Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो विवरण देता है कि चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके विवो माउस ग्लियोब्लास्टोमा मॉडल में सोनोडायनामिक थेरेपी कैसे करें।
Abstract
सोनोडायनामिक थेरेपी (एसडीटी) केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) का एक अनुप्रयोग है जो सोनिकेशन के दौरान बढ़ी हुई संवेदनशीलता के लिए प्रमुख ट्यूमर के लिए एक सोनोसेंसिटाइजिंग एजेंट को सक्षम बनाता है। दुर्भाग्य से, ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) के लिए वर्तमान नैदानिक उपचार की कमी है, जिससे रोगियों के बीच कम दीर्घकालिक जीवित रहने की दर है। एसडीटी एक प्रभावी, गैर-आक्रामक और ट्यूमर-विशिष्ट तरीके से जीबीएम के इलाज के लिए एक आशाजनक तरीका है। सोनोसेंसिटाइज़र अधिमानतः आसपास के मस्तिष्क पैरेन्काइमा की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं में प्रवेश करते हैं। सोनोसेंसिटाइजिंग एजेंट की उपस्थिति में एफयूएस का आवेदन प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों को उत्पन्न करता है जिसके परिणामस्वरूप एपोप्टोसिस होता है। यद्यपि इस चिकित्सा को पहले प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रभावी दिखाया गया है, लेकिन स्थापित मानकीकृत मापदंडों की कमी है। प्रीक्लिनिकल और नैदानिक उपयोग के लिए इस चिकित्सीय रणनीति को अनुकूलित करने के लिए मानकीकृत तरीके आवश्यक हैं। इस पेपर में, हम चुंबकीय अनुनाद-निर्देशित एफयूएस (एमआरजीएफयूएस) का उपयोग करके प्रीक्लिनिकल जीबीएम कृंतक मॉडल में एसडीटी करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं। MRGFUS इस प्रोटोकॉल की एक महत्वपूर्ण विशेषता है, क्योंकि यह आक्रामक सर्जरी (जैसे, क्रैनियोटॉमी) की आवश्यकता के बिना मस्तिष्क ट्यूमर के विशिष्ट लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है। यहां उपयोग किया जाने वाला बेंचटॉप डिवाइस एमआरआई छवि पर एक लक्ष्य पर क्लिक करके तीन आयामों में एक विशिष्ट स्थान पर ध्यान केंद्रित कर सकता है, जिससे लक्ष्य चयन एक सीधी प्रक्रिया बन जाती है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को एमआरजीएफयूएस एसडीटी के लिए एक मानकीकृत प्रीक्लिनिकल विधि प्रदान करेगा, जिसमें ट्रांसलेशनल अनुसंधान के लिए मापदंडों को बदलने और अनुकूलित करने के लिए अतिरिक्त लचीलापन होगा।
Introduction
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) अत्यधिक आक्रामक मस्तिष्क कैंसर का एक रूप है जिसमें प्रति 100,000 लोगों में 3.21 की घटना होती है और यह सबसे आम घातक मस्तिष्क ट्यूमर1 है। देखभाल के वर्तमान मानक में सर्जिकल रिसेक्शन, विकिरण और कीमोथेरेपी2 शामिल हैं। ट्यूमर की आक्रामक और घुसपैठ प्रकृति के कारण, पूर्ण ट्यूमर शोधन दुर्लभ है। ट्यूमर मार्जिन पर अवशिष्ट ऊतक के परिणामस्वरूप ट्यूमर पुनरावृत्ति की उच्च दर और 5 साल के बाद 6% से कम की कम जीवित रहने की दरहोती है।
इस रोग का निदान करने के कारण, शोधकर्ता इस घातक बीमारी का मुकाबला करने के लिए नए चिकित्सीय विकल्पों की खोज कर रहे हैं। सोनोडायनामिक थेरेपी (एसडीटी) एक गैर-आक्रामक उपचार है जोलक्षित कोशिकाओं में साइटोटोक्सिक प्रभाव पैदा करने के लिए कम तीव्रता वाले केंद्रित अल्ट्रासाउंड (एफयूएस) और सोनोसेंसिटाइजिंग एजेंटों को जोड़ता है। एक उदाहरण के रूप में, पोर्फिरीन-आधारित सोनोसेंसिटाइज़र जैसे 5-एमिनोलेवुलिनिक एसिड (5-एएलए) अधिमानतः ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा लिए जाते हैं और केंद्रित अल्ट्रासाउंड के संपर्क में आने पर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को हानिकारक स्तर तक बढ़ाते हैं। कोशिकाओं में आरओएस के अतिरंजित स्तर सेलुलर संरचनाओं को नुकसान पहुंचा सकते हैं और एपोप्टोसिस को ट्रिगर कर सकते हैं। चूंकि 5-एएलए अधिमानतः ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है, उपचार क्षेत्र के भीतर स्वस्थ ऊतक को नुकसान नहीं होता है 3,4. प्रारंभिक इन विट्रो अध्ययनों से पता चला है कि कई कैंसर कोशिकाओं को एसडीटी उपचार द्वारा व्यवस्थित किया जाता है, हालांकि कोशिका मृत्यु की दर सेल लाइन पर निर्भर है। विवो अध्ययनों में प्रारंभिक समान परिणाम देते हैं, यह पुष्टि करते हुए कि एसडीटी एपोप्टोसिस5 को ट्रिगर कर सकता है।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य बेंचटॉप एफयूएस अनुसंधान मंच का उपयोग करके इंट्राक्रैनील रूप से प्रत्यारोपित जीबीएम कोशिकाओं के साथ कृंतक मॉडल के एसडीटी उपचार के लिए प्रभावी तकनीकों और मापदंडों का वर्णन करना है। शोधकर्ता ट्रांसलेशनल एफयूएस अनुसंधान के लिए एसडीटी को निष्पादित और अनुकूलित करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर सकते हैं।
Protocol
सभी पशु अध्ययनों को जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के अनुसार अनुमोदित और आयोजित किया गया था। एथिमिक नग्न मादा चूहों (आयु: 10 सप्ताह) वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। सभी जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) नियमों का पालन किया गया, जिसमें मास्क, दस्ताने और गाउन का उपयोग शामिल था।
1. ट्यूमर प्रत्यारोपण और बायोलुमिनेसेंस इमेजिंग
- अध्ययन के प्रारंभिक चरण के दौरान, पहले प्रकाशित रिपोर्ट6 के बाद, इंट्राक्रैनील ट्यूमर प्रत्यारोपण करें।
नोट: इस अध्ययन में, सेल निलंबन के 4 μL में 100,000 M59 मानव GBM जेनोग्राफ्ट कोशिकाओं का उपयोग खोपड़ी में 3.0 मिमी गहराई पर आरोपण के लिए किया गया था। - उपचार से पहले, पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 के बाद विवो ल्यूमिनेसेंस इमेजिंग सिस्टम (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रत्येक माउस में ट्यूमर के आकार को गैर-आक्रामक रूप से निर्धारित करें।
नोट: यह प्रारंभिक ट्यूमर प्रत्यारोपण के 7 दिन बाद उपचार की तारीख पर किया गया था। - इमेजिंग परिमाणीकरण का उपयोग करके, उपचार के लिए चूहों को तुलनीय उपसमूहों में विभाजित करें।
नोट: इस अध्ययन में, दो उपसमूहों को शामिल किया गया था: (1) अनुपचारित ट्यूमर-असर वाले चूहे (एन = 4) और (2) एसडीटी (एन = 4) से गुजरने वाले ट्यूमर-असर वाले चूहे। दो समूहों (पी > 0.05) के बीच पूर्व-उपचार ट्यूमर के आकार में कोई सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।
