Name: Une In vitro Essai FluoroBlok invasion tumorale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Apprenez à mesurer l'invasion tumorale in vitro avec l'essai FluoroBlok. Cette méthode par fluorescence évalue la migration cellulaire à travers une membrane de Matrigel pour la recherche sur le cancer.

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Post-étiquetage et de mesure en utilisant BD calcéine AM colorant fluorescent Les cellules sont marquées pour la quantification, après qu&#39;ils ont envahi par la Matrice BD Matrigel et passé à travers la membrane BD FluoroBlok. En conséquence, la mesure ne critère d&#39;invasion de cellules peuvent être obtenues. <ol><li> Cultiver des cellules à confluence ~ 80%. </li><li> Préparer et réhydrater le système d&#39;insertion. <ol style="list-style-type:lower-alpha;"><li> Retirez le paquet de -20 ° C pour le stockage et lui permettre de venir à la température ambiante. </li><li> Ouvrez la papillote et ajouter 500 ul chaude (37 ° C) des médias à l&#39;intérieur du puits d&#39;insertion. Laisser la plaque pour se réhydrater pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Remarque: Il n&#39;est pas nécessaire pour réhydrater le non couchés BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Système Insérez qui sera utilisé comme un contrôle de la migration cellulaire. </li><li> Après réhydratation, retirez soigneusement le support de l&#39;insertion des puits sans déranger la couche de BD Matrigel Matrice sur la membrane. Le système est maintenant prêt à utiliser. </li></ol></li><li> Préparer les suspensions de cellules par trypsinisation monocouches de cellules et de remise en suspension des cellules dans du DMEM sans sérum à 5 x 10 4 cellules / mL. Remarque: Si vous utilisez un type cellulaire différent, vous devez déterminer la densité de semis optimale. Pour déterminer la densité de semis optimale pour votre type de cellules sur une surface poreuse de croissance, utiliser une gamme de densités de semis (cellules / cm 2) que les crochets de la densité d&#39;ensemencement utilisé sur les surfaces non poreuses (c. flacons, plats et assiettes). Par exemple, si vous avez actuellement semences à 2,5 x 10 5 cellules / cm 2, de semences à des concentrations de cellules différentes entre 5 x 10 4 et 5 x 10 5 cellules / cm 2 pour déterminer la densité de semis optimale initiale. </li><li> Ajouter 500 ul de suspension cellulaire (2,5 x 10 4 cellules) dans les chambres à apicale. </li><li> Ajouter 750 ul de chimiotactique (5% de FBS dans DMEM) pour chacune des chambres basal, en utilisant les ports de l&#39;échantillon pour l&#39;accès. </li><li> Incuber la BD BioCoat tumeur du système invasion et la non couchés BD Falcon FluoroBlok 24 Multiwell Plate Insertion pour les 20-22 heures à 37 ° C, 5% de CO 2 atmosphérique. </li><li> Après l&#39;incubation, retirer soigneusement moyenne des chambres apicale. Ceci peut être accompli en feuilletant le contenu dans un conteneur à déchets. Ne touchez pas la surface du fond du système d&#39;insertion. </li><li> Transférer le système de l&#39;insérer dans une seconde plaque de 24 puits contenant 500 ul / puits de 4 pg / mL calcéine AM dans HBSS. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C, 5% de CO 2. La solution calcéine AM n&#39;est pas retiré de la chambre basse avant de lire la fluorescence car il est un colorant non fluorescent vitale qui est converti en calcéine fluorescente verte par les estérases cytosoliques. </li><li> Fluorescence des cellules envahies est lu à 494/517 nm longueur d&#39;onde de (Ex / Em) sur un lecteur de bas en lisant la plaque fluorescente. Le réglage du gain peut être nécessaire de déterminer de façon empirique, mais un gain médian devrait être un point de départ suffisant. Un réglage de gain qui est trop élevée peut conduire à une saturation du détecteur avec un échantillon très fluorescentes, ce qui peut empêcher l&#39;acquisition de résultats significatifs. L&#39;utilisation de autogain (si supporté par votre lecteur) n&#39;est pas recommandée. Un microscope inversé à fluorescence peut être utilisée pour vérifier vos résultats, il est particulièrement utile pour ce faire, la première fois que vous exécutez ce test. Note: Il est primordial que les systèmes d&#39;insertion sont lues à l&#39;aide de la carte de la plaque correct. Pour plus d&#39;informations sur les cartes plateau de chargement vois BD Bulletin technique n ° 436 sur www.bdbiosciences.com ou contactez BD Support technique (labware@bd.com). Une bonne orientation de plaque est avec le puits A1 dans le coin supérieur gauche et le logo BD Flacon orientée vers la droite comme la plaque est insérée dans le lecteur. </li></ol> Réduction des données Les données sont exprimées comme dans l&#39;équation suivante: <img src="/files/ftp_upload/1475/1475eqa.jpg" alt="Équation" /> Contexte peut être soustraite avant le calcul de l&#39;invasion des cellules pour cent RFU = unités relatives fluorescentes.

