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Summary

Ce protocole vise à décrire une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en utilisant l’enregistrement par réseau de microélectrodes de l’ensemble du tissu du nœud sino-auriculaire afin d’identifier les défauts de stimulateur cardiaque chez la souris. Des agents pharmacologiques peuvent également être introduits dans cette méthode pour étudier leurs effets sur le rythme intrinsèque.

Abstract

Le nœud sino-auriculaire (SAN), situé dans l’oreillette droite, contient les cellules du stimulateur cardiaque, et le dysfonctionnement de cette région peut provoquer une tachycardie ou une bradycardie. L’identification fiable des défauts cardiaques nécessite la mesure de la fréquence cardiaque intrinsèque en empêchant en grande partie l’influence du système nerveux autonome, qui peut masquer les déficits de vitesse. Les méthodes traditionnelles d’analyse de la fonction intrinsèque des stimulateurs cardiaques comprennent le blocage autonome induit par les médicaments pour mesurer les fréquences cardiaques in vivo, les enregistrements cardiaques isolés pour mesurer les fréquences cardiaques intrinsèques et les enregistrements de bandes sino-auriculaires ou de patch-clamp unicellulaires de cellules de stimulateurs cardiaques sino-auriculaires pour mesurer les taux de déclenchement potentiels d’action spontanée. Cependant, ces techniques plus traditionnelles peuvent être techniquement difficiles et difficiles à exécuter. Nous présentons ici une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en effectuant des enregistrements de réseaux de microélectrodes (MEA) de préparations de nœuds sino-auriculaires à montage entier provenant de souris. Les MEA sont composés de plusieurs microélectrodes disposées selon un modèle en forme de grille pour l’enregistrement in vitro des potentiels de champ extracellulaire. La méthode décrite ici présente l’avantage combiné d’être relativement plus rapide, plus simple et plus précise que les approches précédentes pour l’enregistrement des fréquences cardiaques intrinsèques, tout en permettant un interrogatoire pharmacologique facile.

Introduction

Le cœur est un organe complexe régi à la fois par des influences cardiaques intrinsèques et extrinsèques telles que celles qui proviennent du cerveau. Le nœud sino-auriculaire (SAN) est une région définie dans le cœur qui abrite les cellules du stimulateur cardiaque (également appelées cellules sino-auriculaires, ou cellules SA) responsables de l’initiation et de la perpétuation du rythme cardiaque des mammifères^1,2. La fréquence cardiaque intrinsèque est la fréquence entraînée par les cellules du stimulateur cardiaque sans influence par d’autres influences cardiaques ou neuro-humorales, mais les mesures traditionnelles de la fréquence cardiaque chez les humains et les animaux vivants, telles que les électrocardiogrammes, reflètent à la fois les influences du stimulateur cardiaque et neuronales sur le cœur. L’influence neuronale la plus notable sur les cellules SA provient du système nerveux autonome, qui module constamment les schémas de tir pour répondre aux besoins physiologiques du corps³. À l’appui de cette idée, des projections sympathiques et parasympathiques peuvent être trouvées près du SAN^4. Le système nerveux cardiaque intrinsèque (ICNS) est une autre influence neuronale importante où le plexi ganglionnaire, en particulier dans les oreillettes droites, innerve et régule l’activité du SAN^5,6.

Comprendre les déficits de rythme est cliniquement important, car le dysfonctionnement peut sous-tendre de nombreux troubles cardiaques et contribuer au risque d’autres complications. Le syndrome des sinus malades (SSS) est une catégorie de maladies caractérisées par un dysfonctionnement du nœud sino-auriculaire qui entrave le bon rythme^7,8. Le SSS peut présenter une bradycardie sinusale, des pauses sinusales, un arrêt sinusal, un bloc de sortie sino-auriculaire et une alternance de bradyarythmies et de tachyarythmies⁹ et peut entraîner des complications, notamment un risque accru d’accident vasculaire cérébral embolique et de mort subite^8,10. Les personnes atteintes du syndrome de Brugada, un trouble cardiaque marqué par une fibrillation ventriculaire avec un risque accru de mort subite cardiaque, sont plus à risque d’événements arythmogènes si elles ont également un dysfonctionnement comorbide du SAN^11,12. Le dysfonctionnement sino-auriculaire peut également avoir des conséquences physiologiques au-delà du cœur. Par exemple, on a observé que le SSS déclenche des convulsions chez un patient en raison d’une hypoperfusion cérébrale^13.

