентных липосом в режиме реального времени у живых мышей после субконъюнктивальной инъекции. Будучи разработанным для визуального осмотра тканей in vivo на микроскопическом уровне, это также первое полное описание метода визуализации CLM для изучения пространственно-временного распределения инъекционных препаратов в глазу после субконъюнктивальной инъекции.
Introduction
Очищение крови, распределение тканей и целевое заполнение лекарств в живых системах являются столпами для понимания диспозиции лекарств in vivo. В доклинических моделях на животных эти параметры обычно оцениваются путем частого забора крови и тканей в определенные моменты времени после введения препарата. Тем не менее, эти процедуры, как правило, являются инвазивными, часто включают измерения невыявляемости и требуют больших когорт животных для статистического питания. Могут возникнуть дополнительные расходы и время, а также этические проблемы чрезмерного использования животных. В результате неинвазивная визуализация быстро становится неотъемлемым шагом в исследованиях биораспределения. Конфокальная лазерная микроэндоскопия (CLM1,2) хорошо подходит для глазных применений для неинвазивного изображения пространственно-временного распределения терапевтических средств в глазах живых животных с высокой чувствительностью и высоким разрешением1,3,4.
CLM обладает потенциалом для облегчения надежного скрининга систем доставки глазных лекарств (DDS), таких как липосомы, до всесторонней количественной оценки DDS и биодоступности лекарств. Липосомы привлекательны своей гибкостью в настройке своих физико-химических и биофизических свойств5,6,7,8,9,10,11 для инкапсуляции большого разнообразия терапевтического груза и контроля тканевого места высвобождения лекарственного средства и продолжительности действия. Липосомы использовались в глазных приложениях для доставки больших молекул, таких как моноклональное антитело бевацизумаб12, и малых молекул, таких как циклоспорин13 и ганцикловир14. Липосомы, нагруженные лекарственными средствами, имеют более длительные биологические периоды полураспада и длительные терапевтические эффекты по сравнению с нелипосомными составами «свободных лекарств». Однако распределение лекарственного средства в глазной ткани обычно экстраполируется из концентраций лекарственного средства в жидких компонентах глаза (т.е. крови, водной влаге и стекловидном теле15,16,17). Поскольку первоначальная судьба in vivo загруженного лекарственного груза определяется свойствами самого нанонесущего, CLM-визуализация флуоресцентных липосом может служить суррогатом для лекарственного средства, чтобы выявить нацеливание на ткань и время пребывания ткани in situ. Кроме того, визуальные доказательства доставки с CLM могут направлять редизайн DDS, оценивать терапевтические преимущества препарата и, возможно, даже прогнозировать неблагоприятные биологические события (например, токсичность тканей из-за нежелательной локализации DDS в течение длительных периодов времени).
Здесь подробно описана пошаговая процедура изучения глазного биораспределения липосом у живых мышей с двухдиапазонной системой CLM. Эта специальная система CLM может обнаруживать двухцветную флуоресценцию (с зелеными и красными лазерами возбуждения при 488 нм и 660 нм) в режиме реального времени с частотой 8 кадров / с. Физически помещая зонд обнаружения на глаз, протокол демонстрирует получение и анализ изображений зелено-флуоресцентных липосом при субконъюнктивальном введении у мышей, предварительно введенных внутривенно (IV) с 2% красителем Evans Blue (EB). Краситель EB помогает визуализировать васкуляризованные структуры в красном флуоресцентном канале. Мы показываем репрезентативные результаты исследования, оценивающего 100 нм нейтральных липосом, состоящих из фосфолипида POPC (т.е. 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина) и легированных флуоресцеин-меченым фосфолипидом Fl-DHPE (т.е. N-(флуоресцеин-5-тиокарбамоил)-1,2-дигекса-деканоилсн-глицеро-3-фосфоэтаноламин) в соотношении 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Рисунок 1B ). CLM способен захватывать зеленые флуоресцеин-меченые липосомы с осевым разрешением 15 мкм и боковым разрешением 3,30 мкм путем очерчивания границ глазной ткани, окрашенной EB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в SingHealth (Сингапур). Самки мышей C57BL/6 J (6-8 недель; 18-20 г) были получены из InVivos, Сингапур, и размещены в варии с контролируемой температурой и светом Медицинской школы Duke-NUS, Сингапур. Животные лечились в соответствии с руководящими принципами Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) для использования животных в офтальмологических и зрительных исследованиях.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блок-схема, выделяющая основные процедуры, показана на рисунке 2.