<ol><li>Sethi, G., Ahn, K. S., Pandey, M. K., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celastrol%2C+a+novel+triterpene%2C+potentiates+TNF-induced+apoptosis+and+suppresses+invasion+of+tumor+cells+by+inhibiting+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+TAK1-mediated+NF-%CE%9AB+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Celastrol, a novel triterpene, potentiates TNF-induced apoptosis and suppresses invasion of tumor cells by inhibiting NF-κB-regulated gene products and TAK1-mediated NF-ΚB activation.</a> Blood. 109, 2727-2735 (2007).</li>
<li>Takada, Y., Kobayashi, Y., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evodiamine+Aboloishes+Constitutive+and+Inducible+NF-%CE%BAB+Activation+by+Inhibiting+I%CE%BAB%CE%B1+Kinase+Activation%2C+Thereby+Suppressing+NF-%CE%BAB-regulated+Antiapoptotic+and+Metastatic+Gene+Expression%2C+Up-regulating+Apoptosis%2C+and+Inhibiting+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Evodiamine Aboloishes Constitutive and Inducible NF-κB Activation by Inhibiting IκBα Kinase Activation, Thereby Suppressing NF-κB-regulated Antiapoptotic and Metastatic Gene Expression, Up-regulating Apoptosis, and Inhibiting Invasion.</a> J. Biol. Chem. 280, 17203-17212 (2005).</li>
<li>Harikumar, K. B., Kunnumakkara, A. B., Ahn, K. S., Anand, P., Krishnan, S., Guha, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+cysteini+residues+in+I%CE%BAB%CE%B1+kinase+and+NF-%CE%BAB+%28p65%29+by+xanthohumol+leads+to+suppression+of+NF-%CE%BAB-regulated+gene+products+and+potentiation+of+apoptosis+in+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Modification of the cysteini residues in IκBα kinase and NF-κB (p65) by xanthohumol leads to suppression of NF-κB-regulated gene products and potentiation of apoptosis in leukemia cells.</a> Blood. , 113-2003 (2009).</li>
<li>Nair, A. S., Sishodia, S., Ahn, K. S., Kunnumakkara, A. B., Sethi, G., Aggarwal, B. B. D. eguelin <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((an+Akt+Inhibitor%2C+Suppresses+I%CE%9AB%CE%B1+Kinase+Activation+Leading+to+Suppression+of+NF-%CE%BAB-Regulated+Gene+Expression%2C+Potentiation+of+Apoptosis%2C+and+Inhibition+of+Cellular+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">an Akt Inhibitor, Suppresses IΚBα Kinase Activation Leading to Suppression of NF-κB-Regulated Gene Expression, Potentiation of Apoptosis, and Inhibition of Cellular Invasion.</a> J. Immunol. , 177-5612 (2006).</li>
<li>Partridge, J., Qian, S. Quantitative and High-Throughput Screening of Tumor Cell Invasion using a Cell-based Model. Society for Biomolecular Screening 2005 Conference. 2005 Sept 11-15, Geneva, Switzerland, , (2005).</li>
<li>An Improved In Vitro Device For Measuring Cell Invasion and Method for its Formation. US patent. , 6,740,501,B2 (2004).</li>
<li>Flaherty, P., Goldberger, A., Dery, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Fluorescent+Cell+Labeling+on+Tumor+Invasion+and+Screening+of+Anti-Metastatic+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Mole.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of Fluorescent Cell Labeling on Tumor Invasion and Screening of Anti-Metastatic Compounds.</a> Mole. Biol. Cell. 12, 46a-46a (2001).</li>
<li>Flaherty, P., Mannuzza, F., Ilsley, S., Maliakal, J., Wu, M. Screening of Anti-Metastatic Compounds by a Fluorescence Based Tumor Invasion Assay. Screentech 2001 Conference. 2005 Mar 12-16, San Diego, CA, , (2005).</li>
<li>Mannuzza, F., Flaherty, P., Wu, M., Ilsley, S. Development of a Quantitative, High-Throughput Assay System for the Discovery of Anti-Cancer Drugs. Proceedings of the Society for Biomolecular Screening. 1999 Sept 13-16, Edinburgh, SC, UK, , (1999).</li>
</ol>