Pour identifier les déficits sino-auriculaires, les fréquences cardiaques intrinsèques doivent être déterminées en mesurant l’activité du SAN sans l’influence du système nerveux autonome ou des facteurs humoraux. Cliniquement, cela peut être approximé par le blocage pharmacologique autonome¹⁴, mais cette même technique peut également être appliquée dans des modèles de mammifères pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque^15,16. Bien que cette approche bloque une grande partie des influences neuronales contributives et permette un examen cardiaque in vivo, elle n’élimine pas complètement toutes les influences extrinsèques sur le cœur. Une autre technique de recherche utilisée pour étudier la fonction cardiaque intrinsèque dans les modèles animaux est l’enregistrement cardiaque isolé à l’aide de cœurs perfusés de Langendorff, qui impliquent généralement des mesures à l’aide d’électrogrammes, de stimulation ou de réseaux multiélectroïdes épicandiens^17,18^,19,20. Bien que cette technique soit plus spécifique à la fonction cardiaque puisqu’elle consiste à retirer le cœur du corps, les mesures peuvent encore être influencées par des mécanismes d’autorégulation mécano-électriques qui pourraient influencer les mesures intrinsèques de la fréquence cardiaque²¹. Les enregistrements cardiaques isolés peuvent également être encore influencés par la régulation autonome par l’intermédiaire de l’ICNS^5,6,22,23. De plus, le maintien d’une température physiologiquement pertinente du cœur, qui est essentielle pour les mesures de la fonction cardiaque, peut être difficile dans les approches cardiaques isolées²⁰. Une méthode plus directe pour étudier la fonction SAN consiste à isoler spécifiquement le tissu SAN et à mesurer son activité. Cela peut être accompli par le biais de bandelettes SAN (tissu SAN isolé) ou de cellules de stimulateurs cardiaques SAN isolées^24,25. Les deux nécessitent un haut degré de formation technique, car le SAN est une région très petite et hautement définie, et l’isolement cellulaire pose un défi encore plus grand car la dissociation peut nuire à la santé globale de la cellule si elle n’est pas effectuée correctement. En outre, ces techniques nécessitent des compétences électrophysiologiques expertes afin d’enregistrer avec succès à partir du tissu ou des cellules à l’aide de microélectrodes d’enregistrement individuelles.

Dans ce protocole, nous décrivons une technique permettant d’enregistrer le SAN in vitro en utilisant un réseau de microélectrodes (MEA) pour obtenir des mesures de fréquence cardiaque intrinsèques. Cette approche présente l’avantage de rendre les enregistrements électrophysiologiques très spécifiques accessibles aux chercheurs dépourvus de compétences électrophysiologiques intensives. Les MEA ont déjà été utilisés pour étudier la fonction cardiomyocytaire dans des cultures cardiomyocytaires primaires^26,27,28 ,^29,30^,31,32, feuilles cardiaques^33,34,35^,36,37,38,39, et des montures entières de tissus^{40, 41,42,43,44,45,46,47}. Des travaux antérieurs ont également été effectués pour examiner les potentiels de terrain dans les tissus SAN^41,42. Ici, nous fournissons une méthodologie pour utiliser le MEA pour enregistrer et analyser les taux de tir SAN intrinsèques murins. Nous décrivons également comment cette technique peut être utilisée pour tester les effets pharmacologiques des médicaments sur les taux de tir intrinsèques du SAN en fournissant un échantillon d’expérience montrant les effets de la 4-aminopyridine (4-AP), un bloqueur de canaux K⁺ dépendant de la tension. En utilisant des repères anatomiques définis, nous pouvons enregistrer avec précision le SAN sans avoir à effectuer les dissections tissulaires étendues ou les isolements cellulaires requis dans d’autres méthodes. Bien que le MEA puisse être prohibitif, les enregistrements fournissent des mesures très spécifiques et fiables du rythme qui peuvent être utilisées dans un large éventail d’applications de recherche clinique et physiologique.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH), telles qu’approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Southern Methodist University. 