Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris

Summary

Ce protocole vise à décrire une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en utilisant l’enregistrement par réseau de microélectrodes de l’ensemble du tissu du nœud sino-auriculaire afin d’identifier les défauts de stimulateur cardiaque chez la souris. Des agents pharmacologiques peuvent également être introduits dans cette méthode pour étudier leurs effets sur le rythme intrinsèque.

Abstract

Le nœud sino-auriculaire (SAN), situé dans l’oreillette droite, contient les cellules du stimulateur cardiaque, et le dysfonctionnement de cette région peut provoquer une tachycardie ou une bradycardie. L’identification fiable des défauts cardiaques nécessite la mesure de la fréquence cardiaque intrinsèque en empêchant en grande partie l’influence du système nerveux autonome, qui peut masquer les déficits de vitesse. Les méthodes traditionnelles d’analyse de la fonction intrinsèque des stimulateurs cardiaques comprennent le blocage autonome induit par les médicaments pour mesurer les fréquences cardiaques in vivo, les enregistrements cardiaques isolés pour mesurer les fréquences cardiaques intrinsèques et les enregistrements de bandes sino-auriculaires ou de patch-clamp unicellulaires de cellules de stimulateurs cardiaques sino-auriculaires pour mesurer les taux de déclenchement potentiels d’action spontanée. Cependant, ces techniques plus traditionnelles peuvent être techniquement difficiles et difficiles à exécuter. Nous présentons ici une nouvelle méthodologie pour mesurer la vitesse de tir cardiaque intrinsèque en effectuant des enregistrements de réseaux de microélectrodes (MEA) de préparations de nœuds sino-auriculaires à montage entier provenant de souris. Les MEA sont composés de plusieurs microélectrodes disposées selon un modèle en forme de grille pour l’enregistrement in vitro des potentiels de champ extracellulaire. La méthode décrite ici présente l’avantage combiné d’être relativement plus rapide, plus simple et plus précise que les approches précédentes pour l’enregistrement des fréquences cardiaques intrinsèques, tout en permettant un interrogatoire pharmacologique facile.

Introduction

Le cœur est un organe complexe régi à la fois par des influences cardiaques intrinsèques et extrinsèques telles que celles qui proviennent du cerveau. Le nœud sino-auriculaire (SAN) est une région définie dans le cœur qui abrite les cellules du stimulateur cardiaque (également appelées cellules sino-auriculaires, ou cellules SA) responsables de l’initiation et de la perpétuation du rythme cardiaque des mammifères^1,2. La fréquence cardiaque intrinsèque est la fréquence entraînée par les cellules du stimulateur cardiaque sans influence par d’autres influences cardiaques ou neuro-humorales, mais les mesures tradi....

Protocol

Toutes les procédures expérimentales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH), telles qu’approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Southern Methodist University.

1. Revêtement du réseau multiélectrodes (MEA) pour l’enregistrement

1. Faire un tampon de borate de 25 mM.
   1. Dissoudre 0,953 g de Na₂B₄O₇·10_H2O dans 80 mL d’eau distillée.
   2. Ajuster le pH à 8,4 avec HCl, puis ajouter de l’eau distillée à un volume final de 100 mL.
2. Faire une solution d’origine à 0,1 % de ....

Results

Après avoir permis au tissu de s’acclimater dans le plat pendant 15 min, 10 traces d’une minute sont enregistrées. Notre protocole actuel enregistre l’activité pendant plus d’une heure, mais nous avons enregistré des modèles de tir stables pendant ≥4 h dans des données non publiées non montrées ici. Si une préparation expérimentale est bonne pour la collecte de données, chaque canal d’enregistrement doit présenter des formes d’onde récurrentes cohérentes et uniformément espacées (c.-à-d. des pointes) de forme uniforme po.......

Discussion

La pratique et la maîtrise du processus de dissection SAN sont impératives car le tissu est fragile et un tissu sain est nécessaire pour un enregistrement réussi. Pendant la dissection SAN, une orientation correcte est essentielle pour obtenir la bonne région de tissu. Cependant, l’orientation originale du cœur peut être facilement perdue pendant le processus de dissection, ce qui complique cette entreprise. Par conséquent, pour assurer la bonne orientation gauche-droite, les oreillettes doivent être inspectées visuellem.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
Aiguille de seringue de calibre 22	Fisher Scientific	14-826-5A	Utilisé pour la dissection
Aiguille de seringue de calibre 23	Fisher Scientific	14-826-6C	Utilisé pour la dissection
Boîtes de Pétri de 60mm	Genesee Scientific	32-105G
500mL Bouteille en Pyrex	Fisher Scientific	06-414-1C	Utilisé pour stocker les solutions
1000 mL Bouteille en pyrex	Fisher Scientific	06-414-1D	Utilisé pour stocker les solutions
Pinces à os	Outils pour les sciences fines	16060-11
Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2· ; 2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
Carbogen (95 % O2, 5 % CO2)
Castroviejo Ciseaux, 4"	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
PC			d’acquisition de donnéesProcesseur : Intel Xeon ou Intel Core i7, Mémoire : 8 Go, Disque dur : 1 To, Carte graphique : NVIDIA ou intégrée, Écran : 1920x1080
Dissection Microscope	Jenco
Dissecting Pins	Fine Science Tools	26002-20
Dumont #2 Laminectomie Forceps	Fine Science Tools	11223-20
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
; Pince Graefe extra fine	Outils scientifiques fins	11152-10
Chambre en verre	Grainger	49WF30	Utilisé pour l’euthanasie de la souris
Harp Anchor Kit	Warner Instruments	; SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	Utilisé pour l’équilibrage du pH
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
Microscope inversé	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Bande de laboratoire	Fisher Scientific	15-950
Lumière pour microscope de dissection	Dolan-Jenner	MI150DG 660000391014
Chlorure de magesium (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 Amplificateur de tête	MED64	MED-A64HE1S
MED64 Amplificateur principal	MED64	MED-A64MD1A
MED64 Capuchon de perfusion	MED64	MED-KCAP01
MED64 Kit de support de tuyau de perfusion	MED64	MED-KPK02
MED64 ThermoConnector	MED64	MED-CP04
Mesh	; Warner Instruments	640246
Réseau de microélectrodes (MEA)	Alpha Med Scientific	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		Logiciel spécifique pour le MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	Utilisé pour l’équilibrage du pH
Normal Saline	Ultigiene	NDC 50989-885-17
Pinceau	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
Pompe péristaltique	Gilson	F155009
Tube de pompe péristaltique	Fisher Scientific	14-171-298	1/8'' Diamètre intérieur
Polyéthylèneimine	Sigma	P3143
Chlorure de potassium (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6297
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher Scientific	S671-3
Sylgruard Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
Phosphate de sodium monobasique	Sigma	S6566
Tétraborate de sodium	Sigma	S9640
Ciseaux chirurgicaux	Fine Science Tools	14074-09
Pipettes de transfert (3mL graduées)	Samco Scientific	225