Les auteurs sont des employés de BD Biosciences, qui produit des réactifs et des outils utilisés dans cet article.

<table><tbody><tr><td>Système de détection de l'invasion tumorale BD BioCoat</td><td>BD Biosciences</td><td>354165 ou 354166</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HT-1080 et NIH/3T3</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milieu de culture de Dulbecco&amp;rsquo;s modifié par Eagle (DMEM ; sans sérum)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco&amp;rsquo;s, sans calcium ni magnésium (DPBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d'inserts multipuits BD Falcon FluoroBlok 24 à utiliser comme contrôle de migration cellulaire</td><td>BD Biosciences</td><td>351157 ou 351158</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal à 5 % dans le DMEM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colorant fluorescent BD Calcein AM</td><td>BD Biosciences</td><td>354216 ou 354217</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hanks&amp;rsquo; (HBSS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plaques BD Falcon 24 puits pour l'étiquetage post-invasion cellulaire</td><td>BD Biosciences</td><td>351147</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques à fluorescence avec fonction de lecture par le fond</td><td>PerkinElmer EnVision (R), TECAN Infinite (R), Molecular Devices SpectraMax (R), BioTek Synergy (TM), BMG LABTECH PHERAstar.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

une in vitro essai fluoroblok invasion tumorale

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

La caractéristique des cellules métastatiques est leur capacité à envahir travers la membrane basale et migrent vers d&#39;autres parties du corps. Les cellules doivent être en mesure de deux protéases sécrètent qui décomposent la membrane basale ainsi que la migration afin d&#39;être envahissantes. BD BioCoat système fournit l&#39;invasion tumorale des cellules avec des conditions qui permettent l&#39;évaluation de leur propriété invasives<em&gt; In vitro</em<sup&gt; 1,2</sup&gt;. Il se compose d&#39;un FluoroBlok BD Falcon 24 Multiwell Plate Insertion avec une membrane 8,0 micron pores PET qui a été uniformément revêtu de BD Matrigel Matrix. Cette couche uniforme de BD Matrigel matrice sert de membrane basale reconstituée<em&gt; In vitro</em&gt; Offrir une véritable barrière à la non-invasif des cellules tout en présentant une structure de protéine appropriée pour étudier l&#39;invasion. Le procédé de revêtement obstrue les pores de la membrane, bloquant non-invasif des cellules de migrer à travers la membrane. En revanche, les cellules invasives sont capables de se détacher de et migrent à travers la membrane revêtue. La quantification de l&#39;invasion des cellules peut être réalisée soit par l&#39;étiquetage pré-ou post-invasion de la cellule avec un colorant fluorescent tel que dIIC<sub&gt; 12</sub&gt; (3) ou calcéine AM, respectivement, et en mesurant la fluorescence des cellules envahissant. Depuis la membrane BD FluoroBlok bloque efficacement le passage de la lumière de 490 à 700 nm avec une efficacité&gt; 99%, marqués à la fluorescence des cellules qui n&#39;ont pas envahi ne sont pas détectés par un lecteur en bas de lecture de plaques de fluorescence. Cependant, les cellules qui ont envahi le dessous de la membrane ne sont plus à l&#39;abri de la source lumineuse et sont détectés avec le lecteur de plaque respectifs. Cette vidéo montre un test d&#39;invasion critère cellule, en utilisant calcéine AM pour détecter les cellules envahies.