1. Приготовление контрастных веществ: Evans Blue (EB) и липосом
- Для 2% раствора красителя EB растворить 1 г EB в 50 мл стерильного физиологического раствора. Фильтруйте раствор с помощью фильтров 0,22 мкм в стерильные трубки объемом 1,5 мл и храните их при комнатной температуре для последующего использования.
- Для зелено-флуоресцентных липосом добавьте POPC/Fl-DHPE (95:5), хлороформ/метанол (2:1) в колбу с круглым дном объемом 100 мл. Используйте роторный испаритель при 150 об/мин при 40 °C в течение 1 ч, при этом вакуум поддерживается при 0 мбар1 для создания тонкой липидной пленки.
ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении влияния липосомальных свойств (например, размер, заряд, насыщение липидов, длина липидной цепи) на распределение, поддерживайте фиксированный процент Fl-DHPE или других флуоресцентных липидов, чтобы подтвердить, что наблюдаемые результаты обусловлены эффектом тестируемых свойств, а не переменной нагрузкой крупных гидрофобных красителей. - Увлажняют липидную пленку фосфатно-буферным физиологическим раствором (для достижения 26,3 мМ флуоресцентных липосом) при 40 °C с образованием многоламеллярных везикул (MLV). Загрузите MLV в стеклянный шприц для ручной экструзии (30 раз с использованием поликарбонатного фильтра размером пор 0,08 мкм) для достижения желаемого размера 100 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Температура для гидратации должна быть выше, чем температура перехода липидов. - Фильтруйте липосомы, пропуская их через 0,22 мкм стерильный шприцевой фильтр. Подтвердите гидродинамический диаметр (DH) липосом с помощью динамической системы рассеяния света.
2. Введение ЭБ и липосом живым мышам
- Вводят мышам EB IV (внутривенно) через хвостовую вену (2,5 мг/кг) за 2 ч до субконъюнктивальной инъекции.
- Для субконъюнктивальной инъекции, во-первых, успокойте мышь, используя 5% изофлурана путем ингаляции в индукционной камере для достижения адекватной плоскости анестезии. Переведите мышь на носовой конус и поддерживайте седацию на уровне 2%-2,5% изофлурана, находясь на грелке на протяжении всей процедуры.
- Обрежьте усы возле глаза для инъекций и закапывайте каплю местного анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида непосредственно в глаз.
- Загрузите стеклянный шприц объемом 10 мкл (с иглой 32 г) флуоресцентными липосомами (Fl-DHPE: 0,78 мг/ кг) и рассейте все пузырьки воздуха в шприце перед инъекцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: До 20 мкл инъекционного вещества может быть размещено в субконъюнктивальном пространстве мышей18,19. - С помощью пинцета слегка приподнимите конъюнктиву и медленно введите в субконъюнктивальное пространство (рисунок 1А). Медленно вынимайте иглу, чтобы предотвратить обратный поток. Убедитесь, что образовалась видимая блеб, заполненная флуоресцентными липосомами (рисунок 1С).
- Вводят каплю антибиотика 1% фузидовой кислоты в глаз после инъекции и контролируют мышь до тех пор, пока она не придет в сознание.
3. Настройка CLM
- Включите систему CLM и убедитесь, что разъем и дистальный наконечник сканирующего зонда чисты.
