Summary
Questa metodologia, che includeva l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica, potrebbe valutare efficacemente l'influenza delle barriere dell'intestino medio e / o delle ghiandole salivari sull'infezione da arbovirus.
Abstract
I virus trasmessi dalle zanzare (MBV), che sono agenti patogeni infettivi per i vertebrati, sono diffusi da molte specie di zanzare, rappresentando una grave minaccia per la salute pubblica. Una volta ingeriti, i virus devono superare la barriera intestinale della zanzara per raggiungere l'emolinfa, da dove potrebbero potenzialmente diffondersi alle ghiandole salivari. Quando una zanzara morde, questi virus si diffondono a nuovi ospiti vertebrati. Allo stesso modo, la zanzara può raccogliere diversi virus. In generale, solo una piccola parte dei virus può entrare nelle ghiandole salivari attraverso l'intestino. L'efficienza di trasmissione di questi virus alle ghiandole è influenzata dalle due barriere fisiche presenti in diverse specie di zanzare: barriere midgut e barriere delle ghiandole salivari. Questo protocollo presenta un metodo per il rilevamento del virus nelle ghiandole salivari di Aedes aegypti dopo l'alimentazione orale e l'infezione da iniezione intratoracica. Inoltre, determinare se l'intestino e/o le ghiandole salivari ostacolano la diffusione virale può aiutare nella valutazione del rischio di MBV trasmessi da Aedes aegypti.
Introduction
I virus trasmessi dalle zanzare (MBV), un gruppo eterogeneo di virus a RNA, possono persistere nei vettori delle zanzare e successivamente diffondersi agli ospiti vertebrati1. Gli MBV clinicamente importanti sono principalmente distribuiti in quattro famiglie di virus, vale a dire Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae e Peribunyavividae 2,3. Negli ultimi decenni, questi virus sono stati segnalati in tutto il mondo, causando problemi di salute pubblica. Come uno dei MBV più noti, il virus Dengue (DENV) è diventato l'arbovirus emergente o riemergente più diffuso in oltre 100 paesi negli ultimi 20 anni4. Dalla scoperta del virus Zika (ZIKV) nell'entroterra, quasi tutti i paesi e territori tropicali e subtropicali del continente hanno riportato infezioni umane da ZIKV5. Al fine di valutare il rischio di trasmissione del virus, numerosi studi negli ultimi anni si sono concentrati sulla competenza dei vettori di zanzare per questi virus 6,7. Di conseguenza, è fondamentale prevenire e controllare efficacemente le malattie trasmesse da vettori.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), una delle zanzare più facilmente allevate in laboratorio, è un importante vettore di DENV, ZIKV, virus Chikungunya (CHIKV) e virus della febbre gialla (YFV)8. Per molto tempo, Ae. aegypti è stato trovato solo nel continente africano e nel sud-est asiatico, ma negli ultimi anni ha colonizzato quasi tutti i continenti9. Inoltre, l'abbondanza globale di Ae. aegypti è in continua crescita, con un aumento stimato del 20% entro la fine del secolo10. Dal 2004 al 2009 in Cina, c'è stato un evidente aumento della competenza del vettore Ae. aegypti per DENV a causa delle temperature giornaliere più elevate11. Lo status di Ae. aegypti come vettore patogeno è aumentato significativamente in Cina. Di conseguenza, per affrontare queste sfide, è necessario studiare la competenza vettoriale di Ae. aegypti per trasmettere virus.
