Summary
Die Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie erfordert ein geeignetes Softwarepaket und eine benutzerfreundliche Pipeline für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. Hier präsentieren wir die Anwendung eines vollautomatischen Bilderfassungssoftwarepakets, Latitude-S, und einer praktischen Pipeline zur Datenerfassung von vitrifizierten Biomolekülen unter niedrig dosierten Bedingungen.
Abstract
Technologische und methodische Fortschritte in der Einzelpartikel-Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) haben in den vergangenen Jahren einen neuen Weg für die hochauflösende Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle eröffnet. Trotz der bemerkenswerten Fortschritte in der Kryo-EM gibt es noch Raum für Verbesserungen in verschiedenen Aspekten des Einzelpartikelanalyse-Workflows. Die Einzelpartikelanalyse erfordert ein geeignetes Softwarepaket für die automatische Datenerfassung mit hohem Durchsatz. In den letzten acht Jahren wurden mehrere Softwarepakete für die automatische Datenerfassung für die automatische Bildgebung von Einzelpartikel-Kryo-EM entwickelt. Dieser Beitrag stellt eine Anwendung einer vollautomatischen Bilderfassungspipeline für vitrifizierte Biomoleküle unter niedrig dosierten Bedingungen vor.
Es demonstriert ein Softwarepaket, das Kryo-EM-Daten vollständig, automatisch und präzise sammeln kann. Darüber hinaus können verschiedene mikroskopische Parameter durch dieses Softwarepaket einfach gesteuert werden. Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial dieses Softwarepakets bei der automatisierten Bildgebung des Spike-Proteins SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus 2) mit einem 200-keV-Kryo-Elektronenmikroskop, das mit einem direkten Elektronendetektor (DED) ausgestattet ist. Rund 3.000 Kryo-EM-Filmbilder wurden in einer einzigen Sitzung (48 h) der Datenerhebung aufgenommen, was zu einer atomaren Auflösungsstruktur des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 führte. Darüber hinaus zeigt diese Strukturstudie, dass das Spike-Protein zwei Hauptkonformationen annimmt, 1-RBD (Rezeptor-bindende Domäne) offen und alle RBD nach unten geschlossenen Konformationen.
Introduction
Einzelpartikel-Kryo-EM hat sich zu einer gängigen strukturbiologischen Technik zur hochauflösenden Strukturbestimmung biologischer Makromoleküle entwickelt1. Die Einzelpartikelrekonstruktion hängt von der Aufnahme einer großen Anzahl von Mikroaufnahmen von verglasten Proben ab, um zweidimensionale (2D) Partikelbilder zu extrahieren, die dann verwendet werden, um eine dreidimensionale (3D) Struktur eines biologischen Makromoleküls zu rekonstruieren2,3. Vor der Entwicklung von DEDs lag die durch die Einzelpartikelrekonstruktion erreichte Auflösung zwischen 4 und 30 Å4,5. Vor kurzem hat die erreichbare Auflösung von Einzelpartikel-Kryo-EM mehr als 1,8 Å6 erreicht. DED und automatisierte Datenerfassungssoftware haben wesentlich zu dieser Auflösungsrevolution beigetragen7, bei der menschliche Eingriffe zur Datenerfassung minimal sind. Im Allgemeinen wird die Kryo-EM-Bildgebung bei niedrigen Elektronendosisraten (20-100 e/Å2) durchgeführt, um die durch Elektronenstrahle induzierte Strahlenschädigung biologischer Proben zu minimieren, was zu dem niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) im Bild beiträgt. Diese niedrige SNR behindert die Charakterisierung der hochauflösenden Strukturen biologischer Makromoleküle mittels Einzelpartikelanalyse.
Die Elektronendetektoren der neuen Generation sind CMOS-basierte Detektoren (Complementary Metal-Oxide-Semiconductor), die diese niedrigen SNR-bezogenen Hindernisse überwinden können. Diese CMOS-Kameras mit direkter Detektion ermöglichen ein schnelles Auslesen des Signals, wodurch die Kamera eine bessere Punktspreizungsfunktion, ein geeignetes SNR und eine hervorragende Detektivquanteneffizienz (DQE) für biologische Makromoleküle beiträgt. Direktdetektionskameras bieten ein hohes SNR8 und ein geringes Rauschen in den aufgenommenen Bildern, was zu einer quantitativen Steigerung der Detektivquanteneffizienz (DQE) führt - ein Maß dafür, wie viel Rauschen ein Detektor zu einem Bild hinzufügt. Diese Kameras zeichnen auch Filme mit einer Geschwindigkeit von Hunderten von Bildern pro Sekunde auf, was eine schnelle Datenerfassung ermöglicht9,10. All diese Eigenschaften machen schnelle Direktdetektionskameras für anwendungen mit niedriger Dosis geeignet.
Bewegungskorrigierte Stapelbilder werden für die Datenverarbeitung verwendet, um die 2D-Klassifizierung zu berechnen und eine 3D-Dichtekarte von Makromolekülen mit verschiedenen Softwarepaketen wie RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 und EMAN215 zu rekonstruieren. Für die Einzelpartikelanalyse ist jedoch ein enormer Datensatz erforderlich, um eine hochauflösende Struktur zu erreichen. Daher sind automatische Datenerfassungsmauten für die Datenerfassung von großer Bedeutung. Um große Kryo-EM-Datensätze zu erfassen, wurden in den letzten zehn Jahren mehrere Softwarepakete verwendet. Dedizierte Softwarepakete wie AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS und EPU wurden für die automatisierte Datenerfassung entwickelt.
Diese Softwarepakete verwenden Routineaufgaben, um Bohrungspositionen automatisch zu finden, indem sie die Bilder mit geringer Vergrößerung mit Bildern mit hoher Vergrößerung korrelieren, was bei der Identifizierung von Löchern mit glasigem Eis von geeigneter Eisdicke für die Bildaufnahme unter niedrig dosierten Bedingungen hilft. Diese Softwarepakete haben die Anzahl der sich wiederholenden Aufgaben reduziert und den Durchsatz der Kryo-EM-Datenerfassung erhöht, indem sie mehrere Tage lang kontinuierlich eine große Menge an qualitativ hochwertigen Daten ohne Unterbrechung und die physische Anwesenheit des Bedieners erfasst haben. Latitude-S ist ein ähnliches Softwarepaket, das zur automatischen Datenerfassung für die Einzelpartikelanalyse verwendet wird. Dieses Softwarepaket ist jedoch nur für K2/K3-DEDs geeignet und wird mit diesen Detektoren ausgeliefert.
Dieses Protokoll demonstriert das Potenzial von Latitude-S bei der automatisierten Bilderfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins mit einem direkten Elektronendetektor, der mit einem 200 keV Kryo-EM ausgestattet ist (siehe Materialtabelle). Mit diesem Datenerfassungstool werden automatisch 3.000 Filmdateien des SARS-CoV-2-Spike-Proteins erfasst und eine weitere Datenverarbeitung durchgeführt, um eine Spike-Proteinstruktur mit einer Auflösung von 3,9-4,4 Å zu erhalten.
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Protocol
HINWEIS: Für die Kryo-EM-Datenerfassung sind drei wichtige Schritte erforderlich: 1. Kryo-EM-Rastervorbereitung, 2. Kalibrierung und Ausrichtung des Mikroskops, 3. automatische Datenerfassung (Abbildung 1). Des Weiteren gliedert sich die automatisierte Datenerfassung in a. geeignete Flächenauswahl, b. Optimierung von Latitude-S, c. Start der automatischen Lochauswahl und d. Start der automatischen Datenerfassung (Abbildung 1).
1. Cryo-EM-Netzvorbereitung und Probenbeladung zur automatischen Datenerfassung
- Reinigen Sie die Gitter mit einem Glühentleerer und variieren Sie die Leuchtentladungsparameter je nach experimentellen Anforderungen (hier 60 s bei 20 mA).
- Eine frisch zubereitete Proteinprobe (3 μL) in das glühende Gitter geben und 10 s inkubieren.
- Tupfen Sie die Gitter für 3-5 s bei 100% Luftfeuchtigkeit ab und tauchen Sie sie mit einem Kryokolben schnell in flüssiges Ethan.
