Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Start proceduren ved at placere en bedøvet voksen fisk på en stak absorberende papir. Brug nu et sterilt barberblad til at skære halefinnen og hurtigt overføre fisken til en tank, der indeholder ferskvand til genopretning. Overfør haleclipsen til et rent rør, der indeholder en lysisbuffer. Lysisbufferen indeholder nonioniske rengøringsmidler, som opløser plasmamembranen og en celles nukleare membran. Bufferen indeholder også et enzym kaldet proteinase K, der nedbryder proteiner og gør det muligt at frigive DNA i lysatet. Det nedbryder også kerner og beskytter DNA'et mod nuklease fordøjelsen.
Efterlad nu rørene med haleklemmer i en inkubator natten over for helt at nedbryde vævet ved 55 grader Celsius med kontinuerlig rotation. Derefter opvarmes røret ved 95 grader Celsius i 15 minutter for at inaktivere proteinase K. Centrifuge røret til pellet ufordøjet materiale og overføre det supernatant, der indeholder DNA, til et andet rør. Tilsæt alkohol for at udfælde DNA og centrifuge igen for at samle DNA'et i en pellet. I den følgende protokol isolerer vi DNA fra haleklippet af en voksen zebrafisk og fra et helt embryo.
- På dagen for DNA-præparatet tilsættes frisk proteinase K til lysisbufferen i en koncentration på 1 milligram pr. milliliter. Væv kan opsamles fra en voksen fisk ved hjælp af et finneklip eller fra en embryonal fisk.
Først bedøve fisken i tricainopløsning. Vent til gillbevægelserne langsomt. Sæt derefter fisken på en stak væv og med et sterilt barberblad afbrød et lille stykke halefinne ca. 2 til 3 millimeter lang. Hurtigt placeret fisken i en mærket tank med ferskvand til genopretning.
Hent finclipsen med en steril pipettespids og overfør den til et rør fyldt med hundrede mikroliter DNA lysis buffer. Sørg for at mærke både dyrets tank og røret. Inkuber alle de indsamlede væv i mindst fire timer og op til natten over ved 55 grader Celsius.
Efter inkubationen inaktiveres proteinase K ved opvarmning af rørene ved 95 grader Celsius i 15 minutter. Disse prøver skal straks anvendes til PCR, men kan også opbevares ved minus 20 grader Celsius i op til tre måneder.