Come artropode ematofago, la zanzara femmina perfora la pelle di un ospite vertebrato e si nutre del sangue. Le zanzare occasionalmente acquisiscono virus da host infetti da virus e quindi trasferiscono i virus a un nuovo ospite. Pertanto, per determinare la competenza del vettore, le zanzare vengono alimentate con una farina di sangue artificiale contenente arbovirus attraverso un sistema di alimentazione nell'impostazione di laboratorio12. Le singole zanzare vengono separate in teste, corpi e secrezioni di saliva diversi giorni dopo l'infezione. Per misurare i tassi di infezione, diffusione e trasmissione del virus, i titoli virali sono stati rilevati mediante PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR) o test di placca. Tuttavia, non tutte le zanzare sviluppano infezioni dell'intestino medio e la capacità di trasferire un virus all'ospite successivo dopo l'alimentazione del sangue. È collegato alle barriere fisiologiche delle zanzare, che impediscono agli agenti patogeni di penetrare nel corpo e svolgono un ruolo vitale nella loro immunità innata13. Le barriere dell'intestino medio, in particolare la barriera di infezione dell'intestino medio (MIB) e la barriera di fuga dell'intestino medio (MEB), influenzano se il virus potrebbe infettare il vettore sistemicamente e l'efficienza con cui si diffonde. Ostacola l'analisi delle infezioni di altri tessuti, come le ghiandole salivari che presentano anche infezioni delle ghiandole salivari e barriere di fuga13,14. Per caratterizzare meglio l'infezione delle viscere intermedie e delle ghiandole salivari nel vettore, viene presentato qui un protocollo dettagliato per l'alimentazione orale e l'inoculazione intratoracica dell'arbovirus in Ae. aegypti. Questo protocollo potrebbe essere applicato a ulteriori infezioni da arbovirus in una varietà di vettori di zanzare, come l'infezione da DENV e ZIKV in Aedes spp., e potrebbe rivelarsi una procedura praticabile.
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Protocol
1. Preparazione di virus e zanzare
- Preparazione di virus
NOTA: Tutti i processi sono stati eseguiti in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2). Il livello di contaminazione di biosicurezza utilizzato dovrebbe essere determinato dalla valutazione del rischio del patogeno e dalle normative specifiche per nazioni e regioni. Il processo deve essere eseguito in un armadio di biosicurezza.- Inoculare 1 x 106 cellule C6/36 in un matraccio di coltura T75. Riempire il matraccio con 10 mL di terreno Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S).
NOTA: Il mezzo L-15 di Leibovitz (L15) o il mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) possono anche essere utilizzati per mantenere le cellule C6/36. - Mantenere le cellule al 5% di CO2 a 28 °C durante la notte e rimuovere il surnatante cellulare il giorno successivo quando le cellule sono confluenti all'80% -90%.
- Aggiungere 1 mL di diluizione del virus (molteplicità dell'infezione (MOI) = 0,01) nel matraccio e incubare le cellule per 1 ora in 5% di CO2 a 28 °C. Il virus del lago Ebinur (EBIV)15, un orthobunyavirus trasmesso dalle zanzare, è stato utilizzato come virus modello per questo protocollo.
- Rimuovere il surnatante e lavare le cellule 3 volte con 5 ml di PBS. Riempire il pallone con 15 mL di nuovo mezzo RPMI con FBS al 2%. Mantenere il matraccio al 5% di CO2 a 28 °C.
- Raccogliere il virus contenente surnatante quando viene raggiunto il titolo virale richiesto (dopo quasi 5 giorni, a seconda del virus utilizzato). Per EBIV, questo valore del titolo era 107 unità formanti placca (PFU)/ml. Sottoconfezionarli in singoli tubi di stoccaggio con tappo a vite da 2 ml e conservare i tubi contenenti 0,5-1 mL di virus a -80 °C.
- Inoculare 1 x 106 cellule C6/36 in un matraccio di coltura T75. Riempire il matraccio con 10 mL di terreno Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (P/S).
- Determinazione del titolo virale
NOTA: Determinare il titolo virale attraverso i saggi della placca16. BHK-21 è stato utilizzato per determinare il titolo virale di EBIV, a causa dell'evidente effetto citopatico (CPE) osservato nelle cellule infette.- Inoculare 1 x 105 cellule BHK-21 in ciascun pozzetto di piastre a 24 pozzetti. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di mezzo DMEM contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S. Mantenere le cellule al 5% di CO2 a 37 °C durante la notte.