- Klemmen Sie die Gitter manuell in einen Clipring, um die Patrone mit einem flexiblen C-Clip-Ring zu bilden.
- Legen Sie die eingefrorenen Patronengitter in die Autoloader-Kassette und übertragen Sie die Kassette mit der Nanokappe zur Datenerfassung auf den vorgekühlten Autoloader des Mikroskops.
2. Mikroskopabstimmung und Grundausrichtung vor der automatischen Datenerfassung
- Strahlverschiebung
- Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung auf Balkenverschiebung.
- Reduzieren Sie die Vergrößerung und zentrieren Sie den Strahl mit dem Multifunktions-X- und Y-Knopf auf die optische Achse.
- Ausrichtung des Drehpunkts
- Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung (Direct Alignment) auf die Option Balkenneigung (Direct Alignment pp X).
- Kondensieren Sie den Strahl auf einen Punkt und minimieren Sie die Bewegung mit dem Multifunktions-X- und Y-Knopf .
- Zentrierung der C2-Blende
- Wählen Sie auf der Registerkarte Ausrichtung die Kondensatorblende aus.
- Kondensieren Sie den Strahl zu einem Punkt, zentrieren Sie den Strahl auf die optische Achse und erweitern Sie dann den Strahl, um den Kreis gleichmäßig abzudecken.
- Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Blende des Kondensators 2 angepasst ist.
- Komafreie Ausrichtung
- Klicken Sie auf der Registerkarte Direkte Ausrichtung auf Komafreie Ausrichtung X, um den Strahl an der optischen Achse auszurichten.
- Verwenden Sie den Multifunktionsknopf , um die Form und die Bewegung des FFT zu minimieren (stellen Sie sicher, dass er stabil ist).
- Wiederholen Sie den gleichen Vorgang für Koma - freie Ausrichtung Y.
- Stellen Sie aufgrund der C-Zwillingslinse eine parallele Beleuchtung vor der Datenerfassung im Kryo-EM ein.
- Setzen Sie die Objektivblende (70 μm) im Beugungsmodus ein.
- Fokussieren Sie die Objektivblende auf die vordere Brennebene der Beugungslinse, indem Sie den Defokussierungs-Intensitätsregler (Objektivobjektiv und C2-Objektivstrom) steuern.
- Stellen Sie sicher, dass der scharfe Rand der Objektivblende nach ordnungsgemäßer Defokussierung sichtbar wird.
- Setzen Sie den Strahlstopper ein und verteilen Sie die Intensität, bis die Goldpulverbeugungsringe minimiert sind.
HINWEIS: Wenn der Strahl richtig verteilt ist, ist ein klarer Beugungsring des Goldpulvers auf dem Bildschirm sichtbar, der anzeigt, dass der Strahl parallel ist. - Ziehen Sie den Strahlstopper nach dem Einstellen der Parallelbeleuchtung zurück und ändern Sie den Mikroskopmodus auf Nanosonde.
HINWEIS: Überprüfen Sie die Mikroskopabstimmung, bevor Sie mit der Datenerfassung beginnen, um die optimale Leistung des Mikroskops sicherzustellen. Alle diese Einstellungen werden in der Gui-Registerkarte Direct Alignment des Mikroskops vorgenommen. Das gesamte Mikroskop-Tuning wird vor der Datenerfassung mit einem Testraster durchgeführt.
3. Datenerfassung mit Latitude-S
- Starten Sie die automatisierte Datenerfassungssoftware Latitude-S.
HINWEIS: Die Installation des Latitude-S erfordert auch eine Mikroskopkalibrierung, die vor der Datenerfassung durchgeführt wird, und die Einstellungen werden dauerhaft gespeichert. Fünf verschiedene Zustände für die Datenerfassung werden mit vier verschiedenen Vergrößerungen kalibriert (Abbildung 1 und Abbildung 2). Atlaszustand und Gitterzustand liegen im LM-Modus in zwei verschiedenen Vergrößerungen vor (niedrige Vergrößerungsbereiche). Der Lochzustand befindet sich im SA-Modus (Bereiche mit hoher Vergrößerung), jedoch mit einer moderaten Vergrößerung. Fokus und Datenzustand verwenden den SA-Modus mit hoher Vergrößerung.- Klicken Sie im Startmenü auf DigitalMicrograph oder doppelklicken Sie auf das DigitalMicrograph-Symbol auf dem Desktop.
- Wählen Sie unter DigitalMicrograph das Symbol Technik-Manager aus.
HINWEIS: Dieses System zeigt TEM - und Latitude-S-Symbole an (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S1). - Wählen Sie das Latitude-S-Symbol für die automatisierte Einzelpartikelerfassung aus.
HINWEIS: Die K2-Kamera arbeitet in drei Modi: linear/integriert, gezählt und Superauflösung. Der Benutzer kann einen beliebigen Modus in der Benutzeroberfläche von DigitalMicrograph auswählen. Datenbilder können entweder als dosisfraktionierte Bildstapel oder als summierte Bilder in MRC-, TIF- oder DM4-Dateien mit unterschiedlichen Bittiefen gespeichert werden. Darüber hinaus konnten Daten als bewegungskorrigierte Bilder für die K3-Kamera gespeichert werden. Auf einer K2-Kamera kann ein unverarbeiteter Bildstapel als 4-Bit-MRC-, 8-Bit-TIF- oder 8-Bit-DM4-Dateien gespeichert werden.
- Erstellen Sie eine neue Sitzung basierend auf den Einstellungen aus einer vorherigen Sitzung.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Basierend auf vorheriger Sitzung in der Palette.
- Wählen Sie die Schaltfläche Neu aus.
- Wählen Sie den Ordner aus, der die Sitzung enthält, auf der die Einstellungen der neuen Sitzung basieren. Wechseln Sie zum vorherigen Sitzungsverzeichnis, um die neue Sitzung zu erstellen. Wählen Sie den Ordner aus, in dem die neue Sitzung und die zugehörigen Daten gespeichert werden sollen.
- Wählen Sie den Ordner aus, in dem die neue Sitzung und die zugehörigen Daten gespeichert werden sollen.
HINWEIS: Jeder Status und die zugrunde liegenden Einstellungen (Vergrößerung, Beleuchtungsbedingungen, Bild oder Projektor) und Strahlverschiebung und Kameraparameter (Gesamtbelichtung, Einzelbildbelichtung und Binning) werden von der vorhandenen Sitzung in die neue Sitzung exportiert. Der Pfad des Ordners wird als Textzeichenfolge am unteren Rand der Palette angezeigt. An jede der Status- und Konfigurationspaletten ist ein Sternchen (*) angehängt, um anzuzeigen, dass sie bereits eingerichtet wurde und verwendet werden kann.
- Setzen Sie eine vorhandene Sitzung fort.
- Klicken Sie in der Palette auf die Schaltfläche Weiter , um eine vorhandene Sitzung fortzusetzen.
HINWEIS: Die Atlasmontage kann nicht geändert werden. - Wählen Sie den Ordner aus, der die Sitzung enthält, die fortgesetzt werden soll, und navigieren Sie zu diesem Ordner.
- Klicken Sie in der Palette auf die Schaltfläche Weiter , um eine vorhandene Sitzung fortzusetzen.
- Starten Sie eine völlig neue Sitzung.
- Klicken Sie in der Palette auf die Registerkarte Neu . Wählen Sie den Ordner aus, der die Fortsetzung der Sitzung enthält. Wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen.
HINWEIS: Der Standardordnername wird unter Verwendung von Datum und Uhrzeit erstellt. - Klicken Sie auf das Einstellungssymbol . Fügen Sie im angezeigten Feld Status durchsuchen den Status hinzu, legen Sie die TEM-Bedingung, die Kamerabedingung und image/stack fest, und benennen Sie dann den Status.
HINWEIS: Der automatisierte Datenerfassungsworkflow verwendet 5 verschiedene Zustände für die automatisierte Datenerfassung. Diese Status werden konfiguriert und in ihren jeweiligen Statuspaletten gespeichert. Die Zusammenfassung des Zustands ist in Tabelle 1 dargestellt.