- Очистите разъем сканирующего зонда с помощью очистителя оптических разъемов, следуя инструкциям производителя.
- Нажмите на рейет (часто цветной) очистителя оптического разъема, чтобы открыть ленту очистки.
- Расположите разъем в контакте с лентой очистки и сдвиньте разъем вдоль ленты, сохраняя контакт.
- Очистите дистальный наконечник (также известный как сканирующий наконечник) зонда, окунув его в очищающий раствор, а затем раствор для полоскания, предоставленный производителем. Аппликатор хлопкового наконечника также можно использовать для более тщательной очистки, если наконечник очень грязный.
- Подключите зонд к системе CLM. Выберите поле зрения (FOV) и расположение файлов сбора на этом этапе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте интенсивность лазера на этом шаге, чтобы убедиться, что обнаружение флуоресценции для Fl-DHPE находится в линейном диапазоне. Интенсивность лазера должна быть постоянной для сравнения между изображениями, сделанными в разные моменты времени. - Дайте системе прогреться в течение 15 минут в соответствии с инструкциями и используйте калибровочный комплект для калибровки системы в соответствии с инструкциями производителя.
ПРИМЕЧАНИЕ: В калибровочном комплекте имеется три флакона для каждого лазера, содержащих следующие растворы: очищающий раствор, раствор для полоскания и раствор флуорофора 488/660 нм для внутренней калибровки. Этапы калибровки запрашиваются системой и должны соблюдаться соответствующим образом.- Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Оставьте его в эфире для фоновой записи для обоих каналов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг очень важен, так как он нормализует фоновые значения из разных волокон зонда и обеспечивает однородность изображения. - Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Погружайте наконечник во флакон флуорофор 488 нм на 5 секунд для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.
- Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Погружайте наконечник в промывочный флакон до флуоресцентного сигнала, зафиксированного в разделе 3.5.2. Исчезает. Погружайте наконечник во флакон флуорофор 660 нм для нормализации значений сигнала от разных волокон в зонде.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все этапы калибровки для достижения правильной калибровки и оптимального качества изображения.
- Погрузите наконечник в очищающий флакон с последующим промывочным флаконом (по 5 с в каждом флаконе). Оставьте его в эфире для фоновой записи для обоих каналов.
- После калибровки зонда убедитесь, что фоновые значения для зондов как можно ниже. Для используемой системы CLM сохраняйте фоновые значения ниже 100. Выполните повторную очистку зонда с помощью хлопкового наконечника и калибровку, если значения превышают 100 / определенное пользовательское значение или если зонд кажется грязным. Это делается для того, чтобы фоновый шум сохранялся примерно на том же значении.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно определить максимальное фоновое значение (например, 100, как указано на шаге 3.6), чтобы убедиться, что условия зонда схожи. Это позволит правильно проводить количественное сравнение между изображениями, сделанными в разные моменты времени. Значение может отличаться в разных системах и условиях зонда. - Включите регулятор температуры животных (ATC). Отрегулируйте ATC до 37 °C. Накройте грелку хирургической драпировкой и закрепите носовой конус на грелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: ATC с прикрепленной грелкой требуется для обеспечения того, чтобы животное оставалось в тепле в течение всего периода визуализации. - Прижмите подставку рассекающего микроскопа к столешнице, чтобы закрепить ее. Поверните и отрегулируйте окуляр микроскопа, чтобы эргономично просматривать глаз мыши через окуляр, когда пользователь сидит (внесите коррективы после размещения животного).
- Успокоить мышь, используя 5% изофлурана в индукционной камере. Перенесите мышь на носовой конус, как только животное не реагирует, и поддерживайте седацию на уровне 2-2,5% изофлурана, находясь на грелке на протяжении всей процедуры.
- Обрежьте усы мыши и закапывайте в глаз каплю анестетика 0,5% раствора проксиметакаина гидрохлорида.
- Чтобы убедиться, что глаза чистые, опустите несколько капель физиологического раствора, чтобы промыть глазную поверхность.