- Effettuare sei (10-6) diluizioni successive di 10 volte di surnatante contenente virus con terreno DMEM fresco contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S.
- Aggiungere 100 μL di diluente virale in ciascun pozzetto di piastre a 24 pozzetti contenenti il monostrato BHK-21. Eliminare il diluente virale dopo l'incubazione per 1 ora in CO 2 al 5% a 37 °C. Aggiungere 500 μL di DMEM contenente l'1,5% di metilcellulosa a ciascun pozzetto.
- Cellule di coltura in 5% di CO2 a 37 °C per 48 ore (il CPE apparente è stato trovato dopo 48 ore per EBIV). Fissare le cellule durante la notte con 750 μL di formaldeide al 3,7%.
- Colorarli con 200 μL di viola cristallo al 2% per 15 min. Contare il numero di placche per calcolare il titolo virale.
- Allevamento di zanzare in laboratorio
NOTA: zanzare posteriori in un laboratorio di livello di contenimento degli artropodi (ACL-1).- Per la preparazione dell'acqua declorata, riempire un secchio da 20 litri con acqua di rubinetto e lasciarlo riposare per 7-8 giorni senza luce. Non coprire il coperchio.
- Conservare le uova e le larve di Ae. aegypti in una stanza delle zanzare con le seguenti condizioni: 28 ± 1 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore e un'umidità relativa del 75% ± del 5%.
- Mantenere quasi 1.000 larve in un piatto poco profondo (22 cm x 15 cm x 6 cm) contenente acqua declorata dopo la schiusa delle uova. Dai loro da mangiare con quasi 1/8 di cucchiaino di polvere di mangime per topi. Rinfrescare il cibo ogni giorno e cambiare l'acqua ogni 2 giorni.
- Una volta che le larve si impupano dopo 5-7 giorni, utilizzare un contagocce una tantum per trasferire le pupe in un bicchiere di plastica (7 once) pieno di acqua declorata.
- Mettere cinque tazze contenenti pupe (circa 200 per tazza) in una gabbia a maglie (30 cm x 30 cm x 30 cm) e tenere le gabbie nell'incubatrice con le stesse condizioni del punto 1.3.2.
- Metti una piccola spugna contenente una soluzione di glucosio all'8% (m / p) su ogni gabbia a rete per nutrire le zanzare adulte. Dopo l'emergenza adulta, estrarre le tazze senza pupe. Tenere le gabbie a rete con circa 1.000 zanzare adulte per gabbia nella stessa incubatrice per insetti.
2. Preparazione per l'infezione orale
- Preparare le zanzare femmine per l'infezione orale. Usa la macchina che assorbe le zanzare per raccogliere zanzare di 5-8 giorni. Anestetizzarli a -20 °C per 1 minuto e controllare se le zanzare hanno le vertigini. In caso contrario, anestetizzarli per un altro minuto a -20 °C.
- Versali rapidamente nei bicchieri di plastica (24 once) a circa 200 zanzare (femmina e maschio) per tazza. Coprire rapidamente ogni tazza con una zanzariera ben tagliata, seguita da un coperchio con un foro (circa 6 cm di diametro) nel mezzo.
- Affamare le zanzare per 24 ore prima dell'infezione orale e preparare un pasto di sangue infettivo come segue.
- In un armadio di biosicurezza in condizioni BSL-2, estrarre lo stock di virus dal congelatore a -80 °C e scongelarlo sul ghiaccio. Diluire lo stock virale ad una concentrazione di 2 x 106 PFU/ml con terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S. Mescolare la diluizione del virus con un volume uguale di sangue di cavallo defibato.
NOTA: I processi sono stati eseguiti in un armadio di biosicurezza in un laboratorio ACL-2.
3. Eseguire l'infezione orale
NOTA: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in un laboratorio ACL-2. Il processo deve essere eseguito nel vano portaoggetti per impedire alle zanzare di fuggire.
