Une In vitro Essai FluoroBlok invasion tumorale

L’invasion cellulaire est une étape importante dans la progression du cancer et l’angiogenèse. Les tests d’invasion in vitro évaluent généralement la capacité des cellules à décomposer la membrane basale reconstituée, telle que la matrice BD, la matrice gel, et à migrer à travers les inserts de culture cellulaire. Le test d’invasion tumorale commence lorsque des cellules sont ajoutées à des inserts de blocs fluorés recouverts de matri gel.

Un attractif de chimiothérapie à membrane basale reconstitué est ajouté à la chambre basale et le système est incubé. Les cellules invasives de nuit seront capables de dégrader la barrière de matri gel et de passer à travers la membrane du bloc de flore, une membrane spécialisée qui protège le fluor de la lumière ambiante. Le contenu de la chambre apicale est jeté et l’insert multipuits est ajouté à une deuxième plaque contenant un fluor.

Après l’incubation, les cellules viables sont colorées et peuvent être détectées à la fois visuellement et par un lecteur de microplaques. Bonjour, je m’appelle Jeff Partridge de BD Biosciences Discovery LabWare. Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure pour le test d’invasion tumorale du bloc au sol.

Nous utilisons cette procédure pour étudier l’invasion des cellules tumorales à travers une membrane basale vers l’attractif de chimiothérapie. Alors commençons. Cultivez les cellules pour le test d’invasion tumorale à environ 80 % de confluence.

Dans cette expérience, nous utiliserons des lignées cellulaires HT 10 80 et N NIH trois T. Il est prouvé que les cellules HT 10 80 migrent et envahissent la barrière matrigel dans le système et servent donc de bons contrôles positifs pour le test. Les cellules NIH trois T trois ne sont pas invasives, mais migrent et servent donc de bons contrôles négatifs pour cette procédure.

Pour commencer, le test réhydrate le système en retirant le paquet du système d’invasion tumorale BD bio coat du stockage à moins 20 degrés Celsius et laissez-le revenir à température ambiante. Étant donné que le test nécessite une technique stérile, laissez l’insert revenir à température ambiante dans le capot de culture tissulaire. Une fois les paquets à température ambiante, ouvrez-le pour réhydrater la membrane basale à travers laquelle vos cellules d’intérêt peuvent passer.

À 500 microlitres de milieu chaud à l’intérieur des puits d’insertion, laissez la plaque se réhydrater pendant deux heures à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone. Il n’est pas nécessaire de réhydrater la plaque d’insertion multipuits BD Falcon Flora Block 24 non revêtue, car elle sera utilisée comme contrôle de la migration cellulaire pour préparer les cellules à l’essai d’invasion. La trypsine est la monocouche cellulaire et suspend les cellules dans le DMEM libre sérique à cinq fois 10 à quatre cellules par millilitre.

Si un autre type de cellule est utilisé, la densité de semis optimale doit être déterminée empiriquement. Après la réhydratation de la plaque revêtue, retirez soigneusement le fluide des puits d’insertion sans perturber la couche de gel MA sur la membrane. Le système est maintenant prêt à être utilisé.

Ne laissez pas la couche de gel MA se dessécher. Pour commencer le test d’invasion cellulaire, ajoutez 500 microlitres de chaque suspension cellulaire dans les chambres apicales du système d’invasion tumorale dans les configurations matrigel avec et sans revêtement. Ensuite, en utilisant les ports d’échantillonnage pour l’accès, ajoutez 750 microlitres d’attractif de chimiothérapie dans les chambres basales à l’intérieur de plaques revêtues et non revêtues.

Il est extrêmement important de ne pas introduire de bulles lors du remplissage des chambres basales. En tant que contrôle de migration, ajoutez chaque suspension cellulaire ainsi que l’attractif de chimiothérapie à la plaque d’insertion non revêtue BD Falcon Flora Block 24 Multi WA. Incuber le système d’invasion tumorale et la plaque d’insertion non revêtue Falcon Flora Block 24 Multi WA pendant 20 à 22 heures à 37 degrés Celsius, 5 % d’atmosphère de dioxyde de carbone le lendemain.

Lorsque l’incubation est terminée, les cellules sont prêtes à être marquées avec un colorant fluorescent calcium am. Retirez délicatement le milieu des chambres apicales en jetant le contenu dans un récipient à déchets. Ensuite, transférez immédiatement le système d’insertion dans une deuxième plaque à 24 puits contenant 500 microlitres par puits de quatre microgrammes par millilitre.

Le calcium est dans la solution saline équilibrée de Hank. Répétez ces étapes avec le contrôle de migration. Incuber les plaques pendant une heure à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone.

Ne touchez pas la surface inférieure du système d’insertion. À la fin de l’incubation d’une heure avec du calcium, la fluorescence des cellules envahissantes peut être mesurée. Il est de la plus haute importance que les systèmes d’inserts soient rouges à l’aide de la bonne carte de plaque.

L’orientation correcte de la plaque est avec le puits A dans le coin supérieur gauche et le logo du faucon BD orienté vers la droite lorsque la plaque est insérée dans le lecteur, la fluorescence est lue à des longueurs d’onde de 494 517 nanomètres sur un lecteur de plaque fluorescente de lecture inférieure. Vous devez vérifier vos résultats à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée pour vous assurer que les données du lecteur de plaques correspondent aux résultats visuels. Il s’agit de données de lecture de plaques typiques provenant d’une plaque revêtue et d’une plaque de contrôle non revêtue, obtenues à partir d’essais d’invasion cellulaire des deux lignées cellulaires HT 10 80 et NIH trois T trois.

Les données provenant de puits sans cellules représentent le bruit de fond qui peut être soustrait avant le calcul du pourcentage d’invasion cellulaire. Calculez le pourcentage d’invasion à l’aide de l’équation suivante. Le pourcentage d’invasion est égal à la moyenne des unités fluorescentes relatives ou rfu des cellules qui ont traversé la membrane enrobée de matrigel vers l’attractif de chimiothérapie.

Ceci est divisé par la RFU moyenne des cellules qui ont migré à travers la membrane non enrobée du bloc VD flua vers l’attractif de chimiothérapie. Cette valeur est ensuite multipliée par 100. Ce graphique montre la comparaison du pourcentage d’invasion cellulaire entre HT 10 80 et NIH trois cellules T trois, et comme vous pouvez le voir, les cellules HT 10 80 sont invasives alors que les cellules NIH trois T trois ne le sont pas.

Lorsque les cellules sont vérifiées au microscope à fluorescence inversée, les résultats sont cohérents avec ceux obtenus à partir du lecteur de plaques. Les cellules invasives HT 10 80 ont envahi le matrigel et ont migré à travers la membrane non enrobée. En revanche, les trois cellules T non invasives de NIH n’ont pas envahi le matrigel, mais ont migré à travers la membrane non enrobée.

Nous venons de vous montrer comment effectuer un test d’invasion tumorale par bloc floral. Lors de cette procédure, il est important de garder les plaques horizontales et de minimiser la formation de bulles. Ceux-ci pourraient affecter vos résultats.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.