- Отрегулируйте микроскоп так, чтобы глаз мыши находился в прямом фокусе при увеличении 0,67x.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно смажьте глаза физиологическим раствором. Если глаза не смазаны в течение всего сеанса визуализации, они могут стать сухими, в результате чего хрусталик кристаллизуется. В результате во время CLM-визуализации объектив может излучать фоновую красную флуоресценцию.
4. Живая визуализация глаз мыши с помощью CLM и сбора
- Включите лазер, поместите зонд на глаз и начните запись захвата, чтобы наблюдать флуоресценцию в глазу в областях, указанных на карте глаза на рисунке 3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите зонд, как ручку, дистальным концом зонда непосредственно на области, подлежащей изображению. - Остановите запись, когда все регионы будут помечены и помечены. Файлы получения будут сохранены автоматически в расположении файлов, выбранном на шаге 3.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Файл будет сохранен в виде видеофайла, который может быть экспортирован в отдельные изображения. Пометьте флаг в соответствии с картой глаз, чтобы точно знать местоположение зонда в точном кадре, в котором была сделана запись.
5. Анализ изображений
- Используя то же программное обеспечение для сбора CLM, экспортируйте файлы сбора изображений для дальнейшего анализа. Нажмите на файл | Экспортируйте и выберите формат для экспорта. Файлы формата Mkt позволят корректировать таблицу поиска (LUT) и дальнейшую экспорт в форматы файлов изображений с помощью программного обеспечения CLM Viewer.
- Для точного сравнения интенсивности флуоресценции используйте один и тот же LUT, настроенный для каждого канала при экспорте всех файлов изображений.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите минимальный и максимальный порог LUT по отношению к пороговым значениям контрольной мыши (без введения липосом), чтобы свести к минимуму показания фоновой флуоресценции. - Откройте изображение в соответствующем программном обеспечении для обработки изображений / бесплатной программе (например, ImageJ). Нарисуйте интересующую область (ROI).
ПРИМЕЧАНИЕ: ROI здесь относится к региону, представляющему интерес в программе обработки. В большинстве случаев ROI будет представлять собой все отсканированное изображение. Однако в случае визуализации лимбуса зонд не может просто получить изображение лимбуса отдельно. Таким образом, ROI должен быть использован для «количественной оценки» флуоресценции в области лимбуса, как показано на рисунке 4. Чтобы обеспечить согласованность окупаемости инвестиций, используйте одинаковую рентабельность инвестиций для всех изображений. - Измерьте и запишите значения ROI для зеленой флуоресценции. Введите значения в электронную таблицу. Сведите в таблицу значения средней интенсивности и интенсивности флуоресценции (a.u.) ROI.
6. Оценка гистологии
- Усыплите мышь, используя метод, одобренный местным IACUC.
- Энуклеат глаза и фиксация глаза в 1 мл 4% формальдегида или 10% раствора формалина на ночь.
- Обрежьте лишние жиры и вставьте глаз в соединение оптимальной температуры резки (OCT) и храните его замороженным в морозильной камере при температуре -80 °C в течение по крайней мере одного дня.
- Разрезанные участки толщиной 5 мкм в криостате с температурой резания, поддерживаемой при 20 °C. Перенесите секцию на предметное стекло микроскопа с поли-L-лизином.
ПРИМЕЧАНИЕ: Гистология может служить дополнительной проверкой распределения DDS. Тем не менее, это требует дополнительной оптимизации, технических знаний и жертвоприношения животных, которые исследование стремится уменьшить с помощью CLM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Протокол демонстрирует полезность CLM для оценки пространственно-временного глазного распределения зеленых флуоресцентных липосом, вводимых через субконъюнктивальную инъекцию. Чтобы использовать двухцветную способность (длины волн возбуждения 488 нм и 660 нм) системы CLM, 100 нм нейтральные липосомы POPC, которые должны были быть введены, легировали 5% Fl-DHPE (данные состава и характеристик показаны на рисунке 1B), а EB вводили IV для выявления ориентиров в глазу. Наличие тонкого слоя эписклер и конъюнктивы, которые сильно васкуляризированы, позволяет окрашивать область склеры в красный цвет с помощью EB (рисунок 4A, помеченный как S), в то время как роговица, которая не содержит сосудистой системы (рисунок 4A, помеченный как C), не окрашивается и кажется черной. Это позволяет четко дифференцировать обе области во время флуоресцентной визуализации.