- Eseguire l'alimentazione artificiale utilizzando il sistema di alimentazione artificiale delle zanzare per 1 ora.
- Tagliare le membrane di collagene alla dimensione appropriata (circa 5 cm di diametro), fissarle ai serbatoi con o-ring, quindi aggiungere la miscela virus-sangue (circa 3 ml) ai serbatoi. Utilizzare tappi di plastica per sigillare i serbatoi e prevenire perdite.
NOTA: questi passaggi sono stati eseguiti in un armadio di biosicurezza. - Metti i bicchieri di plastica (24 once) contenenti zanzare nel vano portaoggetti. Avvitare i serbatoi sigillati sull'alimentatore FU1 e mettere un serbatoio su una tazza, quindi accendere l'unità di alimentazione. Dai da mangiare alle zanzare per 1 ora
- Tagliare le membrane di collagene alla dimensione appropriata (circa 5 cm di diametro), fissarle ai serbatoi con o-ring, quindi aggiungere la miscela virus-sangue (circa 3 ml) ai serbatoi. Utilizzare tappi di plastica per sigillare i serbatoi e prevenire perdite.
- Anestetizzare le zanzare con CO2 per diversi secondi fino a quando non svengono. In breve, posizionare la pistola a spruzzo ad anidride carbonica al centro della rete attraverso il foro sulla tazza contenente zanzare, aprire il valore e consentire che enormi quantità di anidride carbonica vengano emesse per anestetizzare le zanzare.
- Versateli in una capsula di Petri posta sul ghiaccio e coprite velocemente il coperchio. Scegli le zanzare femmine ingorgate con una pinza. Per identificare, i maschi hanno antenne piumate e le femmine hanno antenne semplici. Trasferiscili in nuovi bicchieri di plastica a 50 zanzare femmine per tazza.
NOTA: Le zanzare femmina ingorgate sono state raccolte per mantenere la coerenza poiché la quantità di alimentazione influisce sul contenuto virale. - Avvolgere la tazza con una rete di zanzariera tagliata e quindi coprirla con un coperchio con un buco nel mezzo. Tagliare la spugna in un pezzettino e metterla sulla tazza.
- Aggiungere una soluzione di glucosio all'8% sulla spugna utilizzando un contagocce monouso di plastica. Conservare le tazze contenenti zanzare femmine nell'incubatrice a 27 °C all'80% di umidità per 10 giorni. Sostituire una nuova spugna satura di glucosio ogni 72 ore.
4. Preparazione per l'inoculazione intratoracica
- Preparare gli aghi per microiniezione come segue. Utilizzare un PUL-1000 per realizzare aghi per microiniezione (Figura 1A) con i seguenti parametri nel programma di estrazione dell'ago: indice di calore = 450, forza (g) = 110, distanza (mm) = 1,00 e ritardo (s) = 0.
- Tagliare la punta di un ago tirato con una pinzetta sotto il microscopio da dissezione con ingrandimento 16x (Figura 1B). Non rendere la punta troppo grande, altrimenti può danneggiare le zanzare.
- Preparare le zanzare femmine come al punto 2.1.
NOTA: i seguenti processi sono stati eseguiti in un laboratorio ACL-2. - Preparare la diluizione del virus infettivo come segue:
- Estrarre le scorte di virus dal congelatore a -80 °C e scongelarle sul ghiaccio. Diluire il virus in una diluizione del virus 100 nL contenente 100-500 PFU virus con RPMI 1640 terreno contenente 10% FBS e 1% P/S. Mantenere la diluizione del virus su ghiaccio.
- Riempire l'ago con olio minerale attraverso una siringa sterile monouso. Inserire l'ago nell'iniettore seguendo le istruzioni sulla macchina.