1. Revêtement du réseau multiélectrodes (MEA) pour l’enregistrement Faire un tampon de borate de 25 mM. Dissoudre 0,953 g de Na2B4O7·10H2O dans 80 mL d’eau distillée. Ajuster le pH à 8,4 avec HCl, puis ajouter de l’eau distillée à un volume final de 100 mL. Faire une solution d’origine à 0,1 % de polyéthylèneimine (PEI). Ajouter 100 μL de 50 % (p/v) d’Î.-P.-É.-P. à 4,9 mL d’eau distillée pour faire une solution d’Î.-P.-É. à 1 %. Diluer la solution d’Î.-P.-É. à 1 % à 0,1 % dans un tampon de borate en ajoutant 1 mL de la solution d’Î.-P.-É. à 9 mL du tampon de borate de 25 mM. Pipette ~1 mL de la solution PEI à 0,1 % dans la boîte à réseau de microélectrodes (MEA) afin que les électrodes soient complètement recouvertes(Figure 1A et 1B).REMARQUE: Les microélectrodes de la MEA sont généralement composées de noir de platine ou de nanotubes de carbone et isolées avec du polyimide (ou de l’acrylique); les deux matériaux sont hydrophobes. En recouvrant le MEA d’un polymère cationique tel que le PEI, la surface hydrophobe du MEA est rendue plus hydrophile, ce qui permet aux échantillons de tissus d’entrer en contact avec la surface du MEA(Figure 1A1). Couvrir la boîte MEA avec un film thermoplastique pour réduire l’évaporation et laisser la MEA pendant la nuit à température ambiante(Figure 1C). Aspirer la solution PEI de la boîte MEA à l’aide d’une pipette, en prenant soin de ne pas toucher la grille d’électrodes qui peut endommager les électrodes, puis rincer ≥4 fois à l’eau distillée(Figure 1D). Conservez le MEA revêtu de PEI sous 1 à 2 mL d’eau ultrapure et scellé avec un film thermoplastique à 4 °C jusqu’à ce que nécessaire. Alternativement, stockez le MEA enduit en le submergeant dans un bécher rempli d’eau ultrapure (Figure 1E).REMARQUE: Le processus de revêtement PEI ne doit être effectué qu’une seule fois pour le MEA avant sa première utilisation, et après chaque session d’enregistrement, le MEA doit être stocké immergé dans de l’eau ultrapure. 2. Préparation de la solution complète de Tyrode pour la dissection tissulaire Fabriquer 1 000 mL de solution complète de Tyrode pour la dissection; tout d’abord, ajouter 8,1816 g de NaCl à 800 mL d’eau ultrapure. Ajouter la quantité suivante de produits chimiques à la solution: 0,4025 g de KCl; 0,1633 g de KH2PO4; 1,1915 g de HEPES; 0,9999 g de glucose; 0,0952 g de MgCl2; 0,2646 g de CaCl2·2H2O. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH, puis ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à ce que le volume total soit de 1 000 mL.REMARQUE: La composition finale de la solution de Complete Tyrode sera la suivante (en mM): 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,2 KH2PO4,5 HEPES, 5,55 glucose, 1 MgCl2,1,8 CaCl2. 3. Préparation de la solution de Tyrode oxygénée pour l’enregistrement Faire 500 mL de la solution de Tyrode; ajouter 4,003 g de NaCl à 400 mL d’eau ultrapure. Ajouter les quantités suivantes de produits chimiques à lasolution : 0,651 g de NaHCO3 ; 0,042 g de NaH2PO4; 0,132 g de CaCl2·2H2O; 0,149 g de KCl; 0,0476 g de MgCl2; 0,999 g de glucose. Ajustez le pH à 7,4 avec du HCl, puis ajoutez de l’eau ultrapure jusqu’à ce que le volume total soit de 500 mL. Oxygéner la solution avec du carbogène pendant au moins 30 min à température ambiante avant de commencer l’enregistrement.REMARQUE: La composition finale de la solution du Tyrode sera la suivante (en mM): 137 NaCl, 15,5 NaHCO3, 0,7 NaH2PO4, 1,8 CaCl2, 4 KCl, 1 MgCl2, 11,1 glucose. La solution de ce Tyrode a une composition légèrement différente de la solution de Tyrode Complète utilisée pour la dissection. 4. Préparation de la solution de 4-aminopyridine (4-AP) pour la modulation pharmacologique Faire une solution de travail de 1 mM de 4-AP; ajouter 18,82 mg de 4-AP à 200 mL de la solution du Tyrode à partir de l’étape 3. Oxygéner la solution de 4-AP pendant au moins 30 minutes avant l’expérience. 5. Préparation de la boîte de Petri pour la dissection Mélanger les composants en élastomère de silicone dans un rapport de 10:1 (en poids) de la base à l’agent de durcissement. Versez environ 15 mL de mélange d’élastomère de silicone dans une boîte de Petri de 60 mm de diamètre. Laisser durcir l’élastomère à température ambiante pendant 48 h avant utilisation.REMARQUE: La boîte de Petri siliconée peut être réutilisée pour de futures dissections. 