2. उपचार दिवस सेटअप
- फ्रीजर से 5-एएलए हाइड्रोक्लोराइड ( सामग्री की तालिका देखें) निकालें और 5-एएलए के 200 मिलीग्राम / किलोग्राम माउस वजन का वजन करें (उदाहरण के लिए, 25 ग्राम माउस के लिए, 5 मिलीग्राम वजन करें)। ऐसा केवल परिवेश प्रकाश के तहत करें।
नोट: उपयोग करने से पहले सभी उपकरणों को बाँझ करें। - फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) में 5-एएलए की कुल मात्रा को भंग करें, जैसे कि प्रत्येक जानवर को सही वजन खुराक के साथ 5-एएलए के 60 मिलीग्राम / एमएल समाधान दिया जाता है (उदाहरण के लिए, 25 ग्राम माउस के लिए, 5 मिलीग्राम 5-एएलए को पीबीएस के 83.33 μL में घोलें)।
- एसडीटी परीक्षण समूह में प्रत्येक जानवर के लिए, पशु इंट्रापरिटोनियल रूप से 5-एएलए के समाधान की उचित मात्रा इंजेक्ट करें (चरण 2.1 और 2.2 में गणना)।
- 5-एएलए को चयापचय करने के लिए जानवरों को 3 घंटे के लिए अपने पिंजरों में छोड़ दें।
3. प्रयोगों के लिए आवश्यक तैयारी
- विआयनीकृत (डीआई) पानी के साथ एक जलाशय भरें।
नोट: आवश्यक पानी की मात्रा अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चूहों की संख्या पर आधारित है। - अल्ट्रासोनिक डिगैसर (सामग्री की तालिका देखें) में फ्लो इन और फ्लो ट्यूब संलग्न करें और डिगैसर को पावर (1 = ओएन, 0 = ऑफ) में प्लग करें।
- प्रवाह के दूसरे छोर को अंदर रखें और डीआई जल जलाशय में ट्यूबों को प्रवाहित करें।
- डिगैसर चालू करें और 45 मिनट तक चलाएं।
- अध्ययन के दौरान उपयोग किए जाने वाले एक एयरटाइट, सीलबंद कंटेनर के शीर्ष पर नए डिगैस्ड पानी को भरें।
- एक शंक्वाकार ट्यूब में अल्ट्रासाउंड जेल ( सामग्री की तालिका देखें) डालें, और फिर एक सेंट्रीफ्यूज में रखें और जेल से किसी भी हवा को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए 160 x g पर स्पिन करें।
नोट: प्रत्येक जानवर के सिर पर जेल का एक गुड़िया बनाने के लिए पर्याप्त जेल की आवश्यकता होती है।
4. MRGFUS सिस्टम सेटअप
- चित्र 1 (नीचे पैनल) में देखे गए वायरिंग आरेख का उपयोग करके MRGFUS सिस्टम (सामग्री की तालिका देखें) को कनेक्ट करें।
- सभी आवश्यक घटकों (डेस्कटॉप कंप्यूटर, मॉनिटर, MRGFUS प्लेटफ़ॉर्म, ऑसिलोस्कोप, एम्पलीफायर) को पावर से कनेक्ट करें।
- सभी केबलों को सही स्थानों से कनेक्ट करें.
- वांछित ट्रांसड्यूसर को बीएनसी और समाक्षीय केबलों के माध्यम से एमआरजीएफयूएस प्लेटफॉर्म से कनेक्ट करें, और फिर संबंधित प्रतिबाधा मिलान बॉक्स को सही तारों से कनेक्ट करें।
नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए एक 515 kHz ट्रांसड्यूसर का उपयोग किया गया था।
- सभी डिवाइस चालू करें.
- डेस्कटॉप कंप्यूटर ऑपरेटिंग सिस्टम पर, AUREUS अनुप्रयोग खोलें, जो पहले से ही FUS सिस्टम सॉफ़्टवेयर में एकीकृत है।
- हार्डवेयर को सिस्टम से कनेक्ट करने के लिए सभी हार्डवेयर कनेक्ट करें का चयन करें और सुनिश्चित करें कि घटक सॉफ़्टवेयर के साथ संचार कर रहे हैं।
- ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करके और वांछित ट्रांसड्यूसर चुनकर उपयोग किए जाने वाले ट्रांसड्यूसर का चयन करें।
5. प्रारंभ
- प्रेत से नीचे के पेंच को अनस्क्रू करें और गुहा को विआयनीकृत और डिगैस्ड पानी से भरें जब तक कि यह ओवरफ्लो न हो जाए, और फिर पेंच को फिर से बदल दें।
- प्रेत को उसके संबंधित एमआरआई बेड स्थान में डालें ( चित्रा 2 देखें), और फिर एमआरआई बेड को एमआरआई पालने में इसके संबंधित स्लॉट में रखें।
- एमआरआई क्रैडल को एमआरआई स्कैनर में इसके संबंधित स्थान पर रखें ( सामग्री की तालिका देखें)। पालने को समायोजित करें ताकि प्रेत एमआरआई बिस्तर प्रेत की उच्च गुणवत्ता वाली छवि प्राप्त करने के लिए बिना किसी बाधा के एमआरआई बोर में स्लाइड कर सके। इस स्थान को चिह्नित करें ताकि यह भविष्य में आसानी से प्रतिकृति हो।
नोट: एक बार यह स्थान मिल जाने के बाद, शेष उपचार के लिए स्थान नहीं बदला जाएगा। इसलिए, सुनिश्चित करें कि यह पशु एमआरआई प्लेसमेंट के लिए पर्याप्त स्थान है, या पूरे पंजीकरण को दोहराने की आवश्यकता होगी। - तालिका 1 में सेटिंग्स का उपयोग करके प्रेत का एमआरआई स्कैन लें।
- चुंबक बोर से पालना निकालें लेकिन इसे स्कैनर पर रखें। पालने से प्रेत युक्त एमआरआई बिस्तर को हटा दें, और फिर नीचे पर खूंटी को उसके सही स्लॉट में स्लाइड करके एमआरजीएफयूएस सिस्टम पर प्रेत के साथ बिस्तर रखें।
- ट्रांसड्यूसर आर्म पर चुंबकीय स्लॉट पर पंजीकरण टिप को स्लॉट करें ताकि यह प्रेत की ओर नीचे की ओर इंगित करे ( चित्र 2 देखें)।
- सॉफ़्टवेयर पर, एक नई होम स्थिति का चयन करें, और फिर निर्देशित केंद्रित खोज शुरू करने के लिए जॉग मोड ऑन का चयन करें। जॉग मोड टॉगल होने के बाद, ट्रांसड्यूसर आर्म को क्रमशः बाएं, दाएं, आगे, पीछे, ऊपर और नीचे दिशाओं में मैन्युअल रूप से स्थानांतरित करने के लिए बाएं, दाएं, ऊपर, नीचे, पृष्ठ ऊपर और पृष्ठ कुंजी का उपयोग करें।
- पॉइंटर को सभी तीन आयामों में मैन्युअल रूप से समायोजित करें जब तक कि पॉइंटर की नोक क्रॉस पैटर्न के मध्य को स्पर्श न करे जो प्रेत के शीर्ष पर स्थित है ( चित्र 2 देखें)।
- कंप्यूटर पर फैंटम एमआरआई छवियों को डाउनलोड करें और उन्हें चुनी हुई निर्देशिका में एक फ़ोल्डर में रखें, और फिर लोड फैंटम छवियों का चयन करके एमआरआई छवियों को सॉफ़्टवेयर में लोड करें। अक्षीय फैंटम स्लाइस तब स्क्रीन को दाईं ओर पॉप्युलेट करेंगे। माउस स्क्रॉल बार के माध्यम से इन स्लाइस के माध्यम से स्क्रॉल करें। छवि पर क्लिक करके और पकड़कर चमक समायोजित करें और फिर माउस को ऊपर या नीचे ले जाएं।
नोट: यदि फ़ोल्डर में कोई भी फ़ाइल असंपीड़ित DICOM फ़ाइलें नहीं हैं, तो सॉफ़्टवेयर उन्हें पढ़ने और आयात करने में सक्षम नहीं होगा, इसलिए उस फ़ोल्डर से किसी भी अन्य फ़ाइलों को हटा दें। - प्रेत की किसी भी छवि पर स्क्रॉल करें जहां प्रत्येक में तीन अंधेरे छेद के साथ एक स्पष्ट सर्कल है। प्रेत के बीच पर क्लिक करें, और एक लाल सर्कल पॉप अप होगा। वृत्त पर क्लिक करें और खींचें जब तक कि यह समान व्यास और प्रेत की परिधि के साथ रेखाबद्ध न हो जाए ( चित्र 2 देखें)।
- इस स्थिति के निर्देशांक को 'घर की स्थिति' के रूप में जाना जाता है; L/R, A/P, और S/I सेट करें पर क्लिक करके इसे सहेजें.
