Extraction de l’ADN à partir du clip tail: Une méthode utilisée dans le génotypage zebrafish

- Commencez la procédure en plaçant un poisson adulte anesthésié sur une pile de papier absorbant. Utilisez maintenant une lame stérile de rasoir pour couper l’aileron de queue et transférer rapidement le poisson dans un réservoir contenant de l’eau douce pour la récupération. Transférer le clip de la queue dans un tube propre contenant un tampon de lyse. Le tampon de lyse contient des détergents nonioniques qui solubilisent la membrane plasmatique et la membrane nucléaire d’une cellule. Le tampon contient également une enzyme appelée proteinase K qui décompose les protéines et permet la libération d’ADN dans le lysate. Il dégrade également les nucléases, protégeant l’ADN contre la nucléase. digestion.

Maintenant, laissez les tubes avec des pinces de queue dans un incubateur pendant la nuit pour décomposer complètement le tissu à 55 degrés Celsius avec rotation continue. Ensuite, chauffer le tube à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes pour inactiver la proteinase K. Centrifugeuse le tube pour pelleter du matériel non digéré et transférer le supernatant contenant de l’ADN dans un autre tube. Ajouter de l’alcool pour précipiter à nouveau l’ADN et la centrifugeuse pour recueillir l’ADN dans une pastille. Dans le protocole suivant, nous isolerons l’ADN du clip de queue d’un poisson zèbre adulte et d’un embryon entier.

- Le jour de la préparation de l’ADN, ajouter de la proteinase K fraîche au tampon de lyse à une concentration de 1 milligramme par millilitre. Les tissus peuvent être prélevés sur un poisson adulte à l’aide d’un clip d’aileron ou d’un poisson embryonnaire.

Tout d’abord, anesthésier le poisson dans la solution tricaine. Attendez que les mouvements maillants ralentissent. Puis, mettez le poisson sur une pile de tissus et, avec une lame stérile de rasoir, coupez un petit morceau de l’aileron de queue d’environ 2 à 3 millimètres de long. Rapidement placé le poisson dans un réservoir étiqueté avec de l’eau douce pour la récupération.

Ramasser le clip de la nageoire à l’aide d’une pointe stérile de pipette et le transférer dans un tube rempli d’une centaine de microlitres de tampon de lyse d’ADN. Assurez-vous d’étiqueter à la fois le réservoir de l’animal et le tube. Incuber tous les tissus recueillis pendant au moins quatre heures et jusqu’à la nuit à 55 degrés Celsius.

Après l’incubation, inactivez la proteinase K en chauffant les tubes à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ces échantillons doivent être utilisés pour la PCR immédiatement, mais peuvent également être stockés à moins 20 degrés Celsius pendant une période maximale de trois mois.