- Klicken Sie in der Palette auf die Registerkarte Neu . Wählen Sie den Ordner aus, der die Fortsetzung der Sitzung enthält. Wählen Sie einen Ordner aus, in dem die Daten gespeichert werden sollen.
- Konfigurieren Sie den Atlasstatus.
- Klicken Sie auf Atlas-Statuspalette.
- Konfigurieren Sie den Atlaszustand mit den folgenden Parametern: Vergrößerung 115x LM-Modus in Nanosonde, Beleuchtungsbedingungen-Spotgröße 8 und Helligkeit 934400, Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s für Die Bildgebung bei geringer Vergrößerung. Beziehen Sie sich auf die Zusammenfassung des Zustands in Tabelle 1.
- Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
HINWEIS: Der Atlaszustand ist der niedrigste Vergrößerungszustand, der die Vermessung des gesamten Gitters ermöglicht (ergänzende Abbildung S2). Im Allgemeinen hilft uns dieser Zustand, die gesamten Gitter bei geringer Vergrößerung zu visualisieren und die Eisdicke, Die Ebenheit und das gebrochene Quadrat der Gitter zu beurteilen. Es wird empfohlen, den Atlas an verschiedenen Stellen des Gitters zu erstellen, um die optimale Eisdicke und suboptimale Eisdicke der Gitter zu beobachten (ergänzende Abbildung S3). Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
- Konfigurieren Sie den Rasterstatus.
- Klicken Sie auf die Rasterstatuspalette.
- Konfigurieren Sie den Grid-Zustand mit der folgenden Mikroskop-Bildgebungsoptik (Vergrößerung 380x LM-Modus in Nano-Sonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 626.200), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
- Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
- Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
HINWEIS: Der Rasterzustand wird mit einer höheren Vergrößerung als der Atlaszustand so eingestellt, dass das Sichtfeld ein Rasterquadrat ist (Abbildung 2). Bei dieser speziellen Vergrößerung wird ein Gitterquadrat beobachtet. Daher werden Löcher in dieser Vergrößerung korrekt beobachtet, was hilft, die Eisdicke der Löcher zu überprüfen (ergänzende Abbildung S4). Ein einfacher Bandpassfilter wird im Gitterzustand verwendet, um die Löcher im Patentgitter zu lokalisieren. Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
- Konfigurieren Sie den Bohrungsstatus.
- Klicken Sie auf die Lochpalette.
- Konfigurieren Sie den Lochzustand mit den folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (Vergrößerung 4500x SM-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 7 und Strahldurchmesser 8,81 μm), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
- Ändern Sie die Parameter bei Bedarf basierend auf dem Rastertyp. Siehe die Zusammenfassung des Zustands in Tabelle 1.
- Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
HINWEIS: Der SA-Modus zeigt einen hohen Vergrößerungsbereich im Elektronenmikroskop an. Der Lochzustand liegt im SA-Vergrößerungsbereich mit einem Sichtfeld von wenigen Mikrometern (10-20 μm) (Abbildung 2 und ergänzende Abbildung S4). Dieser Vergrößerungsbereich ist höher als der Atlas- oder Grid-Zustand, aber viel kleiner als der Fokus-/Datenzustand. Bei dieser Vergrößerung sind einzelne Löcher sichtbar. Die Lochgröße ist angemessen, um hohe Verschmutzungsgrade, leere Löcher und die richtige Eisdicke der Löcher zu beobachten. Die Löcher für die Bildgebung werden auf der Grundlage dieser Annahmen ausgewählt. Im Bohrungszustand werden zwei Filter verwendet: einer zum Kreuzkorrelieren eines Bohrungsreferenzbildes mit einem neuen Bohrungsbild und ein weiterer zum Anpassen der Bühnenhöhe an die euzentrische Höhe.
- Konfigurieren Sie den Fokusstatus.
- Klicken Sie auf Fokuspalette.
- Konfigurieren Sie den Fokuszustand mit folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (Vergrößerung 45.000x SA-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 934400), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
- Konzentriere dich auf den amorphen Kohlenstoffbereich in der Nähe des Lochs. Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
- Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
HINWEIS: Der SA-Modus zeigt einen hohen Vergrößerungsbereich im Elektronenmikroskop an. Der Fokuszustand ist die höhere Vergrößerung des SA-Bereichs. Im Fokusmodus wird der Strahl in einen nahe gelegenen Kohlenstoffbereich des Ziellochs verschoben und führt den Fokus automatisch durch, um die Daten im Datenzustand zu sammeln. Ein Bandpassfilter in Kombination mit einem Hanning- oder Soft-Rechteckfilter wird im Fokuszustand verwendet, um den Offset zwischen zwei Fokuszustandsbildern desselben Bereichs zu messen (Abbildung 2). Die genannten Parameter können je nach den Bedürfnissen des Benutzers variiert werden.
- Konfigurieren Sie den Datenstatus.
- Klicken Sie auf Datenpalette.
- Konfigurieren Sie den Datenzustand mit folgenden Mikroskopeinstellungen: Abbildungsoptik (z.B. Vergrößerung 28.000x, 45.000x, 54.000x im SA-Modus in Nanosonde), Beleuchtungsbedingungen (Spotgröße: 8 und Helligkeit 934400), Binning: 1 und Kamerabelichtungszeit: 1,0 s.
- Weitere Informationen finden Sie in der Latitude-S-Statusübersicht in Tabelle 1.
- Klicken Sie auf Weiter , um zum nächsten Status zu wechseln.
HINWEIS: Der Datenstatus ist die höchste Vergrößerung, die basierend auf den Anforderungen an die Pixelgröße und die Zielauflösung ausgewählt wurde (Abbildung 2). Im Allgemeinen wird der Strahl nach dem Fokussieren automatisch in den Zielbereich verschoben, um die Daten zu sammeln. Die oben genannten Parameter können basierend auf den Anforderungen des Benutzers geändert werden.
4. Fokus-Konfiguration
- Klicken Sie auf Fokus-Konfigurationspalette. Geben Sie den Bereich der Defokussierungswerte und die Schrittweite auf der angegebenen Registerkarte an.
- Drücken Sie die Schaltfläche Weiter , um mit dem nächsten Schritt fortzufahren.
HINWEIS: Für die hochauflösende Datenerfassung können niedrigere Defokussierungswerte verwendet werden. Im Allgemeinen werden für die Bildaufnahme Defokussierungswerte von -0,5 bis -3,0 μm mit Defokussierungsschrittweiten von 0,25 oder 0,5 verwendet. Benutzer können den Fokuseinrichtungsschritt überspringen, wenn sie nur das Beispiel überprüfen möchten. Drücken Sie einfach die Schaltfläche Weiter in der Palette, um den Schritt zur Fokuskonfiguration zu überspringen.
5. Feine Ausrichtung
- Konzentrieren Sie sich auf einige Merkmale im Gitter (z. B. Eiskontamination hexagonales Eis); siehe Abbildung 3.
HINWEIS: Features sollten nicht zu groß oder zu klein sein. Sie sollten sowohl bei der 115-fachen Atlas-Zustandsvergrößerung (LA-Modus) als auch bei der Datenvergrößerung sichtbar sein. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen . Positionieren Sie das rote Kreuz auf demselben Feature auf jedem Bild verschiedener Zustände.
- Beginnen Sie mit Fokus-, Daten- und Lochzuständen, da ihr Sichtfeld viel größer ist als die Atlas- und Gitterzustände. Zoomen Sie auf Atlas- und Gitterzustände, um das rote Kreuz auf demselben Feature im Atlas- und Gitterzustand zu positionieren.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen , um die Positionen von fünf verschiedenen Zuständen zu berechnen, die die Offsets zwischen den einzelnen Zuständen berechnen und diese im Ausgabefenster widerspiegeln.
HINWEIS: Die Offset-Werte werden zur weiteren Verwendung in die Zustände integriert (Abbildung 3). Die Feinausrichtung wird durchgeführt, um eine hohe Genauigkeit der Position jedes Zustands zu gewährleisten (Abbildung 3). Diese feine Ausrichtung hilft, die genaue Position in allen fünf Zuständen zu bestimmen. Fine Alignment ist entscheidend für die Erfassung von Einzelpartikeldaten. Daher wird dringend empfohlen, vor der Bildgebung eine Feinausrichtung durchzuführen.