6. Disséquage du nœud sino-auriculaire (SAN) Préparez la solution héparinisée de Complete Tyrode pour la dissection SAN. Ajouter 400 μL d’héparine (1 000 USP/mL) à 40 mL de solution de Complete Tyrode et réchauffer au bain-marie à 37 °C. Injecter à la souris par voie intrapéritonéale 200-300 μL d’héparine (1000 USP/mL) et laisser l’animal reposer pendant 10 min. Euthanasier la souris héparinisée par surdosage d’isoflurane. Placez la souris dans une petite chambre en verre qui contient des vapeurs d’isoflurane générées en ajoutant 200 à 300 μL d’isoflurane liquide à un papier filtre à l’intérieur d’un tube en plastique perforé.REMARQUE: Parce que l’isoflurane peut causer une irritation de la peau et peut également être absorbé par la peau, le liquide ne doit pas entrer en contact direct avec la souris. Par conséquent, la lingette imbibée d’isoflurane est placée dans un tube perforé pour administration. Vérifier la mort par l’arrêt du mouvement et de l’effort respiratoire et par l’absence d’un réflexe de pincement des orteils. La mort prend généralement environ 1-2 minutes après le placement dans la chambre.REMARQUE: La mort est généralement accompagnée d’une miction. Placez la souris en position couchée sur une planche de dissection avec les pattes tendues et fixez les pattes à la planche à l’aide d’aiguilles de seringue de 1 pouce de long et de calibre 23. Ensuite, retirez la fourrure à proximité du fond de la cage thoracique en utilisant des ciseaux chirurgicaux et en coupant la fourrure aux racines.REMARQUE: Pour une carte de dissection, des couvercles de refroidisseur en polystyrène peuvent être utilisés. Tout en tenant la peau avec un hémostat, utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une incision transversale dans la peau juste en dessous du bas de la cage thoracique d’environ l’arc costal gauche à l’arc costal droit (Figure 3A). Coupez le péritoine avec des ciseaux chirurgicaux et séparez soigneusement le foie du diaphragme, en prenant soin de ne pas entailler le foie, ce qui provoquera des saignements excessifs (Figure 3B). Inciser le diaphragme le long du thorax pour exposer la cavité thoracique (Figure 3C-D). À l’aide de ciseaux chirurgicaux, coupez les parois latérales de la cage thoracique des bords des arcs costaux jusqu’aux clavicules pour exposer le cœur, en prenant soin d’éviter d’endommager le cœur (Figure 3D). Ensuite, utilisez une aiguille de seringue de calibre 23 pour épingler la cage thoracique sur l’épaule, en la maintenant en place et hors du champ chirurgical. Utilisez une pipette de transfert pour égoutter la solution héparinisée de Tyrode complète au chaud (37 °C) sur le cœur pour le garder humide.REMARQUE: Ne laissez pas le cœur se dessécher. Retirez les poumons en les tenant avec une pince Graefe extra fine et coupez la trachée avec des ciseaux chirurgicaux (Figure 3E). Tenez l’apex du cœur avec une pince Graefe extra fine et retirez-la en coupant l’aorte et la veine cave avec des ciseaux chirurgicaux. Transférer le cœur dans une boîte de Petri contenant de l’élastomère de silicone durci(Figure 4A)et utiliser une pipette de transfert pour baigner le cœur avec 2-3 mL de solution chaude (37 °C) héparinisée de Tyrode complet.REMARQUE: Veillez à ne pas endommager la délicate paroi postérieure des oreillettes droites, qui contient le SAN, et les veines auriculaires droites connectées. Baigner le cœur avec la solution de Complete Tyrode empêche le cœur de se dessécher, mais ne submerge pas complètement le cœur dans la solution car cela nuirait à la visibilité pendant la dissection. Orientez le cœur avec l’oreillette droite à la droite de l’expérimentateur et l’oreillette gauche à la gauche de l’expérimentateur.REMARQUE: La dissection du tissu SAN doit être effectuée rapidement afin de prévenir les blessures liées à l’ischémie. Attachez l’apex du cœur au plat avec une épingle à dissection. Ensuite, tout en tenant la veine cave inférieure avec des pinces de laminectomie Dumont #2, insérez une aiguille de seringue de 22 G à travers la veine cave inférieure et supérieure pour localiser leur position dans