Cette vidéo montre comment mesurer l&#39;invasion des cellules par le biais inserts de culture cellulaire en utilisant une méthodologie basée sur la fluorescence.

Une In vitro Essai FluoroBlok invasion tumorale

La caractéristique principale des cellules métastatiques est leur capacité à envahir la membrane basale et à migrer vers d'autres parties de l'organisme. Les cellules doivent être capables de...

L'invasion cellulaire est une étape importante de la progression du cancer et de l'angiogenèse. Les tests d'invasion in vitro évaluent généralement la capacité des cellules à dégrader une membrane basale reconstituée, comme la matrice BD, la matrice gélatineuse, et à migrer à travers des inserts de culture cellulaire. Le test d'invasion tumorale commence lorsque les cellules sont ajoutées à des inserts Fluor block revêtus de matri gel.Un chémoattractant de membrane basale reconstituée est ajouté à la chambre basale et le système est incubé. Au cours de la nuit, les cellules invasives seront capables de dégrader la barrière de matrigel et de traverser la membrane du bloc de flore, une membrane spécialisée qui protège le fluor contre la lumière ambiante. Le contenu de la chambre apicale est éliminé et l'insert multi-puits est ajouté à une seconde plaque contenant un fluor. Après l'incubation, les cellules viables sont colorées et peuvent être détectées visuellement ainsi que par un lecteur de microplaques. Bonjour, je suis Jeff Partridge de BD Biosciences Discovery LabWare. Aujourd'hui, nous allons vous montrer une procédure pour le test d'envahissement tumoral en bloc de plancher.Nous utilisons cette procédure pour étudier l'envahissement de cellules tumorales à travers une membrane basale en direction d'un chémoattractant. Commençons. Faites croître les cellules destinées au test d'envahissement tumoral jusqu'à une confluence d'environ 80 %.Dans cette expérience, nous utiliserons les lignées cellulaires HT 10 80 et N NIH trois T trois. Les cellules HT 10 80 sont connues pour migrer et envahir la barrière de matrigel dans le système, ce qui en fait de bons contrôles positifs pour le test. Les cellules NIH trois T trois ne sont pas invasives, mais elles migrent, et servent donc de bons contrôles négatifs pour cette procédure.Pour commencer, réhydratez le système en sortant le paquet du système d'invasion tumorale BD BioCoat du stockage à moins 20 degrés Celsius et laissez-le atteindre la température ambiante. Étant donné que le test exige une technique stérile, laissez l'insert atteindre la température ambiante dans la hotte de culture tissulaire. Une fois que le paquet est à température ambiante, ouvrez-le pour réhydrater la membrane basale à travers laquelle vos cellules d'intérêt peuvent migrer.Ajouter 500 microlitres de milieu tiède à l'intérieur des puits de l'insert et laisser la plaque réhydrater pendant deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Il n'est pas nécessaire de réhydrater la plaque d'insert multipuits BD Falcon Flora Block 24 non revêtue, car elle sera utilisée comme témoin de migration cellulaire afin de préparer les cellules pour le test d'envahissement. Traiter les monocouches cellulaires avec la trypsine et resuspendre les cellules dans du DMEM sans sérum à une concentration de cinq fois 10 à la puissance quatre cellules par millilitre.Si un type cellulaire différent est utilisé, la densité d'ensemencement optimale doit être déterminée empiriquement. Après la réhydratation de la plaque revêtue, retirez soigneusement le milieu des puits de l'insert sans perturber la couche de gel MA sur la membrane. Le système est désormais prêt à être utilisé.Ne laissez pas la couche de gel MA sécher. Pour commencer le test d'envahissement cellulaire, ajoutez 500 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les chambres apicales du système d'envahissement tumoral, tant dans les configurations revêtues de matrigel que non revêtues. Ensuite, à