6. Datenerfassungsverfahren mit Latitude-S
- Klicken Sie auf die Aufnahmepalette.
HINWEIS: Im Allgemeinen werden Atlasdaten bei geringer Vergrößerung (115x) gesammelt, um die meisten Gitterquadrate zu visualisieren. - Wählen Sie die Größe des Atlas, um das gesamte Raster oder einen Teil des Rasters basierend auf der Anforderung abzudecken (z. B. 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 oder 8 x 12).
HINWEIS: Die Atlasgröße 16 x 16 deckt das gesamte Raster ab. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Erfassen , um den Atlas aufzunehmen.
HINWEIS: Das Latitude-S-Hauptnavigationsfenster wird geöffnet und füllt den verfügbaren Platz in DigitalMicrograph aus (ergänzende Abbildung S5). Drei Bildbereiche im Hauptnavigationsfenster zeigen Bilder der Systemzustände bei drei verschiedenen Vergrößerungen. Der Gesamtatlas wird derzeit in seinem aktuellen Erfassungsstand ganz links angezeigt. Kacheln im Atlas füllen sich bei jeder Erfassung. - Wählen Sie das Gitterquadrat basierend auf der Eisdicke aus, indem Sie auf dem Atlas navigieren (ergänzende Abbildung S5). Sobald die gewünschten Rasterquadrate ausgewählt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan und beobachten Sie, wie sich die Kacheln im Rasterquadrat füllen, während jedes Rasterquadrat erfasst wird.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan, sobald die Rasterquadrate ausgewählt sind.
- Wählen Sie eine repräsentative Bohrung im Rasterquadrat aus, indem Sie ihre Position hinzufügen. Sobald ein Lochbild erfasst wurde, definieren Sie die Daten und Fokuspositionen und speichern Sie das Layout als Vorlage (Ergänzende Abbildung S6).
- Klicken Sie auf Automatisch suchen, geben Sie die Lochgröße an (z. B. R1.2/1.3) und klicken Sie im Programm auf die Schaltfläche Suchen , wodurch das Find-Programm die Löcher basierend auf dem Lochdurchmesser automatisch findet. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Markieren , um die Vorlage hinzuzufügen (Abbildung 4), und fügen Sie rote Kreismarkierungen in allen Löchern in einem Raster oder einem teilförmigen Gitterquadrat hinzu.
- Richten Sie die Intensität ein, um die Löcher aus dem Gitterquadrat und die Eiskontamination zu entfernen (Abbildung 4).
HINWEIS: Schließlich werden die ausgewählten Löcher gelb markiert, um die Datenerfassung zu planen. - Klicken Sie auf die Schaltfläche Zeitplan in Latitude-Tasks , nachdem Sie die Löcher über die automatische Suche hinzugefügt haben.
HINWEIS: Stellen Sie vor dem Planen der automatisierten Datenerfassung sicher, dass der Tankfüllstand für flüssigen Stickstoff ausreicht, die Autoloader-Turbopumpe ausgeschaltet ist und der RAID-Speicherplatz frei ist. Der Latitude-S-Task-Manager zeigt die Anzahl der Atlas-, Rasterquadrat-, Loch- und Datenzustände an, die für die Datenerfassung geplant sind (Abbildung 5). In der Latitude-S GUI sind verschiedene Farbschemata sichtbar und die Bedeutung der verschiedenen Farbschemata wird angezeigt: 1. Gelb zeigt ungeplant an; 2. Grün zeigt geplant an; 3. Blau zeigt Erworben an; 4. Rot zeigt fehlgeschlagen an.
7. Cryo-EM-Datenverarbeitung
HINWEIS: Die Kryo-EM-Bildverarbeitung von Spike-Protein wird in der neueren Literatur ausführlich beschrieben25.
- Bildverarbeitung des Spike-Proteins von SARS-CoV2 mit RELION 3.011.
- Zeigen Sie die mit Latitude-S aufgenommenen Filmbilder manuell an, und führen Sie mit der MotionCor2-Software9 eine strahlinduzierte Bewegungskorrektur der einzelnen Filme durch. Führen Sie das erste Screening der bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen manuell mit Hilfe des cisTEM-Softwarepakets14 durch.
HINWEIS: Fast 85% der automatisch aufgenommenen Mikroaufnahmen waren von guter Qualität, und die Daten hatten ein Signal innerhalb von 3,7-5,2 Å, das mit cisTEM-Software14 berechnet wird (ergänzende Abbildung S7A, B). - Verarbeiten Sie die Daten mit dem Softwarepaket RELION 3.011.
- Nehmen Sie Spike-Partikel manuell auf und unterziehen Sie sie der 2D-Klassenklassifizierung (ergänzende Abbildung S7C). Verwenden Sie die beste 2D-Klasse als Referenz für die automatische Auswahl von 3.99.842 Single-Spike-Partikeln aus den Mikroaufnahmen mit dem RELION Autopick-Tool11.
HINWEIS: Drei Runden der 2D-Klassifizierung wurden durchgeführt, bevor die Partikel einer 3D-Klassifizierung unterzogen wurden (ergänzende Abbildung S8). Etwa 2.55.982 Einzelpartikel wurden für die 3D-Klassifizierung ausgewählt und der Datensatz in sechs Klassen eingeteilt. Die abschließende 3D-Autoverfeinerung wurde mit der besten Klasse durchgeführt; Aus der 3D-Klassifikation wurden 85.227 Spikepartikel gewonnen. - Führen Sie nach der automatischen Verfeinerung eine Defokussierung pro Partikel mit den richtigen Strahlneigungsparametern durch, um die Auflösung zu verbessern. Als nächstes unterziehen Sie die Partikel einem Bayes'schen Polieren mit dem RELION 3.0 Softwarepaket11. Verwenden Sie schließlich das polierte Partikelset für eine weitere Runde 3D-Autoverfeinerung mit RELION 3.011.
- Nehmen Sie Spike-Partikel manuell auf und unterziehen Sie sie der 2D-Klassenklassifizierung (ergänzende Abbildung S7C). Verwenden Sie die beste 2D-Klasse als Referenz für die automatische Auswahl von 3.99.842 Single-Spike-Partikeln aus den Mikroaufnahmen mit dem RELION Autopick-Tool11.
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Representative Results
In der aktuellen Pandemiesituation spielt Kryo-EM eine Schlüsselrolle bei der Charakterisierung der Strukturen verschiedener Proteine aus SARS-CoV-226,27,28,29, die zur Entwicklung von Impfstoffen und Medikamenten gegen das Virus beitragen können. Es besteht ein dringender Bedarf an schnelllebigen Forschungsanstrengungen mit begrenzten personellen Ressourcen, um die Coronavirus-Krankheit von 2019 zu bekämpfen. Die Datenerfassung in Einzelpartikel-Kryo-EM ist ein zeitaufwändiger, aber entscheidender Schritt bei der Strukturbestimmung von Makromolekülen. Jüngste Entwicklungen bei der automatischen Kryo-EM-Datenerfassung haben begrenzte menschliche Eingriffe in die Datenerfassung ermöglicht. Die Latitude-S-Software ist ein wichtiges Softwarepaket für die automatische Datenerfassung, das hier für die automatisierte Datenerfassung von gereinigtem SARS-CoV2-Spike-Protein verwendet wird.