l’oreillette droite, ce qui identifie également la position approximative du SAN (situé dans la tache de tissu entre la veine cave inférieure et supérieure (Figure 4B). À l’aide de petites broches de dissection, épinglez les appendices auriculaires gauche et droit au plat. Tout en tenant l’appendice auriculaire gauche avec du dumont #2 pinces de laminectomie, placez une broche de dissection à travers l’appendice auriculaire gauche pour le maintenir en place. Tout en tenant l’appendice auriculaire droit avec du dumont #55 pince, placez une broche de dissection à travers l’appendice auriculaire droit pour le maintenir en place.REMARQUE: Le même type de pince peut être utilisé pour maintenir les appendices auriculaires gauche et droit si vous le souhaitez. Retirez l’aiguille de la seringue qui s’étend sur la veine cave. Pour libérer le sang du cœur, utilisez des ciseaux Castroviejo pour enlever l’apex du cœur (c’est-à-dire la moitié inférieure) en faisant une incision transversale à travers les ventricules (Figure 4C). Ensuite, lavez le cœur en ajoutant la solution héparinisée chaude (37 °C) de Complete Tyrode avec une pipette de transfert. Utilisez des ciseaux Castroviejo pour couper le long du septum auriculo-ventriculaire en gardant l’incision plus proche du ventricule que des oreillettes. Continuez à couper le long du septum auriculo-ventriculaire jusqu’à ce que les oreillettes soient séparées des ventricules. Couper le long du septum interauriculaire pour enlever l’oreillette gauche. Placez les broches de dissection à la périphérie de l’oreillette droite pour le faire s’allonger à plat(Figure 4D). Retirez toute graisse, tout vaisseau ou tout tissu restant de l’oreillette à l’aide des ciseaux Castroviejo. Localisez le SAN dans l’oreillette droite, qui dans cette orientation est approximativement bordée par la veine cave supérieure (en haut), la veine cave inférieure (en bas) et la cristae terminalis (à gauche)(Figure 4D).REMARQUE: Le crista terminalis apparaît comme une crête musculaire sombre entre l’appendice auriculaire droit et le SAN. Souvent, l’artère SAN peut également être vue en cours d’application à travers le SAN (Figure 4D). 7. Préparation du système MEA pour l’enregistrement Ajouter la solution de Tyrode (à partir de l’étape 3) à la bouteille de solution d’entrée (Figure 5C) et l’oxygéner en allumant le flux de gaz carbogène (Figure 5A) vers le système.REMARQUE: La solution du Tyrode utilisée pour l’enregistrement est légèrement différente dans la composition de la solution du Tyrode complet utilisée pour la dissection. Vérifier l’écoulement du carbogène en observant des bulles dans la fiole conique, qui est utilisée pour humidifier le gaz (Figure 5B), et la bouteille de solution d’entrée (Figure 5C). Insérez le tuyau d’entrée de la pompe péristaltique (Figure 5D) dans la solution d’enregistrement du Tyrode (Figure 5C). Ensuite, insérez le tuyau de sortie de la pompe péristaltique dans le flacon de collecte (Figure 5I). Réglez la pompe péristaltique à 25 tr/min, ce qui donne un débit de 2 mL/ min et démarrez la pompe. Vérifiez que le système ne s’est pas vérifié s’il y a une fuite ou un débordement de la mémoire tampon. Réglez le régulateur de température à 37 °C, la température physiologique des souris (Figure 5E). 8. Placer le tissu cardiaque sur la grille MEA Transférer le tissu SAN disséqué à l’aide d’un pinceau (Figure 6A) de la boîte de Petri disséquante sur la grille MEA (Figure 1A1). Tout en regardant sous un microscope inversé, positionnez doucement le tissu avec un pinceau doux afin que la région SAN recouvre la grille d’électrodes. Re-positionnez le tissu si nécessaire pour vous assurer qu’il est à plat sur la grille d’électrodes, en établissant un bon contact avec les électrodes.REMARQUE: Un pinceau doux est nécessaire pour déplacer le tissu afin d’éviter d’endommager la grille d’électrodes. Une fois que le tissu est correctement positionné, utilisez une pince osseuse (ou toute pince incurvée) pour placer la maille sur le tissu (Figure 6A). Utilisez ensuite la pince à os pour placer l’ancre de la harpe (Figure 6A) sur le maillage pour maintenir tout en place (Figure 6B). Prenez une photo du positionnement du tissu