Репрезентативные результаты получены в результате исследования распределения, охватывающего более 7 дней (n = 4 мыши). Поскольку интенсивность флуоресценции на изображениях для дня 1 и дня 3 была высокой (рисунок 5B), интенсивность пикселей была уменьшена для лучшей визуализации. Фактические значения интенсивности флуоресценции отражены на графиках (рисунок 6). Чтобы убедиться, что наблюдения на изображениях были обусловлены флуоресценцией липосом и несвободным красителем, который мог вытесниться из липосом, контрольным мышам вводили флуоресцеиновый (Fl) краситель (Рисунок 5А).
Уменьшение липосом (по причине уменьшения зеленого флуоресцентного сигнала) наблюдалось как в области лимбуса, так и в области склер с течением времени. Поскольку липосомы вводились из височной в верхнюю область субконъюнктивального пространства (рисунок 3), они естественным образом помещались прямо поверх височной и верхней склер (рисунок 4B), прежде чем достичь других областей субконъюнктивального пространства. На 1-й день после инъекции флуоресценция, обнаруженная в склере, была в 6 раз выше, чем лимбус как для височной, так и для верхней областей (рисунок 6). К 3-му и 7-му дню наблюдалось значительное уменьшение липосом в склерах (60% с 1-го по 3-й день (1→3-й день) и 88% с 3-го по 7-й день (день3→7)) в височной области, со снижением на 66% и 93% на 1→3 день и 3→7 день в верхних областях; соответственно, p < 0,001) (рисунок 6). Это снижение было связано с механизмами глазного клиренса через кровь и / или лимфатические сосуды, обнаруженные в конъюнктиве и эписклерах. Липосомы также могли диффундировать через склеру и очищаться сосудистой оболочкой, которая также сильно васкуляризирована.
Было обнаружено, что липосомы очищались медленнее в лимбе. Для височного лимбуса и верхнего лимбуса изменения флуоресцентных сигналов с 1-го по 3-й день после инъекции не были значительными, что указывает на то, что нейтральные липосомы отдают предпочтение области лимбуса, особенно периферии роговицы (рисунок 5B). Липосомы в области лимбуса начали очищаться с 3-го дня (d3→7: -89% для височной (p < 0,01) и -53% для верхней (p < 0,05)). К 7-му дню более 90% липосом были очищены из всех областей лимбуса (p < 0,05), за исключением верхнего лимбуса 1S, где все еще можно было обнаружить 50% липосом (p > 0,05). Это указывает на то, что время пребывания нейтральных липосом намного выше на верхней периферии лимбуса/роговицы (рисунок 5 и рисунок 6) по сравнению с другими регионами. Наименьшее количество флуоресценции было обнаружено в носовой и нижней областях во всех временных точках из-за их удаленности от места инъекции (рисунок 6A,B).
В более всесторонних исследованиях клиренса липосом в глазу, о которых сообщалось ранее1, мы обсудили несколько путей, по которым липосомы могут быть очищены от глазных тканей после субконъюнктивальной инъекции. В то время как липосомы могут быть очищены системным кровообращением и лимфатическим клиренсом через конъюнктиву, эписклеры и сосудистую оболочку, которые сильно васкуляризированы, они также могут достигать более глубоких внутриглазных тканей путем пассивной диффузии через склеры. Поток жидкости может также транспортировать липосомы через трабекулярную сетку или отток увеосклеры, что может вернуть липосомы обратно в склеру. Также возможно устранение через разрывы, и незначительные утечки в месте инъекции могут позволить проникновение роговицы через пассивную диффузию.