Die Kryo-EM-Datenerfassung des SARS-CoV-2-Spikeproteins wurde mit einem 200-keV-Kryo-EM durchgeführt, das mit einem K2 Summit DED ausgestattet war. Die Standorte für die Datenerfassung auf dem Netz mit gewünschter Eisdicke und Partikelverteilung wurden manuell markiert. Die Positionen wurden parallel während der im Hintergrund stattfindenden Datenerfassung markiert. An den markierten Positionen führte die Latitude-S-Software eine automatisierte Datenerfassung mit einer Nennvergrößerung von 42.200x bei der Pixelgröße von 1,17 Å auf Probenebene durch. Die Konfiguration für die Datenerfassung bei 42.200-facher Vergrößerung wurde bereits voreingestellt und getestet. Insgesamt wurden 40 Frames für 8 s mit der Elektronendosis von 2 e−/Å2 pro Frame aufgezeichnet; Somit wurde für die Datenerhebung eine Gesamtdosis von 80 e−/Å2 verwendet (ergänzende Abbildung S9). Die Daten wurden in einem Defokussbereich von −0,75 μm und −2,25 μm erfasst, wobei 3.000 Filmdateien in zwei Tagen gesammelt wurden. Alle 4 Stunden wurden regelmäßige Überprüfungen und Anpassungen von der Software durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle über 48 h gesammelten Filmdateien von guter Qualität waren und es keine Strahlverschiebung oder Ausrichtungsverschiebung gab. Die Daten wurden unabhängig voneinander ohne menschliches Zutun erhoben. Darüber hinaus stoppt latitude-S automatisch die Bildgebung zum Zeitpunkt der Füllung mit flüssigem Stickstoff, wodurch unnötige Vibrationen oder mechanische Drifts in den Bildern reduziert werden.
Wie im Protokollabschnitt erwähnt, wurde das erste Screening von bewegungskorrigierten Mikroaufnahmen manuell mit der cisTEM-Software durchgeführt14. Basierend auf dem Screening wurde festgestellt, dass die meisten Daten im Signalbereich von 3,7-5,2 Å liegen (ergänzende Abbildung S7A). Dies deutet darauf hin, dass die automatische Datenerfassung mit Latitude-S gut ist und die meisten Daten für eine hochauflösende 3D-Rekonstruktion geeignet sind. Zusätzlich wurden Bilder im Defokussbereich (-0,75 bis -2,25 μm) gesammelt und verschiedene Defokusbereiche manuell von cisTEM14 überprüft. Die erfassten Daten lagen sehr nahe am Setup-Defokusbereich in Latitude-S (ergänzende Abbildung S7A,B).
Die Datenverarbeitung erfolgte mit dem Softwarepaket RELION 3.011. Spike-Partikel wurden manuell ausgewählt, um die 2D-Klassendurchschnitte zu berechnen. Verschiedene strukturelle Details (Helix und β-Sheet) sind in den 2D-Klassendurchschnitten sichtbar (Supplemental Figure S7C), was stark darauf hindeutet, dass mit diesem Datensatz eine hochauflösende Strukturcharakterisierung möglich ist. Die 3D-Klassifikation zeigt jedoch auch, dass das Spike-Protein eine offene 1-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD) und die gesamte RBD-Konformation in der Nähe aufweist (ergänzende Abbildung S8). Die 3D-Klassifizierung zeigt an, dass Klasse-1 die maximale Anzahl von Partikeln hat, die als 1-RBD-up-open-Konformation erscheinen. Darüber hinaus haben Klasse-3 und Klasse-4 eine ähnliche Anzahl von Partikeln, und beide Modelle schienen alle RBD-konform zu haben. Klasse-5 zeigt jedoch eine Zwischenkonformation, wobei sich 1-RBD in einer Zwischenposition befindet. Die offenen 1-RBD-Konformationen des Spike-Proteins wurden jedoch unter Verwendung der C1-Symmetrie rekonstruiert, und die Gesamtauflösung beträgt 4,4 Å (Abbildung 6 und ergänzende Abbildung S10). In ähnlicher Weise wurden alle RBD-Down-Close-Konformationen (Klasse-3 und Klasse-4) zusammen mit der C3-Symmetrie verfeinert, und die Gesamtauflösung bei 0,143 FSC beträgt ~ 3,9 Å (Abbildung 7).
Die gesamte Bildverarbeitung zeigt, dass das Spike-Protein alle RBDs down close und 1-RBD up open conformation annimmt. Zusätzlich wurde eine intermediäre Konformation des Spike-Proteins identifiziert. Die hochauflösende Kryo-EM-Struktur der S2-Subdomäne des Spike-Proteins zeigt die Seitenketten einzelner Aminosäurereste an (Abbildung 6B und Abbildung 7C). Alle 3D-Rekonstruktionen und Kryo-EM-Ergebnisse sind den Befunden in der kürzlich veröffentlichten Literatur sehr ähnlich25. Die hochauflösende Kryo-EM-Struktur des Spike-Proteins wurde jedoch innerhalb von 15 Tagen charakterisiert, was nur aufgrund automatischer Kryo-EM-Datenerfassungsprotokolle und automatischer Partikelpicking-Software möglich ist. Daher können automatische Datenerfassungssoftwarepakete, einschließlich Latitude-S, wesentlich zur Charakterisierung mehrerer hochauflösender Kryo-EM-Strukturen biologischer Makromoleküle beitragen.
Abbildung 1: Workflow der automatisierten Datenerfassung mit Latitude-S: Allgemeine Schritte, die vor der Datenerfassung zu befolgen sind (Rastervorbereitung, Probenbeladung und Mikroskopabstimmung). Die Datenerfassung ist der Hauptteil dieses Manuskripts, und die Pipeline, die während der Datenerfassung zu befolgen ist, wird hervorgehoben. Abkürzungen: Kryo-EM = Kryo-Elektronenmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Einrichten verschiedener Zustände für die Erfassung von Einzelpartikeldaten über die Latitude-S GUI. (A) Latitude-S-Softwarepaket zur Datenerfassung in DM3-Software. (B) Ablauf des Datenerfassungsverfahrens. (C) Erweiterung jedes Panels. Abkürzung: GUI = Graphical User Interface. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Feinausrichtung zur Einrichtung einer hohen Genauigkeit für Fokussierung und Bildaufnahme. Die Feinausrichtung erfolgt an fünf Zuständen a. Atlas, b. Hole, c. Data, d. Grid, e. Focus. Fokussieren Sie jeden Zustand, indem Sie die rote Markierung an derselben Position platzieren. Es wird dringend empfohlen, vor Beginn einer neuen Sitzung eine Feinausrichtung durchzuführen, um die Bildgebung in einer bestimmten Position durchzuführen. Die Bildaufnahme in einer bestimmten Position (ohne größere Verschiebung) hängt vollständig von der Genauigkeit der Feinausrichtung ab. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Automatische Bohrungsauswahl mit Latitude-S. Das automatische Finden von Löchern für die Datenerfassung erfolgt automatisch basierend auf der Lochgröße. (A) Zeigt die Position des Lochfindungsvektors für die automatische Suche nach den Löchern an. Maßstabsbalken = 20 μm. (B) Zeigt die Markierung von Löchern mit dem Lochfindungsvektor und die Anpassung der Intensität, um den Marker aus dem Grenzbereich und der Eiskontamination zu entfernen. Maßstabsbalken = 20 μm (links) und 10 μm (Mitte). (C) Zeigt das automatische Hinzufügen der Löcher für die Bildgebung (gelb). Maßstabsbalken = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Live-Ansicht der Datenerfassung. (A) Die Positionen sind je nach Status der Datenerfassung in jeder Position gelb, grün, blau und rot markiert. (B) Farbcode zur Überwachung des Status der Datenerfassung. Grün: Geplant, Gelb: Ungeplant, Blau: Erwerben, Rot: Fehlgeschlagen. Das linke Feld zeigt mehrere grün gefärbte Löcher (geplant) und einige blau markierte Löcher (erworben); Maßstabsleiste = 10 μm. Das mittlere Panel zeigt die 4.300-fache Vergrößerung eines einzelnen Lochs. In diesem Bild einer Bohrung (mittleres Feld) zeigt das blaue quadratische Feld den Fokusbereich und das grüne quadratische Feld den Bildbereich. Maßstabsleiste = 1000 nm. Das rechte Feld zeigt das aufgenommene Bild. Das feld ganz rechts zeigt die geplanten Bildnummern, die für die Bildgebung erforderliche Gesamtzeit und die Anzahl der für die Bildgebung geplanten Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Spike 3D-Modus mit geöffnetem 1RBD. (A) Automatisch verfeinerte und geschärfte Spike-Protein-Karte von 1-RBD nach oben offen wird in Seiten-, Oben- und Unteransicht dargestellt. (B) Die EM-Karte ist mit einer Kristallstruktur zur besseren Visualisierung der Seitenketten ausgestattet. Die hervorgehobenen Regionen in der Karte weisen Dichten für Seitenketten auf. Abkürzungen: 3D = dreidimensional; RBD = Rezeptor-bindende Domäne; EM = Elektronenmikroskopie; NTD = N-Terminal-Domäne; S1 = Untereinheit 1; S2 = Untereinheit 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Alle RBD-Down-Close-Konformation von Spike-Protein. (A) Automatisch verfeinerte und geschärfte Spike-Protein-Karte aller RBD-Down-Close-Konformationen, dargestellt in Seiten- und Draufsichten. (B) Die EM-Karte ist mit einer Kristallstruktur zur besseren Visualisierung der Seitenketten ausgestattet. Die Pfeile zeigen, dass die Regionen in der Karte Dichten für Seitenketten (C) aufweisen. Abkürzungen: RBD = rezeptorbindende Domäne; EM = Elektronenmikroskopie; NTD = N-Terminal-Domäne; S1 = Untereinheit 1; S2 = Untereinheit 2. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung S1: Grafische Darstellung der Latitude-S-Bilderfassung: Verschiedene Mikroskop-Controller (z. B. Säulenventil öffnen/schließen, Bildschirmein-/-einfahren) werden über die Latitude-S GUI gesteuert. Säulenventil, Kamera, Bildschirmstatus und Flüssigstickstofffüllung konnten im linken Bereich gesteuert werden. Am unteren Rand dieses Fensters werden verschiedene Kalibrierungsparameter grün angezeigt (z. B. Vergrößerung, Strahlneigung, Objektivfokus). Wenn ein Parameter schwarz angezeigt wird, zeigt dies an, dass der Parameter nicht korrekt optimiert ist. Daher sollten alle Parameter optimiert werden, bevor eine neue Sitzung gestartet wird. Abkürzung: GUI = Graphical User Interface. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S2: Darstellung des Atlas-Zustands. Verschiedene Atlas-Staaten, die Gitterquadrate und die Art des gebildeten Eises zeigen. (A-F) Verschiedene Atlas-Größen werden ebenfalls hervorgehoben. (A, B, D, F) Ein dickes Eismuster wird hervorgehoben. (C, D) Gebrochene Quadrate werden hervorgehoben. Dickes Eis und gebrochene Bereiche (in der Abbildung markiert) sind für die Bildgebung nicht geeignet. (E, F) Gute Gitterquadrate für die Bildgebung; A, B, C, D und F zeigen die Gitterquadrate, die für hochauflösende Bildgebung geeignet sind. Dicke Eisgitterquadrate und gebrochene Gitterquadrate müssen jedoch ausgeschlossen werden. Maßstabsbalken = 100 μm (A-C), 50 μm (D, E) und 25 μm (F). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S3: Darstellung des Gitterzustands und des Lochzustands. Der Gitterzustand und der entsprechende Lochzustand sind in der Abbildung dargestellt. (A, E) Leeres Loch, (F, G) dickes Eis, (E) Eiskontamination und (A, B, C, D, E und G) geeignete Eisdicke ist im Bild markiert. Für die Bildaufnahme werden geeignete Eisdickenbohrungen ausgewählt (A, B, C, D, E und G). Maßstabsbalken = 10 μm (A, E, F, G), 2 μm (B), 50 μm (C), 5 μm (D). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S4: Lochreferenz für die automatische Bildgebung. Das Lochbild (QUANTIFOIL-Holey Carbon Grid QUANTIFOIL R 1.2/1.3) wird erfasst und zur späteren Bezugnahme gespeichert. Die Größe der Lochreferenz könnte basierend auf den verschiedenen Arten von Gittern variiert werden. Es wird empfohlen, immer die Bohrungsreferenz zu erfassen, bevor Sie eine neue Sitzung starten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S5: Bildaufnahmefenster mit verschiedenen Vergrößerungen und Lochauswahl. (A) Das Erfassungsfenster zeigt die Einstellungen für die Datenerfassung an. (B) Das Latitude-S-Hauptnavigationsfenster zeigt drei aufeinanderfolgende Vergrößerungen. Im Atlas-Zustand (150x) werden die Rasterquadrate für die Datenerfassung ausgewählt (linkes Feld, Maßstabsleiste = 50 μm). Bei höherer Vergrößerung (380x) wird ein einzelnes Quadrat fokussiert (mittleres Panel, Maßstabsleiste = 20 μm). Weiter höhere Vergrößerung (4.300x), Löcher innerhalb jedes Quadrats werden fokussiert (rechtes Feld, Maßstabsleiste = 5 μm). Diese Vergrößerungen würden sich jedoch je nach Größe und Form der Gitter ändern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S6: Erstellen einer Vorlage für die Lochauswahl und -bildgebung. Die Vorlagengenerierung erfolgt durch Hinzufügen einer Position auf der Bohrung für Daten, und der Fokus wird neben der Bohrung auf der Kohlenstoffoberfläche positioniert. Der Fokus sollte auf der Kohlenstofffläche liegen, so dass der Strahldurchmesser kein benachbartes Loch berühren sollte. Maßstabsleisten = 20 μm (linkes Feld), 10 μm (mittleres Feld), 1000 nm (rechtes Feld). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S7: Kryo-EM-Bildgebung von SARS-CoV2 mittels Latitude-S und Bildscreening. (A) Screening von aufgenommenen Mikroaufnahmen: 1D-CTF-Fit, 2D-CTF-Fit und CTF-Parameter; Abschätzung der SARS-CoV2-Spikeproteindaten mittels cisTEM. 1D CTF fit und Thon Ring zeigen, dass das Gesamtsignal 4,8 Å beträgt. (B) Mikroaufnahmen bei zwei verschiedenen Defokussierungswerten des Spike-Proteins werden mit Latitude-S aufgenommen. Maßstabsbalken = 50 nm. (C) Endgültiger 2D-Klassendurchschnitt. Der 2D-Klassendurchschnitt zeigt die obere, untere und seitliche Ansicht des Spike-Proteins. Alle hochauflösenden Details sind in 2D-Klassendurchschnitten sichtbar. Abkürzungen: Kryo-EM = Kryo-Elektronenmikroskopie; 1D = eindimensional; 2D = zweidimensional; CTF = Kontrastübertragungsfunktion; SARS-CoV2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S8: Datenverarbeitung von SARS-CoV2-Spikeproteindaten, die mit der Latitude-S-Software erfasst wurden. Das Bild zeigt den Workflow für die Verarbeitung der Kryo-EM-Daten des Spike-Proteins. Die 3D-Klassifizierung des Spike-Proteins erfolgt mit Relion 3.0. Klasse-1 zeigt die 1-RBD up offene Konformation. Klasse-3 und Klasse-4 zeigen alle RBD bis in die Nähe konformation von Spike-Protein. Klasse-5 zeigt die intermediäre Konformation des Spike-Proteins. Abkürzungen: Kryo-EM = Kryo-Elektronenmikroskopie; 3D = dreidimensional; RBD = Rezeptor-bindende Domäne; SARS-CoV2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S9: Dosisfraktioniertes Bild, das als Referenz für die endgültige Bildaufnahme aufgenommen wurde. Dosisfraktionierungsbilder werden mit einer Belichtung von 8,0 s und einer Belichtung von 0,2 s/Bild aufgenommen. Klicken Sie auf die Schaltfläche Automatisch speichern in der Nähe der Kamera, um die Filmdateien automatisch zu speichern. Klicken Sie nach der Bildaufnahme auf das Bild und speichern Sie die dosisgetrennten Bildparameter über die Schaltfläche Bildaktualisierung im Datenerfassungszustand. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung S10: Winkelverteilung und Fourier-Shell-Korrelation der erzeugten SARS-CoV-2 1 RBD up open conformation spike protein map. (A) Winkelverteilung des endgültigen 3D-Modells von 1-RBD bis zur offenen Konformation des Spike-Proteins. Blau steht für niedrigere Werte und Rot für höhere Werte der normalisierten Partikelverteilung. (B) Fourier-Schalen-Korrelationskurve, die eine Auflösung von 4,4 Å der 1-RBD-up-open-Konformation des Spike-Proteins zeigt, die am Cut-off-Wert geschätzt wird. Abkürzungen: 3D = dreidimensional; RBD = Rezeptor-bindende Domäne; SARS-CoV2 = schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2; FSC = Fourier-Shell-Korrelation. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
| Atlas-Bildzustand | Atlas 115 |
| Vergrößerung | 115, Pixelgröße 34.7 nm |
| Angezeigte Defokussierung | 4,38 mm |
| Spotgröße | 8 |
| Helligkeit | 934400 |
| Modus | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Belichtungszeit | 1,0 s |
| Zustand der Netzvermessung | Raster 380 |
| Vergrößerung | 380, Pixelgröße 11.2 nm |
| Angezeigte Defokussierung | 2,37 mm |
| Spotgröße | 8 |
| Helligkeit | 626200 |
| Modus | IMAGINGILM |
| Binning | 1 |
| Belichtungszeit | 1,0 s |
| Zustand der Bohrlochvermessung | Loch 3400 |
| Vergrößerung | 3.400, Pixelgröße 1,20 nm |
| Angezeigte Defokussierung | -0,75 μm |
| Spotgröße | 7 |
| Strahldurchmesser | 8,81 μm |
| Modus | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Belichtungszeit | 1,0 s |
| Fokuszustand | Fokus 45k |
| Vergrößerung | 45.000, Pixelgröße 0.0924 nm |
| Angezeigte Defokussierung | 4,51 μm |
| Spotgröße | 6 |
| Strahldurchmesser | 0,716 μm |
| Modus | IMAGINGILM, SA, Mh |
| Binning | 1 |
| Belichtungszeit | 1,0 s |
| Erwerbsstatus | Daten 45k |
| Vergrößerung | 45.000, Pixelgröße 0.0924 nm |
| Defokus-Setup | Min: -4.500 nm, Max: -1.500 nm, Schritte: 250 nm |
| Spotgröße | 6 |
| Strahldurchmesser | 0,752 μm |
| Modus | IMAGINGILM,SA,Mh |
| Binning | 1 |
| Belichtungszeit | Insgesamt 8 s Belichtung für 20 Bilder |
| Kamera-Setup | Gezählt, Gewinn normalisiert, Defekt korrigiert |
| Einrichtung der Datenspeicherung | MRC |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Latitude-S-Statuseinrichtung.