- जॉग मोड बंद पर क्लिक करें, ट्रांसड्यूसर आर्म से पंजीकरण टिप निकालें, और फिर फ़ोकस खोज से बाहर निकलें का चयन करें। प्रारंभिक अनुक्रम को पूरा करने के लिए घर की स्थिति की पुष्टि करें।
6. एसडीटी के लिए पशु तैयारी
- एक प्रेरण कक्ष में आइसोफ्लुरेन-ओ2 गैस मिश्रण का उपयोग करके माउस को एनेस्थेटाइज करें। एनेस्थीसिया प्रेरण के लिए गैस प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट और वेपोराइज़र को 2.0% पर सेट करें, आमतौर पर कक्ष में 3-5 मिनट की आवश्यकता होती है (सामग्री की तालिका देखें)।
- पैर की अंगुली को चुटकी मारकर पर्याप्त बेहोशी के लिए जानवर का आकलन करें। कॉर्निया के सूखेपन से बचने के लिए आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
नोट: प्रक्रिया के दौरान संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें। - पूंछ की नस के माध्यम से 40 μL गैडोलिनियम कंट्रास्ट एजेंट के साथ माउस इंजेक्ट करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
- हेयर रिमूवल क्रीम और इलेक्ट्रॉनिक शेवर का उपयोग करके खोपड़ी के ऊपर खोपड़ी को बाधित करने वाले किसी भी बाल को हटा दें।
- निम्नलिखित चरणों का उपयोग करके एमआरआई बिस्तर पर जानवर को सुरक्षित करें ( चित्रा 3 देखें)।
- एमआरआई बेड (चित्रा 3 ए) के इनलेट ट्यूब को संज्ञाहरण के लिए आइसोफ्लुरेन के स्रोत से कनेक्ट करें, और एनेस्थीसिया प्रेरण के लिए गैस प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट और वेपोराइज़र को 2.0% पर सेट करें। एनेस्थीसिया अवशोषण के लिए आउटलेट ट्यूब को चारकोल फिल्टर कनस्तर से कनेक्ट करें।
- नाक शंकु के टुकड़े को इसके स्लॉट में रखें, जैसा कि चित्र 3 बी में दिखाया गया है। जैसा कि दिखाया गया है, नाक के दोनों शंकु में और बिस्तर के अंत में बाइट बार छेद के माध्यम से बाइट बार को स्लाइड करें, जिसमें बाइट गार्ड अंत एमआरआई बेड में खुले कुएं पर मंडरा रहा है।
- जानवर को एमआरआई बिस्तर पर उसके कानों के साथ स्टीरियोटैक्टिक ईयर बार छेद के साथ पंक्तिबद्ध रखें और इसे रखने के लिए बाइट गार्ड के माध्यम से अपने दांतों को कुंडी लगाएं। नाक शंकु को आगे की ओर स्लाइड करें ताकि यह संज्ञाहरण की एक स्थिर धारा प्रदान करने के लिए जानवर के स्नूट के ऊपर हो।
- एमआरआई बिस्तर के दोनों किनारों पर छेद के माध्यम से कान की सलाखों को स्लाइड करें और जानवर के सिर को तब तक उठाएं जब तक कि दोनों कान की सलाखों को माउस के कान नहरों में फिट न किया जा सके।
नोट: बहुत दूर धक्का न दें, क्योंकि यह जानवर के कान के ड्रम को नुकसान पहुंचा सकता है। - सुनिश्चित करें कि जानवर एक आरामदायक स्थिति में है। फिर, एक फ्लैटहेड स्क्रूड्राइवर का उपयोग करके, एमआरआई-संगत स्क्रू में पेंच को दोनों कान सलाखों, नाक शंकु और काटने की पट्टी में लॉक करें। यह जानवर को जगह में बंद कर देगा और किसी भी सिर की गति को रोक देगा जब तक कि जानवर को बिस्तर से हटा नहीं दिया जाता है।
नोट: सुनिश्चित करें कि इस चरण के बाद एमआरआई बिस्तर पर जानवर की स्थिति में कोई गड़बड़ी नहीं है। यदि जानवर चलता है, तो पूरे सेटअप (चरण 6.5) को दोहराने की आवश्यकता होगी, भले ही प्रोटोकॉल कितनी दूर हो। - जब जानवर इंतजार कर रहा हो, तो शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एमआरआई बिस्तर को गर्म गर्मी पैड पर रखें।
नोट: प्रक्रिया के दौरान शरीर के तापमान की निगरानी और रखरखाव करें।
- मंच पर प्रदान किए गए फिक्स्चर का उपयोग करके, जब पशु बिस्तर को एफयूएस सिस्टम पर तय किया जाता है, तो उपचार के दौरान नाक शंकु से जुड़ी ट्यूबों के माध्यम से जानवर को आइसोफ्लूरेन की लगातार आपूर्ति की जाती है।
7. एमआरआई प्रक्रियाएं
- एमआरआई बिस्तर को जानवर स्टीरियोटैक्टिकल रूप से तय किया गया है और इसे एमआरआई स्कैनर से पहले जुड़े एमआरआई क्रैडल में रखें (सामग्री की तालिका देखें), एमआरआई क्रैडल पर खूंटे के अंत में एमआरआई बेड छेद को थक्के द्वारा, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है। एमआरआई मशीन में संबंधित ट्यूबों में इनलेट और आउटलेट एनेस्थीसिया ट्यूब संलग्न करें।
- जानवर वाले एमआरआई पालने को एमआरआई बोर में स्लाइड करें, यह सुनिश्चित करें कि प्रेत को उसी स्थिति में रखा जाए जहां प्रेत रखा गया था।
- पशु मस्तिष्क के स्थान को देखने के लिए एक स्थानीयकरण करें और फिर तालिका 2 से एमआरआई सेटिंग्स का उपयोग करके पूरे मस्तिष्क को कवर करने वाला पोस्ट-कंट्रास्ट टी 1-भारित एमआरआई स्कैन करें।
- एमआरआई स्कैन को असंपीड़ित DICOM फ़ाइलों के एक सेट के रूप में निर्यात करें, प्रत्येक स्लाइस के लिए एक।
8. केंद्रित अल्ट्रासाउंड उपचार (चित्रा 4)।
- स्कैन के पूरा होने के बाद एमआरआई पालने से जानवर को निकालें और इसे प्लेटफॉर्म के पीछे बिस्तर के सामने के हिस्से में इसके संबंधित खूंटे में थक्का जमना, और बिस्तर के पीछे के हिस्से को इसके संबंधित खूंटे में थक्के लगाकर प्लेटफॉर्म पर रखें।