Рисунок 1: Субконъюнктивальная инъекция липосом в глаз. (А) Графическое изображение зелено-флуоресцентных липосом и субконъюнктивальная инъекция. (B) Состав и свойства легированного FL-DHPE липосомального препарата для глазной CLM-визуализации. (C) Зелено-флуоресцентные липосомы, образующие блеб при субконъюнктивальной инъекции. Эта цифра была адаптирована с разрешения Chaw S.Y. et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Временная шкала окулярной процедуры CLM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Карта глаз для сканирования CLM. Область 1 относится к области лимбуса, в то время как область 2 относится к области склеры. Видео и изображения были сняты с 1T в направлении против часовой стрелки, а затем 2T в аналогичном направлении против часовой стрелки. Поскольку игла была вставлена для инъекции от 2T к 2S, области интереса в основном 1T, 1S, 2T и 2S. Insert показывает размер зонда относительно глаза мыши. Эта цифра была адаптирована с разрешения Chaw S.Y. et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анализ изображений. (A) Анализ ImageJ флуоресцентных липосом проводился с использованием областей интереса (ROI), определенных для лимбусных (L) и склер (S) (B) глазных областей, количественно оцененных в области лимбуса для присутствия липосом. Возможными местами расположения липосом, обнаруженных в лимбусе, являются: 1) периферия роговицы, 2) лимбус или 3) периферия склеры. Эта цифра была адаптирована с разрешения Chaw S.Y. et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Контрастные распределения в лимбусе и склере. Распределение контраста в лимбусах (1S: Верхний, 1N: Носовой, 1I: Нижний, 1T: Височный) и склерах (2S: Верхний, 2N: Носовой, 2I: Нижний, 2T: Височный) областях одной репрезентативной мыши из каждой когорты (n = 4) в течение 7 дней для (A) флуоресцеина (Fl) контроля, (B) 100 нм нейтральных липосом (POPC-100). Красный цвет указывает на окрашивание EB. Шкала = 50 мкм. (C) Полученные изображения собираются на карте глаз для лучшего понимания. Эта цифра была адаптирована с разрешения Chaw S.Y. et al.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Кинетика клиренса 100 нм нейтральных липосом POPC в областях склер (A) и лимбуса (B) в течение 7 дней (n = 4 мыши на группу). Среднюю интенсивность флуоресценции сравнивали с помощью 2-полосной ANOVA с множественными сравнениями по отношению к предыдущему временному моменту; d1→3 и d3→7; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Репрезентативные гистологические изображения поперечных срезов (5 мкм) глаза мыши через день после инъекции липосом Fl-DHPE. Пунктирные линии указывают, где можно наблюдать липосомы, обозначенные зеленым цветом. Шкала = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Как показано из результатов, CLM предоставляет простой и осуществимый метод для изображения глазного распределения липосом в глазу. Ранее мы продемонстрировали использование CLM для характеристики локализации различных липосомальных составов в глазу мыши с течением времени1. Для неинвазивных применений CLM позволяет в режиме реального времени визуализировать переднюю поверхность глаза для понимания того, как липосомы распределяются в глазу у одного и того же животного. Это делает CLM пригодным для предварительного скрининга нанонесущих / DDS перед более полной количественной оценкой. Учитывая уникальные физико-химические свойства различных DDS, охарактеризовать его субкомпарантное распределение обычной гистологией довольно сложно. Последнее потребует исчерпывающего разрезания всего глаза и отдельных участков визуализации с помощью флуоресцентной микроскопии для общего ощущения клиренса DDS.