- Inserire l'ago in una provetta contenente la diluizione del virus infettivo. Non rompere la punta dell'ago. Premere il pulsante FILL per riempire l'ago con la soluzione virale. Il volume finale della soluzione virale nell'ago è di circa 4,0 μL. Una volta che l'ago è pieno del virus, fare attenzione a non toccarlo e danneggiarlo.
NOTA: I passaggi sono stati eseguiti in un armadio di biosicurezza.
5. Eseguire l'iniezione virale al microscopio da dissezione
NOTA: Tutti i passaggi sono stati eseguiti in un laboratorio ACL-2.
- Anestetizzare le zanzare a -20 °C per 1 min. Versateli in una capsula di Petri posta sul ghiaccio e coprite velocemente il coperchio.
- Scegli quasi 50 zanzare femmine con una pinzetta e mettile sulla piastra di ghiaccio. Posizionare la piastra di ghiaccio sotto l'iniettore e inserire l'ago nella cavità toracica della zanzara sotto il microscopio da dissezione (Figura 1C).
- Impostare il volume di iniezione su 100 nL e la velocità su 50 nL/s. Premere il pulsante INJECT per consentire alla soluzione virale di fluire nella zanzara. Se si verifica un'iniezione di successo, l'addome si gonfia leggermente.
- Metti la zanzara infetta in un nuovo bicchiere di plastica (24 once) posto sul ghiaccio. Quando il numero delle zanzare infette è sufficiente, avvolgere la tazza con una rete di zanzariera tagliata e quindi coprirla con il coperchio.
- Conservare la tazza contenente zanzare infettive nell'incubatrice a 27 °C all'80% di umidità per 10 giorni. Dai da mangiare alle zanzare come al punto 3.5.
6. Elaborazione delle zanzare femmine infette
NOTA: Tre diversi tessuti / organi sono stati sezionati da ogni zanzara femmina: l'intestino per il calcolo del tasso di infezione virale (VIR), la testa per il calcolo del tasso di diffusione del virus (VDR) e la saliva per il calcolo del tasso di trasmissione del virus (VTR). VIR è stato definito come il numero di zanzare con intestino positivo al virus. VDR è stato definito come il numero di zanzare con teste positive al virus diviso per il numero di zanzare con intestino positivo al virus per 100. VTR è stato definito come il numero di zanzare con saliva positiva al virus diviso per il numero di zanzare con intestino positivo al virus per 100.
- Raccolta di saliva dalle zanzare femmine infette
NOTA: I processi devono essere eseguiti in un laboratorio ACL-2.- Anestetizzare le zanzare femmine infette mediante anestetizzazione ad anidride carbonica come al punto 3.2. Versateli in una capsula di Petri posta sul ghiaccio e chiudete velocemente il coperchio.
- Posizionare le punte delle pipette da 10 μL riempite con olio ad immersione fianco a fianco sul fango di gomma.
- Scegli le zanzare femmine con una pinzetta e mettile su una piastra di ghiaccio. Rimuovi le gambe e le ali con una pinzetta. Posizionare l'apparato boccale di una zanzara su ciascuna punta della pipetta.
- Raccogliere la saliva come secreta nell'olio dalle zanzare per i successivi 45-60 minuti a temperatura ambiente.
- Posizionare le punte delle pipette in provette da 1,5 mL contenenti 200 μL di mezzo diluente virale (terreno RPMI 1640 contenente il 10% di FBS e l'1% di P/S). Centrifugarli a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C per espellere la saliva nei tubi. Conservare questi tubi a -80 °C per la successiva determinazione delle velocità di trasmissione.
- Sezionare le zanzare femmine infette
NOTA: I processi devono essere eseguiti in un laboratorio ACL-2.- Usa le pinzette per tagliare le teste delle zanzare femmine dopo la raccolta della saliva. Inserire ciascuna testa in un singolo tubo contenente 200 μL di mezzo RPMI 1640.