- एमआरआई बिस्तर की इनलेट ट्यूब को संज्ञाहरण के लिए आइसोफ्लुरेन के स्रोत से कनेक्ट करें और संज्ञाहरण के रखरखाव के लिए गैस प्रवाह दर को 1.0 एमएल / मिनट और वेपोराइज़र को 2.0% पर सेट करें। एनेस्थीसिया अवशोषण के लिए आउटलेट ट्यूब को चारकोल फिल्टर कनस्तर से कनेक्ट करें।
- DICOM फ़ाइलों के सेट को कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें और उन्हें वर्तमान अध्ययन की मुख्य कार्यशील निर्देशिका में एक फ़ोल्डर में रखें।
नोट: फ़ाइल आवश्यकताओं के लिए चरण 5.9 देखें। - सॉफ्टवेयर में, मुख्य प्रारंभिक पृष्ठ पर जाएं और निर्देशित फोकस फाइंडिंग पर क्लिक करके जोग मोड चालू करें और फिर जोग मोड ऑन पर क्लिक करें।
- जानवर के सिर पर सेंट्रीफ्यूज ्ड अल्ट्रासाउंड जेल का एक टुकड़ा रखें, जिसमें खोपड़ी के ऊपर पूरी खोपड़ी को कवर करने के लिए पर्याप्त जेल हो।
- डीआई और डिगैस्ड पानी को पानी के स्नान में 80% तक डालें, और फिर प्लेटफॉर्म पर अपने संबंधित स्तंभों पर पानी के स्नान को स्लॉट करें।
- डीआई पानी से भरे पानी के स्नान को तब तक कम करें जब तक कि नीचे की झिल्ली जानवर के सिर पर अल्ट्रासाउंड जेल को न छू ले, जिससे पानी और जेल के बीच एक युग्मन सतह बन जाए। सुनिश्चित करें कि अल्ट्रासाउंड जेल पानी के स्नान के लिए जानवर के पूरे सिर को कवर करता है और पानी के स्नान और माउस की खोपड़ी के बीच अल्ट्रासाउंड जेल में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
- अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर को पानी के स्नान में डुबोएं, यह सुनिश्चित करें कि ट्रांसड्यूसर की सतह पर कोई हवा के बुलबुले नहीं बन रहे हैं।
- जोग मोड का उपयोग करके ट्रांसड्यूसर बांह को आंशिक रूप से जलमग्न ट्रांसड्यूसर की ओर नीचे करें, और ट्रांसड्यूसर की सतह जलमग्न रहने के दौरान चुंबकीय स्लॉट को एक दूसरे के साथ संरेखित करके इसे ट्रांसड्यूसर से जोड़ दें।
- Jog मोड बंद करें, और फिर फ़ोकस्ड खोज से बाहर निकलें, जैसा कि प्रारंभिक चरण के दौरान किया गया था। पहले की तरह घर की स्थिति की पुष्टि करना सुनिश्चित करें।
- उपचार टैब पर जाएं, और फिर स्क्रीन के शीर्ष मध्य में फ़ोल्डर आइकन पर क्लिक करके पोस्ट-कंट्रास्ट टी 1-भारित एमआरआई फाइलें अपलोड करें। पहले कंप्यूटर पर अपलोड की गई DICOM फ़ाइलों वाले फ़ोल्डर का चयन करें और उन्हें खोलें। यह चरण स्वचालित रूप से शीर्ष दाएं पैनल में सभी DICOM फ़ाइलों को लोड करना चाहिए।
- इसके बाद, सोनिकेशन मोड टैब में, या तो बर्स्ट या कंटीन्यूअस वेव चुनकर उचित उपचार मोड का चयन करें। यदि बर्स्ट मोड पर है, तो सोनिकेशन सेटिंग्स टैब में, फटने की लंबाई, फटने की अवधि और अवधियों की संख्या दर्ज करें। ये पैरामीटर प्रत्येक सोनिकेशन स्थान के अनुरूप होंगे। यदि निरंतर तरंग मोड में हैं, तो केवल सोनिकेशन अवधि दर्ज करें।
नोट: इस अध्ययन में, 120 सेकंड की अवधि के लिए निरंतर तरंग मोड का उपयोग किया गया था। - पृष्ठ के शीर्ष मध्य में लक्ष्य आइकन पर क्लिक करें और सही एमआरआई स्लाइस पर उचित स्थानों का चयन करें जहां एफयूएस फोकल क्षेत्र को लक्षित किया जाना है। क्लिक करने पर लाल घेरे के साथ एक हल्का लाल वर्ग मौजूद होगा। एक से अधिक चयन चुने जा सकते हैं।
- एमआरआई छवि के बाईं ओर एक तालिका है, जो चयनित फोकल क्षेत्रों के 3 डी निर्देशांक के साथ पॉप्युलेट होगी। तालिका के अंतिम कॉलम में, प्रत्येक फोकल स्पॉट पर सोनिकेटेड होने के लिए पावर स्तर दर्ज करें, जिसे वांछित दबाव या तीव्रता स्तर प्राप्त करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक ट्रांसड्यूसर के लिए अलग से गणना की जा सकती है। पुष्टि करने के लिए तालिका में प्रत्येक फोकल स्पॉट पर क्लिक करें, जिसके परिणामस्वरूप निर्देशांक हाइलाइट किए जाएंगे, और छवि पर संबंधित फोकल क्षेत्र नीला हो जाएगा।
नोट: तालिका में दर्ज किए गए शक्ति स्तर को दबाव या तीव्रता में अनुवाद करने का तरीका निर्धारित करने के लिए ट्रांसड्यूसर डेटाशीट का संदर्भ लें, क्योंकि ये मान ट्रांसड्यूसर विशिष्ट हैं। - एक बार सभी फोकल क्षेत्रों से संतुष्ट होने के बाद, मोशन टेस्ट का चयन करें। यह सॉफ्टवेयर को ट्रांसड्यूसर को सभी फोकल स्पॉट पर स्थानांतरित करने के लिए प्रेरित करेगा ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि आंदोलन संभव हैं। पुष्टि के बाद, सॉफ्टवेयर मोशन टेस्ट पूरा होने का संकेत देगा। यदि कोई त्रुटि होती है, तो फोकल क्षेत्रों को समायोजित करें ताकि वे ट्रांसड्यूसर मोटर्स के 3 डी अक्षों के भीतर फिट हो सकें।
- एक बार तैयार होने के बाद, सोनिकेशन प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए स्टार्ट सोनिकेशन का चयन करें, ट्रांसड्यूसर को स्थानांतरित करें और चयनित प्रत्येक फोकल क्षेत्र पर सही एफयूएस पैरामीटर लागू करें।
- एक बार सोनिकेशन प्रोटोकॉल समाप्त हो जाने के बाद, ट्रांसड्यूसर आर्म से ट्रांसड्यूसर को अनकपल करें, प्लेटफॉर्म से पानी के स्नान को हटा दें, और जानवर की खोपड़ी से अल्ट्रासाउंड जेल को मिटा दें।