| Spezifikation | K2 Basis | K2 Gipfel |
| TEM-Betriebsspannung | 200-400 kV | |
| Aktiver Bereich des Sensors | 19,2 mm × 18,6 mm | |
| Sensorgröße in Pixeln | 3838 × 3710 | 7676 × 7420 Super- Auflösung |
| Physische Größe aller Pixel | 5 μm | |
| Binning | 1–8x | |
| Sensorauslesung | Beliebiger Bereich | |
| Vergrößerung relativ zum Film | 1,3–1,5x | |
| Sensor-Auslesegeschwindigkeit | 50 volle fps | 400 volle fps |
| Übertragungsgeschwindigkeit zum Computer | 8 volle fps | 40 volle fps |
| Bildanzeige | 8 volle fps | 10 volle fps |
| DQE-Leistung (300 kV) | >0,30 (Spitze) >0,25 bei 0,5 des physischen Nyquist | >0,7 (Spitze) >0,50 bei 0,5 von physischem Nyquist >0,06 bei 1,25 von physischem Nyquist |
| Software | Gatan Microscopy Suite inklusive DigitalMicrograph |
Tabelle 2: Kameraspezifikationen.
| Konfigurationsoption | Wert |
| Mikroskop-Typ | Talos Arctica G2 |
| Hochspannung | 200 kV |
| Quelle | XFEG |
| Linse | Kryo-Zwilling |
| Vakuum-System | Talos TMP IGP |
| Sample Loader | Autoloader |
Tabelle 3: Mikroskopkonfiguration.
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Discussion
Latitude-S ist eine intuitive Benutzeroberfläche, die eine Umgebung zum automatischen Einrichten und Sammeln von Tausenden von hochauflösenden Mikroaufnahmen oder Filmdateien in zwei Tagen bietet. Es bietet eine einfache Navigation durch die Gitter und behält die Position des Mikroskoptisches bei, während es sich von niedriger Vergrößerung zu hoher Vergrößerung bewegt. Jeder Schritt der Datenerfassung mit Latitude-S ist zeiteffizient, mit Funktionen wie einer einfachen Benutzeroberfläche, schnellem Streaming von Daten mit einer Geschwindigkeit von bis zu 4,5 GB/s und gleichzeitiger Anzeige der Daten während der Erfassung. Darüber hinaus wurden vorkalibrierte Dosisfraktionierungs-, Dosisleistungs-, Fokus- und Vergrößerungsparameter einfach neu geladen, um eine neue Sitzung der automatischen Datenerfassung zu starten und Zeit zu sparen.
Die automatische Datenerfassung ohne ständige Überwachung und ohne Beeinträchtigung der Qualität des Datensatzes ist eine anspruchsvolle und zeitaufwändige Aufgabe. Die automatisierte Datenerfassung mit Latitude-S-Software ist praktisch, wenn Zeit und Ressourcen große Einschränkungen darstellen, insbesondere während dieser Pandemie. In den letzten Monaten wurden jedoch mehrere Kryo-EM-Strukturen verschiedener Proteine von SARS-CoV-2 gelöst, was Pharmaunternehmen bei der Entwicklung von Impfstoffen helfen wird. Verschiedene Labore verwenden unterschiedliche Arten von Softwarepaketen für die automatische Datenerfassung, um Daten zu sammeln. Wir haben Latitude-S mit einem K2 Summit DED für die automatische Kryo-EM-Datenerfassung auf löchrigen Kohlenstoffgittern oder hausgemachten GO-beschichteten Gittern30 verwendet.
Diese Studie wurde unter Verwendung der oben genannten Parameter im Protokollabschnitt durchgeführt, was einen starken Beweis dafür liefert, dass Latitude-S ein geeignetes und ideales Softwarepaket für die automatische Datenerfassung für Einzelpartikel-Kryo-EM ist. Es wird jedoch dringend empfohlen, bestimmte Protokolle zu befolgen, bevor Sie mit einer K2-Kamera mit der Bildgebung beginnen. Die K2-Direkterkennungskamera erfordert grundlegende Wartungsroutinen, um die höchste Leistung zu erzielen. Regelmäßiges Abkühlen der Kamera auf 50° für 24 h hilft dem Sensor, optimal zu arbeiten, indem das Hintergrundrauschen und die Verschmutzung auf Oberflächenebene reduziert werden. Nach dem Abkühlen der Kamera ist das Aktualisieren der Verstärkung und der dunklen Referenzen der Kamera jedoch ein obligatorischer Schritt (dauert ~ 45 Minuten), bevor eine Bildaufnahme durchgeführt wird.
Obwohl Latitude-S ein stabiles und benutzerfreundliches Softwarepaket für die automatische Kryo-EM-Datenerfassung ist, ist es wichtig, zu Beginn verschiedene Parameter (Vergrößerungen, Spotgröße, Helligkeit und Dosisleistung) in 5 verschiedenen Zuständen von Latitude-S zu optimieren. Die Vergrößerung von Löchern oder Gitterzuständen hängt von den Lochgrößen der löchrigen Gitter oder löchrigen Gittertypen ab (z. B. R2/2 oder R1,2/1,3 oder R 0,6/1). Beispielsweise beträgt die Gitterlochgröße vom Typ R0,6/1 0,6 μm und die Bohrungsgröße des R2/2-Gitters 2 μm. Daher sind zwei verschiedene Arten der Vergrößerung erforderlich, um die Löcher für die Gittertypen R0,6/1 und R2/2 im Gitter- und Lochzustand in Latitude-S richtig zu visualisieren.