- Prendi il torace con una pinzetta, poi il penultimo segmento dell'addome con un'altra pinzetta e tiralo fuori. L'intestino verrà estratto. Pulire l'intestino estratto da qualsiasi tessuto e organo vagante.
- Lavare l'intestino con PBS e posizionare ciascun budello in un singolo tubo contenente 200 μL di terreno RPMI 1640. Conservare queste provette a -80 °C per la successiva determinazione del tasso di infezione da virus e del tasso di diffusione.
7. Analisi dei dati
- Estrazione dell'RNA
- Macinare i tessuti in pezzi con una rettificatrice omogeneizzatore a bassa temperatura impostata sui seguenti parametri: frequenza operativa = 60 Hz, tempo di funzionamento = 15 s, tempo di pausa = 10 s, cicli = 2 e temperatura di regolazione = 4,0 °C.
- Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Estrarre l'RNA totale di ciascun campione mediante un sistema automatizzato di estrazione degli acidi nucleici seguendo le istruzioni dello strumento.
- Esecuzione della qRT-PCR
- Utilizzare il kit RT-PCR one-step per quantificare le copie virali dell'RNA utilizzando uno strumento PCR quantitativo17. Utilizzare i seguenti primer per il rilevamento del segmento F di EBIV S: ATGGCATCACCTGGGAAAG e R: TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Impostare il processo di reazione come: stadio 1: 42 °C per 5 min, 95 °C per 10 s; fase 2: 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 20 s.
- Determinare la dose virale più bassa per l'infezione nelle cellule attraverso le diluizioni seriali 10 volte inoculate sulle cellule. Utilizzare le cellule BHK-21 per determinare la dose virale più bassa di EBIV, utilizzando diluizioni fino a 10-7 come descritto nella fase 1.2.
- Calcolare il valore Ct della dose più bassa di virus mediante qRT-PCR. Utilizzare il valore limite per EBIV-positivo mediante qRT-PCR come < 35. Utilizzare la seguente equazione per calcolare le copie di EBIV in ciascun campione:
y = -4,0312x + 3,384 [x = log (le copie di EBIV), y = valore Ct, R2 = 0,9905] - Calcolare il tasso di infezione, il tasso di diffusione e il tasso di trasmissione come segue:
Tasso di infezione (%) = 100 x (il numero di budella di zanzare positive al virus / il numero di zanzare totali)
Tasso di disseminazione (%) = 100 x (il numero di teste di zanzare positive al virus / il numero di budella di zanzare positive al virus)
Tasso di trasmissione (%) = 100 x (il numero di saliva di zanzara virus-positive / il numero di budella di zanzara virus-positive) - Analizzare le differenze nelle variabili continue e le differenze nei tassi di infezione delle zanzare, nei tassi di disseminazione e nei tassi di trasmissione utilizzando l'analisi Kruskal-Wallis non parametrica per confronti multipli e il test esatto di Fisher, ove appropriato.
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Representative Results
Per esaminare la distribuzione dell'EBIV nelle zanzare infette tramite alimentazione artificiale del sangue (il titolo finale virale era 6,4 x 106 PFU / ml) e iniezione intratoracica (la dose virale era 340 PFU), sono stati determinati gli RNA virali nella saliva, nelle teste e nell'intestino delle zanzare a 10 giorni dopo l'infezione (dpi).
Per Ae. aegypti, il titolo virale di EBIV nelle viscere, nelle teste e nella saliva delle zanzare femmine inoculate per via intratoracica era molto più alto di quello delle zanzare femmine infette per via orale (Figura 2A-C). Il tasso di infezione e il tasso di diffusione per le zanzare femmine inoculate per via intratoracica erano del 100%, ma per le zanzare femmine con infezione orale erano rispettivamente del 70% e del 38,1% (Figura 2D, E). Il tasso di trasmissione per le zanzare femmine inoculate per via intratoracica ha raggiunto fino al 90%, ma per le zanzare femmine con infezione orale è stato solo del 4,8%. Ha indicato che l'intestino di Ae. aegypti aveva un forte effetto inibitorio per la trasmissione del virus.