- काटने और कान की सलाखों को अनस्क्रू करें, एमआरआई बिस्तर से जानवर को हटा दें, और फिर जानवर को एक गर्म पैड पर रखें जब तक कि जानवर संज्ञाहरण से जाग न जाए। इस बिंदु पर, जानवर को उसके पिंजरे में वापस कर दें।
- बाद के जानवरों के लिए, अनुभाग 6 से शुरू होने वाले एक ही प्रोटोकॉल को दोहराएं।
- एक बार वांछित जानवरों का इलाज करने के बाद, जानवरों द्वारा स्पर्श की गई सभी सतहों को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें (सामग्री की तालिका देखें)।
- सॉफ़्टवेयर से बाहर निकलें, और फिर उपकरण के प्रत्येक टुकड़े को बंद और बंद करें।
9. उपचार के बाद के कदम
- उपचार के बाद 24 घंटे मापने वाले बायोल्यूमिनेसेंस के लिए अनुभाग 1 से विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) प्रोटोकॉल को दोहराएं। उपचार प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए, उपचारित और अनुपचारित दोनों समूहों के लिए विकास दर निर्धारित करने के लिए उपचार से पहले और बाद में बायोल्यूमिनेसेंस रिकॉर्डिंग की तुलना करें।
- चरण 6.4 से समान सेटिंग्स का उपयोग करके अनुवर्ती एमआरआई स्कैन करें। कंट्रास्ट-एन्हांस्ड स्कैन का उपयोग करके, ट्यूमर क्षेत्र की औसत ग्रेस्केल तीव्रता की तुलना करें या ट्यूमर की मात्रा में अंतर निर्धारित करने के लिए कंट्रास्ट एजेंट द्वारा कवर की गई कुल मात्रा की गणना करें।
Representative Results
एसडीटी 24 घंटे के बाद इलाज किए गए जानवरों में ट्यूमर का आकार कम हो जाता है।
एसडीटी उपचार के दिन, नियंत्रण और उपचार समूहों (एन = 4 प्रत्येक) के लिए मूल औसत बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल क्रमशः 2.0 x 10 6 ± 3.1 x 10 6 और 2.3 x 10 6 ± 1.3 x 10 6 p/s/cm2/sr था। दो समूहों के बीच उपचार से पहले ट्यूमर के आकार के अनुरूप औसत बायोल्यूमिनेसेंस मान सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण नहीं थे (पी = 0.89)। एसडीटी के बाद उपचार समूह का औसत बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल 3.57 x 10 6± 2.3 x 10 6 24 घंटे था, जबकि नियंत्रण समूह के बायोल्यूमिनेसेंट सिग्नल को 5.5 x 10 6 ± 8.2 x 10 6 p/s/cm 2/sr तक बढ़ा दिया गया था। जैसा कि चित्र 5 में दिखाया गया है, यह घातीय वृद्धि (पी = 0.08) मानते हुए क्रमशः 83.4% ± 78% और 172% ± 34% की वृद्धि दर से मेल खाती है। चार उपचारित जानवरों में से, तीन में नियंत्रण की तुलना में उपचार के बाद कम वृद्धि दर थी। उपचार समूह में एक आउटलायर था जिसने विचलन को कम करते हुए नियंत्रण के लिए तुलनीय वृद्धि दिखाई।
इसके अतिरिक्त, जानवरों को ट्यूमर के पूर्व और बाद के उपचार की तुलना के लिए उपचार के अगले दिन बाद कंट्रास्ट-एन्हांस्ड एमआर इमेजिंग से गुजरना पड़ा। ट्यूमर में कंट्रास्ट एजेंट की औसत ग्रेस्केल तीव्रता प्रत्येक जानवर के लिए प्रत्येक एमआरआई स्लाइस में आयोजित की गई थी ताकि यह मापा जा सके कि ट्यूमर के आकार के अनुमान के रूप में उपचार के बाद ट्यूमर में कितना कंट्रास्ट एजेंट प्रवेश कर रहा था। पूर्व-उपचार, नियंत्रण और उपचारित समूहों के बीच औसत ट्यूमर ग्रेस्केल तीव्रता समान थी। औसतन, यह ग्रेस्केल तीव्रता नियंत्रण समूह में उपचारित समूहों की तुलना में एक बड़े परिमाण में बढ़ गई, हालांकि यह महत्वपूर्ण नहीं था (पी = 0.47)। यह डेटा तालिका 2 में देखा जा सकता है। इन परिणामों की उच्च परिवर्तनशीलता संभावित रूप से इस तथ्य के कारण है कि एमआरआई केवल 24 घंटे के बाद उपचार के बाद लिया गया था, जिस समय एसडीटी की चिकित्सीय क्षमता केवल होने लगी है। फिर भी, चित्रा 6 एसडीटी द्वारा बनाए गए घावों का एक उदाहरण दिखाता है।
चित्र 1: एफयूएस सिस्टम सेटअप। (शीर्ष) लेबल घटकों के साथ MRGFUS सिस्टम। (सामने) 1. मंच। 2. एक्सिस मोटराइज्ड ट्रांसड्यूसर आर्म। 3. एफयूएस ट्रांसड्यूसर। 4. पानी स्नान। 5. एमआरआई बेड। 6. मॉनिटर। 7. ट्रांसड्यूसर प्रतिबाधा मिलान बॉक्स। 8. पावर एम्पलीफायर बॉक्स। 9. फ़ंक्शन जनरेटर। 10. फ़ंक्शन जनरेटर चैनल 1 बीएनसी पोर्ट। 11. डेस्कटॉप कंप्यूटर. (नीचे) निम्नलिखित कनेक्शन के साथ रंग-कोडित वायरिंग योजनाबद्ध के साथ MRGFUS प्रणाली। (वापस) 1. पावर डोरियां। 2. डेस्कटॉप एचडीएमआई के लिए एचडीएमआई की निगरानी करें। 3. पोर्ट बी यूएसबी बी से डेस्कटॉप यूएसबी ए। ऑसिलोस्कोप लैन ईथरनेट से डेस्कटॉप ईथरनेट तक। 5. डेस्कटॉप ईथरनेट के लिए गति इंटरफ़ेस ईथरनेट। 6. ऑसिलोस्कोप बीएनसी से एडब्ल्यूजी इनपुट बीएनसी के अंदर / बाहर है। 7. ऑसिलोस्कोप चैनल 1 (सामने) बीएनसी से सिंक बीएनसी। 8. बॉक्स आउटपुट बीएनसी से आरएफ इनपुट समाक्षीय। 9. आरएफ आउटपुट समाक्षीय से मिलान बॉक्स समाक्षीय। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: फैंटम पंजीकरण। (ए) फैंटम पंजीकरण के दौरान सिस्टम सेटअप और सॉफ्टवेयर। (बी) फैंटम पंजीकरण स्क्रीन का स्क्रीनशॉट, जहां लाल सर्कल अक्षीय क्रॉस सेक्शन की चयनित परिधि है। (सी) एमआरआई बेड पर रखा गया फैंटम, शीर्ष दृश्य। (D) प्रेत का साइड व्यू, जहां लाल रेखा C में वृत्त के अनुरूप अक्षीय स्लाइस में है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: पशु प्लेसमेंट। (ए) एमआरआई बिस्तर और पालना, विभिन्न भागों के लेबल के साथ: 1. एमआरआई पालना। 