В соответствии с изображениями CLM (рисунок 5B, C) мы могли наблюдать зеленые флуоресцентные сигналы с помощью гистологии в областях роговицы, лимбуса и склеры глаза, собранных на 1-й день после инъекции липосом (рисунок 7). Примечательно, что CLM показал лучшую чувствительность, чем флуоресцентная микроскопия - липосомы в склерах могли быть четко обнаружены с помощью CLM (рисунок 5), но едва обнаружены флуоресцентным микроскопом (рисунок 7). Потеря сигнала может быть вызвана процедурами промывания и сечения, которые повлияли на удержание липосом в участках тканей. Хотя CLM ограничен в определении точного слоя ткани, в котором накапливаются липосомы, это, безусловно, осуществимый и относительно простой метод скрининга и оценки кандидатов в глазные терапии неинвазивно в режиме реального времени.
В то время как другие системы визуализации, такие как системы визуализации in vivo и флуорометры, также обеспечивают живую визуализацию или живую количественную оценку флуоресценции в глазу, они не так подходят для целей этого исследования. Системы визуализации in vivo не предлагают пространственного разрешения, необходимого для определения того, где находятся терапевтические средства в глазном пространстве. Представление о том, присутствуют ли терапевтические средства в глазном пространстве и их биораспределение, можно получить только при использовании системы визуализации in vivo20. Флуорометр позволяет измерять флуоресценцию вдоль оптической оси глаза и широко используется для изучения физиологических изменений в глазу. Поскольку существует трудность сканирования одной и той же оптической оси в каждый момент времени, согласованное пятно изображения не может быть сохранено. Это очень важно, особенно при изучении распределения систем доставки лекарств, в которых время их пребывания и скорость очистки от места инъекции совершенно неизвестны. Кроме того, место инъекции и распределение, ожидаемое для субконъюнктивальной инъекции, также не находятся в пределах диапазона оптической оси.
Критические шаги в протоколе включают строгое следование карте изображений, аналогичной карте глаз, показанной на рисунке 3 , и точную маркировку местоположений. Неправильная маркировка или отклонение от местоположения изображения приведет к несогласованности результатов. Поскольку интенсивность лазера может быть скорректирована для каждого сканирования, важно, чтобы интенсивность была последовательной для количественной оценки различных временных точек, чтобы быть сопоставимой. Также важно, чтобы зонд был свободен от мусора во время процесса визуализации. Поскольку глазная слизь может попасть на зонд во время визуализации, рекомендуется промывать зонд физиологическим раствором, если фоновые значения поднимаются выше заданного пользователем значения.
Помимо субконъюнктивальной инъекции, эта система CLM также может быть использована для изучения других путей доставки глаз, таких как введение глазных капель и интравитреальная инъекция (IVT). Однако из-за ограничения глубины визуализации это может быть не так полезно для IVT, если место инъекции и более глубокие глазные ткани являются основными областями, представляющими интерес. CLM также может быть использован в качестве формы прижизненной визуализации для изучения распределения DDS в других органах или тканях. Хотя эндоскопическая конфокальная микроскопия редко использовалась для изучения распределения DDS, она использовалась для изображения воспаления, вызванного пародонтитом21, мониторинга воспаления легких и инфекций22,23 и влияния лекарств на ангиогенез в опухолях24, что указывает на ряд других возможных применений для этой системы CLM.
В целом, этот протокол может служить этапом скрининга, чтобы выяснить, как изменения в составах DDS влияют на то, где они находятся или накапливаются, что может иметь решающее значение при разработке DDS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование финансировалось грантом NTU-Северо-Западного института наномедицины (NNIN), присужденным (SV), и частично грантом Сингапурского национального исследовательского фонда AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 и грантом Сингапура по здравоохранению и биомедицинским наукам (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) H18/01/a0/018, администрируемым Агентством по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR) (для AMC). Спасибо членам Лаборатории трансляционной и молекулярной визуализации Duke-NUS (LTMI) за содействие логистике и проведению исследований и обучению на оборудовании. Особая благодарность г-же Висне Новере за ее редакционную помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G.
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