Daher sind die Vergrößerungseinstellungen für verschiedene Arten von Gittern in 5 verschiedenen Zuständen variabel. Die Spotgröße und die Helligkeit hängen stark von der Vergrößerung ab. Daher können sich diese Werte bei unterschiedlichen Vergrößerungswerten ändern. Daher wird empfohlen, die verschiedenen Parameter der 5 verschiedenen Zustände von Latitude-S mit verschiedenen Arten von Kryo-EM-Gittern zu optimieren, bevor mit der automatischen Datenerfassung begonnen wird. Sobald jedoch alle Parameter optimiert und gespeichert sind, ist es einfach, alle Parameter basierend auf den Anforderungen des Benutzers neu zu laden und Latitude-S bei verschiedenen Vergrößerungen oder Rastertypen zu verwenden.
Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von K2 mit Latitude-S besteht darin, dass Benutzer das Öffnen/Schließen des Strahlventils, das Einsetzen/Zurückziehen der Kamera, das Einsetzen/Zurückziehen des Phosphorschirms des Mikroskops und das Regulieren der Füllung von flüssigem Stickstoff über die GRAFISCHE Benutzeroberfläche des Latitude-S einfach regeln können. Auf andere Optionen (z. B. Pistolenneigung, Pistolenverschiebung, Strahlverschiebung, Drehpunkte, C2-Blendenzentrierung, Rotationszentrum, komafreie Ausrichtung) kann jedoch nicht über die GUI-Registerkarte K2 Latitude-S zugegriffen werden (ergänzende Abbildung S1 und Abbildung 2). Während der langen Stunden der Datenerfassung kann sich die Position des Strahls verschieben.
Latitude-S kann automatisierte regelmäßige Überprüfungen und Korrekturen durchführen, um die Stabilität des Systems während des gesamten Datenerfassungszeitraums zu verfolgen. Die Stabilität des Systems wird aufrechterhalten, indem der Strahl zentriert und die dunklen Referenzen aktualisiert werden. Die ständige Kontrolle sichert die hohe Qualität der erfassten Daten. In Latitude-S wird die euzentrische Höhe (Z-Höhe) nur einmal vor der Datenerfassung korrigiert, und die euzentrische Höhe wird automatisch von Latitude-S berechnet, wenn das Rasterquadrat geändert wird. Der Fokus wird automatisch gemessen und basierend auf dem benutzerdefinierten Fokusbereich angepasst. Das Programm setzt die Position der Stufe Z zurück, wenn sie den angegebenen Schwellenwert überschreitet. Diese Stabilität wird über die Palette Systemstabilität gesteuert. Wie andere automatische Datenerfassungspakete weist auch Latitude-S einige Einschränkungen auf.
Latitude-S kann die euzentrische Höhe (Z-Höhe) nicht berechnen, wenn das Gitter uneben ist. In diesem Szenario können keine Daten gesammelt werden, oder die Defokussierungswerte liegen vollständig außerhalb des Bereichs. Daher sollten Benutzer äußerst vorsichtig sein, um ihre Gitter ohne Biegung vorzubereiten und nur flache Raster mit Latitude-S abzubilden. Darüber hinaus ist Latitude-S im Gegensatz zu Leginon, SerialEM und UCSF-Image kein frei verfügbares Softwarepaket. Latitude-S ist kompatibel mit Gatan-Kameras, einschließlich gefilterter oder eigenständiger K2-, K3- und K3-Basis-Direkterkennungskameras sowie Rio- und OneView-Kameras. Ein weiterer wichtiger Nachteil für Benutzer ist, dass es nicht mit anderen gängigen DEDs wie Falcon DED kompatibel ist. Dies gilt jedoch auch für EPU, ein weiteres Softwarepaket zur automatischen Datenerfassung, das mit Kryomikroskopen erhältlich und nur mit der Falcon-Kamera kompatibel ist. EPU ist jedoch auch mit K2/K3 mit einem Energiefilter (BioQuantum K3 Imaging Filter) funktionsfähig, jedoch nicht mit einer eigenständigen K2/K3-Kamera.
Latitude-S ist EPU, SerialEM, AutoEM, AutoEMation und Leginon sehr ähnlich, bei denen es sich um Softwarepakete handelt, die für die automatische Datenerfassung für Einzelpartikel-Kryo-EM verwendet werden. Latitude-S ist jedoch nur mit K2 DED, K3 DED oder BioQuantum K3 Imaging Filter kompatibel. Darüber hinaus bietet das Unternehmen kontinuierlichen technischen Support für Latitude-S-Benutzer. Dieser technische Support ist vorteilhaft für kleine Benutzergruppen, die die K2 DED-, K3 DED- oder BioQuantum K3 Imaging Filter-Geräte zur Datenerfassung verwenden müssen und keine Vorkenntnisse in der Einrichtung oder Verwendung freier Softwarepakete wie SerialEM und Leginon haben.
Es gibt viele andere Funktionen wie Mikrokristall-Elektronenbeugung (microED), Tomographie und energiedispersive Röntgenspektrometrie (EDS), die in verschiedenen anderen Versionen von Latitude verfügbar sind. Daher können Benutzer das gleiche Softwarepaket für die Datenerfassung in anderen Modi verwenden. Unseres Wissens ist die Datenerfassung für MicroED, Tomographie und EDS in EPU oder anderen Softwarepaketen nicht verfügbar. Daher könnte dieses Latitude-Softwarepaket neben der automatischen Datenerfassung in Einzelpartikel-KryoEM auch für verschiedene Zwecke nützlich sein. SerialEM und Leginon, beide freie Softwarepakete, eignen sich jedoch für Falcon- oder K2/K3-Kameras und sind für neue Benutzer äußerst nützlich. Latitude-S ist jedoch nicht frei verfügbar, was ein Nachteil dieses Softwarepakets sein könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das automatische Datenerfassungstool Latitude-S genauso gut ist wie andere automatische Datenerfassungssoftwarepakete (z. B. EPU, Leginon, SerialEM, UCSF-Image). Latitude-S ist ein äußerst stabiles und benutzerfreundliches Datenerfassungssoftwarepaket, das mit gefilterten oder eigenständigen K2-, K3- und K3-Basis-Direkterkennungskameras sowie Rio- und OneView-Kameras erhältlich ist.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden oder finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Wir danken dem Department of Biotechnology, dem Department of Science and Technology (DST) and Science und dem Ministry of Human Resource Development (MHRD), Indien, für die Finanzierung und die Kryo-EM-Einrichtung am IISc-Bangalore. Wir erkennen das DBT-BUILDER-Programm (BT/INF/22/SP22844/2017) und DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) für die National Cryo-EM-Einrichtung am IISc, Bangalore, an. Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das Science and Engineering Research Board (SERB) (Grant No.-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 und SERB-IPA/2020/000094), DBT (Grant No. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). Wir danken Frau Ishika Pramanick für die Vorbereitung von Kryo-EM-Gittern, die Kryo-EM-Datenerfassung und die Erstellung der Materialtabelle. Wir danken auch Herrn Suman Mishra für die Kryo-EM-Bildverarbeitung und die Unterstützung bei der Erstellung der Zahlen. Wir danken Prof. Raghavan Varadarajan dafür, dass er uns geholfen hat, die gereinigte Spike-Protein-Probe für diese Studie zu erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Blotting paper | Ted Pella, INC. | 47000-100 | EM specimen preparation item |
| Capsule | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97591 | EM specimen preparation unit |
| Cassette | Thermo Fisher Scientific | 1020863 | EM specimen preparation unit |
| C-Clip | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | EM specimen preparation item |
| C-Clip Insertion Tool | Thermo Fisher Scientific | 9432 909 97571 | EM specimen preparation tool |
| C-Clip Ring | Thermo Fisher Scientific | 1036173 | EM specimen preparation item |
| EM grid (Quantifoil) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | R 1.2/1.3 300 Mesh, Gold |
| Glow discharge Machine | Quorum | N/A | Quorum GlowQube glow discharge machine |
| K2 DED | Gatan Inc. | N/A | Cryo-EM data collection device (Camera) |
| Latitude S Software | Gatan Inc. | Imaging software | |
| Loading station | Thermo Fisher Scientific | 1130698 | EM specimen preparation unit |
| Talos 200 kV Arctica | Thermo Scientific™ | N/A | Cryo-Electron Microscope |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | N/A | EM specimen preparation unit |
References
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