sur le MEA afin que l’activité des électrodes individuelles puisse être corrélée avec leur emplacement anatomique pendant l’enregistrement. Cela peut être fait en tenant un smartphone jusqu’à l’objectif du microscope inversé ou en utilisant une caméra de microscope attachée.REMARQUE: Si l’orientation du MEA n’est pas modifiée après la prise de la photo, l’électrode en haut à gauche apparaîtra comme premier canal (Ch1) pendant l’enregistrement. Placez la boîte MEA sur la plaque de connexion (Figure 5F et 6C) et placez soigneusement le capuchon de perfusion (Figure 6C) sur la boîte MEA sans perturber l’ancrage de la tranche de harpe. Le bouchon de perfusion peut être fixé à l’aide d’un morceau de ruban adhésif de laboratoire(Figure 6C).REMARQUE: En plus d’avoir des tuyaux d’entrée et de sortie de solution réglables, le bouchon dispose également d’un port pour la livraison de gaz (Figure 6C). De plus, l’anneau d’électrode de référence traverse le capuchon (Figure 6C). Laissez le tissu se remettre de la manipulation et s’acclimater à la chambre pendant 15 à 20 minutes avant l’enregistrement. 9. Définition du protocole d’acquisition de données pour l’enregistrement REMARQUE: Les étapes suivantes décrivent l’ouverture du protocole logiciel pour l’enregistrement spontané des battements et la définition des conditions d’enregistrement. Les spécificités de ces étapes peuvent varier en fonction du logiciel spécifique utilisé, mais les grandes lignes doivent rester les mêmes. Allumez l’amplificateur (Figure 5G) et configurez un flux de travail pour l’enregistrement dans le logiciel de l’ordinateur (Figure 5H). Ouvrez le logiciel et cliquez sur le Workflow. Sélectionnez Ouvrir un nouveau dossier. Ouvrez le dossier À partir des modèles. Sélectionnez 64MD1-1920X1080 (en fonction de la résolution de votre bureau). Ouvrez le dossier QT. Ouvrez le dossier Enregistrement spontané. Sélectionnez Beat_recording.moflo et ouvrez-le (Figure 7A). Définissez les paramètres d’enregistrement pour spécifier le nombre de traces, la durée de la trace, l’intervalle de trace, la tension d’entrée, la fréquence d’échantillonnage, etc., en fonction des conditions d’enregistrement souhaitées(Figure 7B).REMARQUE: Pour l’acquisition de données de fréquence de battement et d’inter-pointes, utilisez généralement une tension de plage d’entrée de 2,9 mV, un filtre passe-haut de 1 Hz, un filtre passe-bas de 1000 Hz et un taux d’échantillonnage de 20 kHz. Pour marquer différentes phases ou conditions de l’expérience, telles qu’avant et après l’administration du médicament, cliquez sur l’onglet Annotations pour ajouter les notations souhaitées (Figure 7C). Pour spécifier la destination du fichier pour les données à collecter, sélectionnez la zone Activer le stockage et entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier. 10. Effectuer l’enregistrement et la collecte des données Cliquez sur le bouton Enregistrer et lire dans la barre de menus la plus haute du logiciel d’acquisition pour démarrer l’enregistrement. Acquérir des données pour 10 traces d’une durée de 1 min avec des intervalles de 2 min entre les traces. À partir de ces traces initiales, vérifier que les formes d’onde enregistrées sont compatibles avec une préparation tissulaire saine et de haute qualité en confirmant que la majorité des canaux d’enregistrement présentent des amplitudes de signal de ≥ 0,5 mV et des intervalles d’inter-pointes identiques(Figure 8).NOTE: Une première évaluation de l’activité et des formes d’onde des microélectrodes individuelles correspondant à leurs emplacements anatomiques peut être effectuée en référençant l’image acquise après le positionnement du tissu sur le MEA. Pour mesurer les effets des médicaments sur les tissus, mettez en pause l’enregistrement après avoir acquis les données de base initiales en cliquant sur le bouton pause dans la barre de menus la plus haute.REMARQUE: La phase de réponse médicamenteuse de l’expérience peut être notée dans l’enregistrement en cliquant sur l’onglet Annotations et en ajoutant la notation souhaitée comme décrit ci-dessus (Figure 7C). Mettez la pompe en pause et basculez le tuyau d’entrée de la pompe de la solution d’enregistrement normale