2. स्टीरियोटैक्टिक एमआरआई बेड। 3. कान सलाखों. 4. काटने की पट्टी। 5. नाक शंकु। 6. एमआरआई बेड पेग होल। 7. आइसोफ्लूरेन एनेस्थीसिया ट्यूब। (बी) आरएफ कॉइल (नारंगी) के साथ एमआरआई बेड पर माउस के प्लेसमेंट और पालने पर प्लेसमेंट का प्रतिनिधित्व करने वाला चित्रण (बायोरेंडर 2022 टेम्पलेट का उपयोग करके संशोधित चित्रण)। (सी) एफयूएस उपचार के दौरान एमआरआई बिस्तर पर माउस के प्लेसमेंट का प्रतिनिधित्व करने वाला चित्रण (बायोरेंडर 2022 टेम्पलेट का उपयोग करके संशोधित चित्रण)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: फोकल बिंदु चयन। एक एकल जानवर में एक सोनिकेशन बिंदु चयन का उदाहरण। प्रत्येक कॉलम एक टी 1-भारित पोस्ट-कंट्रास्ट एमआरआई स्लाइस का प्रतिनिधित्व करता है जहां प्रत्येक टुकड़ा समीपस्थ (स्लाइस 1) से डिस्टल (स्लाइस 5) दिशा में 0.5 मिमी है। ट्यूमर सीमा को मैन्युअल रूप से खंडित किया गया था और इसे लाल (पंक्ति 1) में रेखांकित किया गया है, और संबंधित सोनिकेशन स्थानों (पंक्ति 2) को हल्के हरे रंग के वर्ग (फोकल मैक्स केंद्र) और नीले सर्कल (आधा अधिकतम फोकल परिधि) द्वारा दर्शाया गया है। प्रत्येक स्थान को 2 मिनट के लिए सोनिक किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 5: एसडीटी के बाद विकास दर। मापा ल्यूमिनेसेंस के आधार पर इंट्राक्रैनील एम 59 ट्यूमर के साथ इलाज और अनुपचारित (नियंत्रण) जानवरों में पूर्व से 24 घंटे के पोस्ट-एसडीटी उपचार से जीबीएम ट्यूमर की वृद्धि दर। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन इंगित करती हैं. महत्व निर्धारित करने के लिए दो-नमूना छात्र का टी-टेस्ट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: एसडीटी उत्पन्न घाव। प्री-और पोस्ट-कंट्रास्ट एक पशु मॉडल से टी 1-भारित एमआरआई स्कैन को बढ़ाते हैं जिसमें एसडीटी द्वारा बनाए गए ट्यूमर में घाव दिखाने वाला एक प्रतिनिधि अक्षीय टुकड़ा होता है। (बाएं) एसडीटी उपचार से पहले एमआरआई स्कैन लिया जाता है, जिसमें ट्यूमर लाल रंग में उल्लिखित होता है। (मध्य) एफयूएस फोकल पॉइंट चयन जहां अधिकतम दबाव को हल्के नीले घेरे द्वारा दर्शाया जाता है और आधे-अधिकतम दबाव क्षेत्रों को नीले घेरे द्वारा दर्शाया जाता है। (दाएं) पोस्ट-एसडीटी एमआरआई स्कैन, जहां ट्यूमर को लाल रंग में रेखांकित किया गया है। एसडीटी-निर्मित घाव और आरोपण के लिए सिरिंज छेद दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अनुक्रम | T1 |
| पुनरावृत्ति समय | 3000 एमएस |
| प्रतिध्वनि समय | 30 ms |
| स्लाइस मोटाई | 0.5 मिमी |
| स्लाइस की संख्या | 25 |
| पिक्सेल स्पेसिंग | 0.187 मिमी x 0.187 मिमी |
| अधिग्रहण मैट्रिक्स | 133 x 133 |
| औसत | 4 |
तालिका 1: एमआरआई सेटिंग्स।
| नियंत्रण | एसडीटी समूह | पी-वैल्यू | |
| पूर्व उपचार | 7.49 x 10 3 ± 2.2 x 103 | 7.48 x 10 3 ± 1 x 103 | 0.99 |
| उपचार के बाद | 8.79 x 103 ± 7.7 x 102 | 7.95 x 10 3± 1.1 x 103 | 0.33 |
| प्रतिशत का अंतर | 16% ± 16% | 7% ± 12% | 0.47 |
तालिका 2: पोस्ट-कंट्रास्ट ने टी 1-भारित एमआरआई ग्रेस्केल को बढ़ाया।
Discussion
जीबीएम वाले रोगियों के लिए नए चिकित्सीय और प्रभावोत्पादक उपचार विकल्प आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल ने जीबीएम के लिए एक प्रीक्लिनिकल एफयूएस-मध्यस्थता उपचार को रेखांकित किया है जो वर्तमान में नैदानिक अनुवाद के लिए व्यापक जांच से गुजर रहा है। हालांकि एसडीटी में रोमांचक क्षमता है, फिर भी प्रीक्लिनिकल सेटिंग में समझने और अनुकूलित करने के लिए बहुत कुछ है।
इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण घटकों में से एक अधिकतम प्रभावकारिता के लिए ट्यूमर को लक्षित करने के लिए एमआर-निर्देशित एफयूएस का उपयोग कर रहा है। एक प्रेत का उपयोग करके, एक 3 डी समन्वय स्थान बनाया जा सकता है, जहां अक्षीय एमआरआई स्लाइस के प्रत्येक पिक्सेल को एक समन्वय सौंपा जा सकता है। फिर, एमआर छवि पर सोनिकेशन स्थान का चयन करने की एक सरल प्रक्रिया ट्रांसड्यूसर को सूचित करती है कि कहां लक्ष्य करना है। उपयोग की जाने वाली प्रीक्लिनिकल एफयूएस प्रणाली अत्यधिक बहुमुखी है और तब लागू होती है जब ट्यूमर जैसे विशिष्ट विकृति के स्थानों को लक्षित करने की आवश्यकता होती है, जिसमें गहरे बैठे ट्यूमर शामिल होते हैं जो इमेजिंग पुष्टि के बिना लक्षित करना मुश्किल होगा। कंट्रास्ट एजेंट के रूप में गैडोलिनियम का उपयोग करके, ट्यूमर का स्पष्ट विज़ुअलाइज़ेशन होता है, जिससे उपयोगकर्ता को लक्ष्य चुनते समय सूचित निर्णय लेने की अनुमति मिलती है। कई अन्य उपचारों पर एसडीटी का लाभ यह है कि यह एक ट्यूमर-विशिष्ट चिकित्सा है। कम तीव्रता वाले एफयूएस को केवल ट्यूमर ऊतक को लक्षित करना चाहिए, जबकि स्वस्थ मस्तिष्क पैरेन्काइमा को अपेक्षाकृतअछूता छोड़ना चाहिए 3,8.