Figura 1: Schema della punta della micropipetta e dell'iniezione intratoracica . (A) Punta della micropipetta tirata prima di rompere la punta. (B) Punta di micropipetta adeguatamente preparata adatta per l'inoculazione intratoracica. (C) Schema dell'iniezione intratoracica per le zanzare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Competenza vettoriale delle zanzare adulte attraverso l'alimentazione orale e l'inoculazione intratoracica. Le zanzare femmine infette sono state incubate a 28 °C per 10 giorni. Il valore p ≤ 0,05 è stato considerato statisticamente significativo. L'analisi non parametrica di Kruskal-Wallis è stata utilizzata per confronti multipli e per il test esatto di Fisher, ove appropriato. Questa cifra è stata modificata dallo studio di Xia et al.18. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'obiettivo di questo metodo era quello di fornire una valutazione completa del rischio di un virus trasmesso dalle zanzare valutando la competenza del vettore attraverso l'alimentazione orale e l'inoculazione intratoracica.
Nell'esperimento di alimentazione orale, le zanzare ingoiate devono essere selezionate e trasferite in un nuovo contenitore, ponendo un grave rischio per gli operatori. La ragione di ciò è perché qualsiasi zanzara, comprese le zanzare non infette, potrebbe essere una fonte di infezione19. Di conseguenza, le zanzare devono essere prima anestetizzate come specificato nel protocollo, quindi devono essere eseguite le fasi di follow-up. È importante notare che la selezione delle zanzare ingorgate e il loro trasferimento devono essere eseguite in un vano portaoggetti sigillato. Tenere il vano portaoggetti chiuso durante il processo a meno che non ci siano zanzare che si muovono liberamente nella scatola.
Nell'esperimento di infezione, è meglio che due individui lavorino insieme, e dopo che le due persone confermano che non ci sono zanzare in fuga allo stesso tempo, possono aprire il vano portaoggetti per impedire alle zanzare infette di fuggire. Se si verifica una fuga, quelle zanzare devono essere uccise o ricatturate. Non è consigliabile uccidere le zanzare infette a mani nude. Il rischio di infezione degli operatori può essere ridotto utilizzando aspiratori a vuoto o altri strumenti appropriati (ad esempio, pinze, pennelli, mani guantate). Dopo l'esperimento, disinfettare l'interno del vano portaoggetti e la superficie del banco da lavoro con un disinfettante convenzionale.
La maggior parte della ricerca sulla competenza dei vettori delle zanzare per i virus trasmessi dalle zanzare si è concentrata esclusivamente sull'infezione orale20,21. Per l'infezione orale, i virus devono superare diverse barriere tissutali associate all'intestino medio e alle ghiandole salivari per essere rilasciati nella saliva14. L'effetto della ghiandola intestinale media e della ghiandola salivare sulla capacità vettoriale delle zanzare non è stato dimostrato in questo esperimento. Quando l'alimentazione orale e l'iniezione intratoracica sono combinate, le diverse barriere tissutali possono essere accuratamente valutate. Secondo i risultati di questa procedura, l'intestino di Ae. aegypti svolge un ruolo dominante nella competenza del vettore per il virus e la barriera delle ghiandole salivari potrebbe non essere presente (Figura 2). Per questo, il nostro protocollo è utile per confermare la presenza di barriere dell'intestino medio o delle ghiandole salivari all'infezione da arbovirus.
Secondo la metodologia, solo l'RNA virale è stato identificato nei campioni. Altre indagini, come vedere il virione con un microscopio elettronico a trasmissione, confermare l'infezione utilizzando saggi di placca o rilevare proteine virali con un test di immunofluorescenza, sono necessarie per confermare i virus infettivi nei vari campioni. Questa metodologia può essere modificata e utilizzata per inoculare ulteriori virus di interesse in una vasta gamma di vettori di zanzare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
References
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