vers la solution de Tyrode contenant le médicament souhaité de votre choix.REMARQUE: Dans l’exemple d’expérience, la solution de Tyrode a été utilisée avec 1 mM de 4-aminopyridine (4-AP). Redémarrez la pompe et suspendez l’enregistrement pour recommencer à collecter des données. Une fois que la solution de Tyrode perfusée par le médicament a atteint le tissu, enregistrez 10 traces de la même manière que précédemment pour les enregistrements de base.REMARQUE: Les traces prendront un certain temps à se stabiliser lorsque le médicament infuse dans la chambre d’enregistrement. Le mécanisme d’action du médicament peut également affecter la stabilité de l’enregistrement. Pour les médicaments qui ont des mécanismes d’action réversibles, une période de lavage doit également être enregistrée pour confirmer la restauration de l’activité aux niveaux de base, ce qui est un indicateur de tissu sain. Cliquez sur Arrêter pour terminer les enregistrements. Prenez une photo finale du positionnement du tissu sur le MEA au microscope au cas où le tissu se serait déplacé après la procédure d’enregistrement initiale. 11. Nettoyage de la configuration après l’enregistrement Nettoyez le MEA. Une fois l’enregistrement terminé, retirez délicatement la solution d’enregistrement de la parabole MEA à l’aide d’une micropipette de 1 mL.REMARQUE: Veillez à ne pas entrer en contact avec les électrodes MEA qui peuvent les endommager. Retirez la maille et l’ancrage de la harpe à l’avec une pince à os (ou une pince incurvée). Ensuite, utilisez un pinceau pour déloger le tissu de la surface MEA en faisant toujours attention à ne pas toucher les microélectrodes individuelles. À l’aide d’un flacon de lavage, rincez doucement le plat MEA avec de l’eau ultrapure environ 3 à 4 fois. Conserver le MEA nettoyé immergé dans de l’eau ultrapure à 4 °C. Rincez le tube du système en y faisant couler de l’eau ultrapure pendant au moins 5 minutes en utilisant le réglage de la vitesse maximale de la pompe péristaltique.REMARQUE: Pour prévenir la croissance fongique, aucune solution d’eau ou de tampon ne doit être laissée à l’intérieur du tube après le nettoyage. 12. Analyse des enregistrements MEA pour mesurer la fréquence des battements SAN Ouvrez le fichier de données enregistré enregistré dans le modèle « Beat_frequency_analysis » du logiciel d’analyse (Figure 9). Cliquez sur le bouton Lecture et laissez l’ensemble de l’enregistrement s’exécuter pour visualiser l’ensemble de données et attribuer les paramètres d’analyse appropriés. Sélectionnez la fenêtre de binning pour le format d’affichage souhaité des données, qu’il s’agisse d’une moyenne par trace ou d’une moyenne par temps (Figure 10A). Sélectionnez les canaux à inclure dans l’analyse et définissez les maxima d’amplitude ou les valeurs seuils d’amplitude minimale souhaités pour l’identification automatisée des pics de forme d’onde (Figure 10B).REMARQUE : Un canal individuel, une combinaison de canaux ou les 64 canaux peuvent être sélectionnés pour analyse à cette étape (Figure 9). Si les valeurs seuils sélectionnées sont trop proches des valeurs maximales et minimales de la forme d’onde, certains pics de forme d’onde peuvent ne pas être identifiés par le logiciel d’analyse. Définissez la quantité de temps avant et après le pic à inclure dans l’analyse.REMARQUE : Les réglages de 50 ms avant le pic et de 100 ms après le pic fonctionnent généralement bien (Figure 10B). Après avoir défini les conditions d’analyse, cliquez à nouveau sur le bouton Lecture pour réexécuter l’ensemble de données et confirmer que les paramètres d’analyse sont appropriés pour l’extraction de pics. Aux fins de l’analyse, identifier les trois traces consécutives les plus stables qui présentent un taux de battement stable pour chaque trace dans la majorité des canaux à la fois pendant la période de référence de l’expérience et trois autres traces stables consécutives pendant la période d’exposition au médicament(Figure 10A). Spécifiez les traces de début et de fin pour l’analyse et entrez la durée de chaque trace à analyser (Figure 9). Avant de commencer l’analyse, cochez les cases d’activation pour Enregistrer le battement par minute et Enregistrer l’intervalle