l’aide des orifices d’échantillonnage pour accéder aux chambres, ajoutez 750 microlitres de chémoattractant dans les chambres basales des plaques revêtues et non revêtues.Il est extrêmement important de ne pas introduire de bulles lors du remplissage des chambres basales. En tant que contrôle de migration, ajoutez chaque suspension cellulaire ainsi que le chémo-attractant dans la plaque d'insertion BD Falcon Flora Block 24 Multi WA non revêtue. Incubez le système d'analyse de l'invasion tumorale et la plaque d'insertion Falcon Flora Block 24 Multi WA non revêtue pendant 20 à 22 heures à 37 degrés Celsius, dans une atmosphère à 5 % de dioxyde de carbone, le jour suivant.Lorsque l'incubation est terminée, les cellules sont prêtes à être marquées avec un colorant fluorescent au calcium am. Retirez soigneusement le milieu des chambres apicales en versant le contenu dans un récipient pour déchets. Transférez ensuite immédiatement le système d'insertion dans une deuxième plaque de 24 puits contenant 500 microlitres par puits de quatre microgrammes par millilitre.Le calcium se trouve dans la solution saline équilibrée de Hank. Répétez ces étapes avec le contrôle de migration. Incubez les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius, sous 5 % de dioxyde de carbone.Ne touchez pas la surface inférieure du système d'insertion. À la fin de l'incubation d'une heure avec le calcium am, la fluorescence des cellules invasives peut être mesurée. Il est primordial que les systèmes d'insertion soient lus en utilisant la carte de plaque correcte.L'orientation correcte de la plaque consiste à placer le puits A1 dans le coin supérieur gauche, le logo BD Falcon étant orienté vers la droite lorsque la plaque est insérée dans le lecteur. La fluorescence est mesurée à des longueurs d'onde de 494 et 517 nanomètres sur un lecteur de plaques à fluorescence en lecture par le fond. Vous devez vérifier vos résultats à l'aide d'un microscope à fluorescence inversé afin de vous assurer que les données du lecteur de plaques correspondent aux résultats visuels. Il s'agit de données typiques obtenues avec un lecteur de plaques à partir d'une plaque revêtue et d'une plaque témoin non revêtue, issues d'essais d'envahissement cellulaire réalisés avec les deux lignées cellulaires HT 10 80 et NIH 3T3.Les données provenant des puits sans cellules représentent le fond pouvant être soustrait avant le calcul du pourcentage d'envahissement cellulaire. Calculez le pourcentage d'envahissement à l'aide de l'équation suivante. Le pourcentage d'envahissement est égal à la moyenne des unités de fluorescence relative ou rfu des cellules ayant traversé la membrane revêtue de matrigel vers l'agent chimiotactique.Ceci est divisé par la valeur moyenne de RFU des cellules ayant migré à travers la membrane du bloc VD non revêtue vers l'agent chimiotactique. Cette valeur est ensuite multipliée par 100. Ce graphique montre la comparaison du pourcentage d'envahissement cellulaire entre les cellules HT 10 80 et les cellules NIH trois T trois ; comme vous pouvez le constater, les cellules HT 10 80 sont envahissantes tandis que les cellules NIH trois T trois ne le sont pas.Lorsque les cellules sont observées au microscope fluorescent inversé, les résultats sont conformes à ceux obtenus avec le lecteur de plaques. Les cellules invasives HT 10 80 ont traversé le matrigel et migré à travers la membrane non revêtue. En revanche, les cellules non invasives NIH trois T trois n'ont pas traversé le matrigel, mais ont migré à travers la membrane non revêtue.Nous venons de vous montrer comment réaliser un test d'envahissement tumoral en bloc floral. Lors de cette procédure, il est important de maintenir les plaques à l'horizontale et de minimiser la formation de bulles. Celles-ci pourraient affecter vos résultats.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.

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