इस प्रयोग के परिणाम इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि इस प्रोटोकॉल के फायदे चिकित्सीय परिणामों को कैसे जन्म दे सकते हैं जो एसडीटी के लिए साहित्य में अन्य निष्कर्षों के समान हैं। चित्रा 5 से पता चलता है कि उपचार के दिन के बाद 24 घंटे के भीतर, इलाज किए गए समूह में ट्यूमर के विकास की मंदी थी। हालांकि इस छोटे नमूने के आकार का उपयोग करके महत्वहीन, महत्व जानवरों की एक बड़ी संख्या के साथ हो सकता है। ट्यूमर के विकास में यह देरी वू एट अल (2019) द्वारा इस विषय पर अग्रणी पेपर में दिखाए गए के समान है, जिसने इलाज किए गए जानवरों में समय के साथ ट्यूमर के विकास को धीमा कर दिया, साथ ही जीवित रहने के समयमें वृद्धि की।
इस प्रोटोकॉल को डिजाइन करते समय किए गए विचारों में पशु तनाव, ट्यूमर प्रकार और सोनोसेंसिटाइजिंग एजेंट चयन शामिल थे। कई कारणों से इस प्रोटोकॉल के लिए एथिमिक नग्न चूहों को चुना गया था। सबसे पहले, नग्न माउस को सोनिकेट करना आसान है क्योंकि बालों की कमी किसी भी क्षीणन को रोकती है। इसके अलावा, एक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) के आरोपण की अनुमति देती है ताकि ट्यूमर मॉडल नैदानिक स्थिति से अधिक निकटता से मिलता-जुलता हो। एक एथिमिक मॉडल का उपयोग करने का नकारात्मक पक्ष यह है कि प्रतिरक्षा प्रणाली की विशेषता नहीं हो सकती है, इसलिएइन अध्ययनों में किसी भी एसडीटी-जनित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को मापा नहीं जाएगा। चुनी गई ट्यूमर लाइन एक आक्रामक और तेजी से बढ़ती पीडीएक्स लाइन है। उपचार का समय बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि ट्यूमर की स्थापना को सत्यापित किया जाना चाहिए, लेकिन ट्यूमर का बोझ कपाल गोलार्ध को नहीं भरना चाहिए। प्रीक्लिनिकल प्रयोग के लिए एक बेहतर आकार के ट्यूमर को प्राप्त करने के लिए विभिन्न सेल लाइनों को अलग-अलग इनक्यूबेशन समय की आवश्यकता होती है। इस प्रोटोकॉल में, जीबीएम ट्यूमर में इसके अधिमान्य उत्थान के कारण 5-एएलए का उपयोग सोनोसेंसिटाइज़र के रूप में किया गया था, जिसे पिछले प्रयोगों (अप्रकाशित डेटा) में इस सेल लाइन के लिए विट्रो में पुष्टि की गई है। प्रभावकारिता और सुरक्षा के लिए सबसे उपयुक्त यौगिक को निर्धारित करने के लिए अन्य सोनोसेंसिटाइज़र को प्रतिस्थापित और परीक्षण किया जा सकता है। अंत में, 5-एएलए इंजेक्शन के 3 घंटे बाद उपचार शुरू किया गया था, क्योंकि पिछले साहित्य से पता चला है कि यह उस इंजेक्शन खुराक5 के साथ इष्टतम समय है।
इस प्रोटोकॉल में चुने गए एफयूएस पैरामीटर (प्रत्येक लक्ष्य स्थान पर 515 kHz पर 2 मिनट के लिए 10 W / cm2) पिछले साहित्य और प्रारंभिक प्रयोगों 4,9 की समीक्षा के आधार पर तय किए गए थे। पूरे ट्यूमर में आरओएस प्रभाव उत्पन्न करने के लिए पूरे ट्यूमर को कवर करने वाले सोनिकेशन बिंदुओं का एक ग्रिड चुना गया था। यहां उपयोग की जाने वाली तीव्रता अन्य प्रकाशनों की तुलना में अधिक है, लेकिन थोड़े समय की अवधि में, इससे किसी भी प्रतिकूल तापमान से संबंधित प्रभाव होने की उम्मीद नहीं है, क्योंकि 25 डब्ल्यू / सेमी2 तक की तीव्रता का उपयोग माउस मॉडल में महत्वपूर्ण दुष्प्रभावों के बिना सफलतापूर्वक किया गयाहै। महत्वपूर्ण रूप से, साहित्य में एफयूएस मापदंडों का कोई मानकीकृत या अनुकूलित सेट प्रकाशित नहीं किया गया है। इसलिए, यहां बताए गए विशिष्ट मूल्यों को मापदंडों के इष्टतम सेट को निर्धारित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है, जिससे सुरक्षा बनाए रखते हुए ट्यूमर ऊतक की अधिकतम कमी हो सकती है। इसके अतिरिक्त, चूंकि विभिन्न सेल लाइनों में वैस्कुलराइजेशन और हाइपोक्सिया के अलग-अलग स्तर होते हैं, इसलिए इस उपचार को समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। हमने एसडीटी उपचार के 24 घंटे के भीतर समग्र रूप से कम ट्यूमर वृद्धि (चित्रा 5) दिखाया है, हालांकि मापदंडों को अनुकूलित करने की आवश्यकता है और इस उपचार के अधिकतम प्रभाव को निर्धारित करने के लिए अधिक जानवरों का परीक्षण करने की आवश्यकता है। पोस्ट-ट्रीटमेंट एमआरआई स्कैन स्वस्थ ऊतक में एफयूएस उपचार द्वारा बनाए गए घावों की कोई उपस्थिति नहीं दिखाते हैं, ट्यूमर ऊतक के लिए स्थानीयकृत प्रभाव के साथ (चित्रा 6)। एसडीटी को अन्य एफयूएस तकनीकों के साथ संयोजित करने का अवसर भी है, जैसे कि ट्यूमर12 में 5-एएलए अपटेक को अधिकतम करने के लिए रक्त-मस्तिष्क बाधा को क्षणिक रूप से स्थिर करना। संरचनात्मक स्तर पर सुरक्षा और प्रभावकारिता की जांच के लिए विभिन्न हिस्टोलॉजी तकनीकों का प्रदर्शन करके इस प्रोटोकॉल को आगे पूरक किया जा सकता है। संरचनात्मक या ट्यूमर क्षतिकी जांच के लिए एक हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग किया जा सकता है, जबकि सेलुलर एपोप्टोसिस14 की जांच के लिए एक टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लिओटिडिल ट्रांसफेरेज ड्यूटीपी निक एंड लेबलिंग (ट्यूनल) दाग किया जा सकता है। भले ही, यह प्रोटोकॉल एक सुरक्षित और ट्यूमर-विशिष्ट उपचार प्रस्तुत करता है जहां उपचार के 24 घंटे बाद भी परिवर्तन ध्यान देने योग्य होते हैं, जो एसडीटी और अनुपचारित ट्यूमर के साथ इलाज किए गए ट्यूमर की वृद्धि दर की तुलना करके स्पष्ट है, साथ ही सोनिकेशन से पहले और बाद में ट्यूमर स्लाइस की तुलना भी करता है।
किसी भी प्रोटोकॉल के साथ, हमेशा नुकसान या सीमाएं होती हैं जिन्हें तौलने की आवश्यकता होती है। वर्तमान प्रोटोकॉल की मुख्य सीमा समय और व्यय है। इस बीच, इस प्रोटोकॉल के फायदों में से एक इसका स्वचालित केंद्रित उद्देश्य है। इस केंद्रित प्रक्रिया को पूरा करने के लिए, प्रत्येक व्यक्तिगत जानवर के लिए एमआरआई स्कैन लेने की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ट्यूमर का लक्ष्यीकरण सही है, एक प्रक्रिया जो समय लेने वाली और महंगी दोनों हो सकती है। इसके अतिरिक्त, वांछित फोकल स्पॉट की संख्या के आधार पर, इस प्रोटोकॉल को करने का समय केवल कुछ जानवरों के लिए भी घंटों हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप कम प्रयोगात्मक पशु संख्या हो सकती है। इन कमियों के बावजूद, ओपन सर्जरी विकल्पों की तुलना में यह लक्षित नॉनइनवेसिव प्रोटोकॉल एक व्यवहार्य प्राथमिकता बनी हुई है।