d’interspike (Figure 10B). Entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier (Figure 10B). Les données analysées pour la fréquence de battement et l’intervalle interspike seront enregistrées sous forme de format ASCII (texte).REMARQUE: Pour analyser différentes conditions (telles que la réponse initiale et médicamenteuse), l’analyse doit être effectuée séparément pour chaque condition. Cliquez sur le bouton Lire et enregistrer dans la barre d’onglets supérieure pour lancer l’analyse. Pour exporter les données pour d’autres applications, cochez les cases Enregistrer le battement par minute et Enregistrer l’intervalle entre les broches (Figure 10B). Entrez le nom de fichier souhaité dans la zone Modificateur de nom de fichier (Figure 10B) et cliquez sur Enregistrer pour enregistrer les données analysées au format texte ASCII dans le dossier sélectionné.

Representative Results

Après avoir permis au tissu de s’acclimater dans le plat pendant 15 min, 10 traces d’une minute sont enregistrées. Notre protocole actuel enregistre l’activité pendant plus d’une heure, mais nous avons enregistré des modèles de tir stables pendant ≥4 h dans des données non publiées non montrées ici. Si une préparation expérimentale est bonne pour la collecte de données, chaque canal d’enregistrement doit présenter des formes d’onde récurrentes cohérentes et uniformément espacées (c.-à-d. de…

Discussion

La pratique et la maîtrise du processus de dissection SAN sont impératives car le tissu est fragile et un tissu sain est nécessaire pour un enregistrement réussi. Pendant la dissection SAN, une orientation correcte est essentielle pour obtenir la bonne région de tissu. Cependant, l’orientation originale du cœur peut être facilement perdue pendant le processus de dissection, ce qui complique cette entreprise. Par conséquent, pour assurer la bonne orientation gauche-droite, les oreillettes doivent être inspecté…

Materials

4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
22 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-5A	Used for dissection
23 gauge syringe needle	Fisher Scientific	14-826-6C	Used for dissection
60mm Petri Dishes	Genesee Scientific	32-105G
500mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1C	Used to store solutions
1000 mL Pyrex Bottle	Fisher Scientific	06-414-1D	Used to store solutions
Bone Forceps	Fine Science Tools	16060-11
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen (95% O2, 5% CO2)
Castroviejo Scissors, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
Data Acquisition PC			CPU: Intel Xeon or Intel Core i7, Memory: 8GB, HDD: 1TB, Graphic Card: NVIDIA or On-board, Screen: 1920×1080
Dissection Microscope	Jenco
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 Laminectomy Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
Extra Fine Graefe Forceps	Fine Science Tools	11152-10
Glass Chamber	Grainger	49WF30	Used for mouse euthanization
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	Used for pH balancing
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Inverted Microscope	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Lab Tape	Fisher Scientific	15-950
Light for Dissection Microscope	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
Magesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 Head Amplifier	MED64	MED-A64HE1S
MED64 Main Amplifier	MED64	MED-A64MD1A
MED64 Perfusion Cap	MED64	MED-KCAP01
MED64 Perfusion Pipe Holder Kit	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	Warner Instruments	640246
Microelectrode array (MEA)	Alpha Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		Specific software for the MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	Used for pH balancing
Normal Saline	Ultigiene	NDC 50989-885-17
Paint Brush	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
Peristaltic Pump	Gilson	F155009
Peristaltic Pump Tubing	Fisher Scientific	14-171-298	1/8'' Interior Diameter
Polyethyleneimine	Sigma	P3143
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6297
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S6566
Sodium tetraborate	Sigma	S9640
Surgical Scissors	Fine Science Tools	14074-09
Transfer Pipets (3mL graduated)	Samco Scientific	225