निष्कर्ष में, इस प्रोटोकॉल ने प्रीक्लिनिकल माउस मॉडल में स्वस्थ तंत्रिका ऊतक को बनाए रखते हुए उपचार के 24 घंटे के भीतर मस्तिष्क में ट्यूमर के विकास को कम करने के लिए एसडीटी उपचार की क्षमता दिखाई। एसडीटी की प्रभावशीलता का अध्ययन और आरओएस उत्पादन बढ़ाने के लिए विभिन्न मापदंडों को अनुकूलित करना इस उपचार को चिकित्सकीय रूप से उपयुक्त बनाने के लिए आवश्यक है। एक गैर-आक्रामक चिकित्सीय मॉडल के रूप में एसडीटी के उपयोग के लिए नए रास्ते खोजे जाने चाहिए।
Disclosures
लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे संभावित हितों के टकराव के रूप में माना जा सकता है। अमीर मनबाची बीके मेडिकल (जीई हेल्थकेयर), न्यूरोसोनिक्स मेडिकल के लिए पढ़ाते हैं और परामर्श करते हैं, और कई पेटेंट-लंबित एफयूएस प्रौद्योगिकियों पर एक आविष्कारक हैं। बेट्टी टायलर के पास एनआईएच से अनुसंधान वित्त पोषण है और वह एक्सीलिंग कॉम्बिनेशन थेरेपी * के सह-मालिक हैं। अश्वत्था थेरेप्यूटिक्स इंक ने अपने पेटेंट में से एक को भी लाइसेंस दिया है, और वह पीबॉडी फार्मास्यूटिकल्स (* इक्विटी या विकल्प शामिल हैं) के लिए एक स्टॉकहोल्डर है।
Acknowledgments
लेखकों ने नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) नेशनल सेंटर फॉर एडवांस्ड ट्रांसलेशनल साइंसेज (एनसीएटीएस) द्वारा प्रशासित एएसएमई डिफेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी (डीएआरपीए) अवार्ड (#: N660012024075) और जॉन्स हॉपकिंस इंस्टीट्यूट फॉर क्लिनिकल एंड ट्रांसलेशनल रिसर्च (आईसीटीआर) क्लिनिकल रिसर्च स्कॉलर्स प्रोग्राम (केएल 2) द्वारा नेशनल साइंस फाउंडेशन (एनएसएफ) एसटीटीआर चरण 1 पुरस्कार (#: 1938939) से धन सहायता स्वीकार की है। कोशिकाओं को मेयो फाउंडेशन फॉर मेडिकल एजुकेशन एंड रिसर्च द्वारा खरीदा और प्रदान किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| 1 mL Syringes | BD | 309597 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton Company | 49AL65 | |
| 10 µL Pipette tips | USAScientific | ||
| 1000 mL Flask | Corning | MP-34514-25 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | CLS430791 | |
| 200 Proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | Falcon | 357543 | |
| 50 mL Conical tubes | Corning | 430290 | |
| 500 mL filter | Corning | 431097 | |
| 5-Aminolevulinic acid hydrochloride | Research Products International | A11250 | |
| 7T PET-MR system | Bruker | Biospec 70/30 | |
| Aluminum foil | Reynolds Brand | ||
| Amplifier | FUS Instruments | 2175 | |
| Athymic nude mice | Charles River Laboratories | Strain Code 490 | |
| Bone drill | Foredom | HP4-917 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004261 | |
| Charcoal isoflourane waste container | Patterson scientific | 78909457 | |
| Computer | FUS Instruments | 2269 | |
| Cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
| Desktop monitor | ASUS | VZ239H | |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology | LUCK-1G | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | |
| Electronic shaver | Wahl | 93235-002 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Formalin | Thermo Fisher Scientific | SF100-20 | |
| Function generator | Siglent | QS0201X-E01B | |
| Gadolinium contrast agent (Gadavist) | McKesson Corporation | 2068062 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| Heat lamp | |||
| Heat pad | Kent Scientific | RT-0501 | |
| Hemocytometer | Electron Microscopy Sciences | 63514-12 | |
| Induction chamber | Patterson scientific | 78933388 | |
| Isofluorane vaporizer | Patterson scientific | 78916954 | |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| Isoflurane system | Patterson Scientific | 78935903 | |
| IVIS spectrum | Perkin Elmer | 124262 | |
| Lightfield microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Nair | Church and Dwight Co. | 42010553 | |
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| P-20 pippette | Rainin | 17008650 | |
| Patient derived xenographs | Mayo Clinic | M59 | |
| Penicillin/Streptomyosin | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | 70-011-069 | |
| Pippetter | Drummond | 4-000-101 | |
| Povidone-iodine | Covetrus | PI050CV | |
| RK-50 MRgFUS system | FUS Instruments | 2182 | |
| Scale | |||
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Screwdriver set | Jakemy | JM-8160 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Stereotactic MRI prototype plastic imaging fixture | FUS Instruments | ||
| T-25 culture flask | Corning | 430641U | |
| Transducer and matching box | FUS Instruments | T515H750-118 | |
| Ultrasonic degasser | FUS Instruments | 2259 | |
| Ultrasound gel | ParkerLabs | 01-08 | |
| Water bath | FUS Instruments | ||
| Xylazine | Covetrus | 1XYL006 |
References
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