Préparation et de la culture de tranches de poulet auditive du tronc

L’objectif global de cette procédure est de préparer des tranches de poulet, de tronc cérébral auditif à utiliser pour la physiologie cellulaire entière in vitro ou les cultures organotypiques à long terme. Pour ce faire, il faut d’abord retirer l’embryon de l’ovule. La deuxième étape de la procédure consiste à disséquer le cerveau du crâne et à isoler la région auditive du tronc cérébral.

La troisième étape de la procédure consiste à préparer des tranches de la région du tronc cérébral sur un viome. La dernière étape de la procédure consiste à placer des tranches du tronc cérébral dans une chambre pour les enregistrements physiologiques, ou sur des plaques Millipore pour la culture. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent des tranches saines du tronc cérébral auditif à partir d’embryons de poulet grâce à des enregistrements physiologiques ou à des cultures organotypiques à long terme.

Bonjour, je m’appelle Armand Sidle. Ces deux méthodes peuvent donner un aperçu du développement auditif des oiseaux. Il peut également être utilisé pour étudier la régénération topographique des exons, la dynamique des dendrites, ainsi que les propriétés intrinsèques et synaptiques dues à la structure et à la fonction uniques de ce circuit auditif binaural.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette technique auront du mal. Les tissus doivent être rapidement disséqués, tranchés et stockés afin d’avoir des échantillons viables pour les approches physiologiques et culturales. Tout d’abord, préparez une solution de gélose à 4 % en ajoutant 40 milligrammes de gélose par millilitre d’eau distillée et chauffez au micro-ondes jusqu’à ébullition.

Versez la solution de gélose chaude dans une boîte de Pétri et laissez-la refroidir jusqu’à ce qu’elle soit ferme une fois solidifiée. Découpez un petit bloc de gélose et collez-le sur l’étage de vibrato. Ensuite, préparez 500 à 1000 millilitres de liquide céphalo-rachidien artificiel ou un LCR pour plus tard.

À utiliser dans la chambre de l’étage de vibrato en bouillonnant continuellement avec un mélange de 95 % d’oxygène, 5 % de pH de dioxyde de carbone, 7,2 à 7,4 et une osmolarité de 295 à 310 milliosmoles par litre. Pendant que le LCR A bouillonne, nettoyez la dissection dans les zones de culture, Vibram et lame avec de l’éthanol à 70 %. Rincez la lame du vibram avec de l’eau distillée et laissez sécher, placez un tampon d’absorption de liquide propre sur la zone de dissection et disposez les outils de dissection appropriés, généralement constitués d’un scalpel, de ciseaux, d’une pince à épiler, de lames de rasoir, d’épingles, d’une boîte de Pétri et d’une spatule sous un capuchon de culture de tissus stériles.

Plaque de puits avec un millilitre de culture, milieu et incuber à 35 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Préparez autant d’inserts de membrane de culture que nécessaire et rangez-les dans le capot pour plus tard. Utiliser sur le tampon de dissection.

Placez un œuf sous une source lumineuse pour localiser le vide spatial rempli d’air de l’embryon, qui est généralement le grand côté de l’œuf. Cassez le grand côté de l’œuf à l’aide de l’extrémité plate de la spatule, en exposant le sac à membrane. Faites une tranche dans le sac membranaire avec le scalpel ou les ciseaux, et extrayez doucement la tête de l’embryon de poulet avec la spatule.

À l’aide de ciseaux. Décapitez rapidement la tête de l’embryon. Placez la pointe d’une lame de rasoir légèrement en arrière du milieu des yeux et faites une incision rostrale pour dorloter la ligne médiane à travers le crâne.

Appliquer une légère pression pour les jeunes embryons. Utilisez moins de pression pour les embryons plus âgés. Utilisez-en davantage maintenant que l’incision a été faite.

Écartez doucement la peau et les plumes pour les animaux plus âgés afin d’exposer le crâne et de vérifier la ligne médiane. Couper. En exerçant une forte pression, bloquez la partie rostrale du crâne en tranchant avec une lame de rasoir. Positionnez la lame derrière les yeux et coupez rapidement l’ensemble du crâne et du tissu cérébral.

Placez le tissu bloqué sur une boîte de Pétri avec le côté du dorloteur vers le haut. Épinglez le tissu à travers la région musculaire latérale et immergez-le complètement avec des bulles. Un CSF.

Faites des incisions médianes à latérales avec de petits ciseaux dans la région caudale du crâne, légèrement en avant des muscles visibles du cou des deux côtés de la tête. Retirez le crâne et les tissus pour exposer le cervelet et le cerveau. Maintenant que le tissu cérébral est exposé, localisez le cervelet et le tronc cérébral pour retirer le tissu du crâne.

À l’aide d’une paire de petits ciseaux, coupez doucement de la base du crâne le tissu attaché qui entoure le tronc cérébral du côté ventral. Une fois que le tronc cérébral a été retiré du crâne, épinglez-le sur une boîte de Pétri remplie de cigare à travers l’optique. Ensuite, retirez complètement le cervelet en coupant les pédoncules avec de petits ciseaux, exposant le plancher du quatrième ventricule.

Utilisez une pince à épiler pour retirer toute membrane de tissu et de vaisseaux sanguins de la surface du tronc cérébral et faites des coupes latérales à travers la tétine optique. Pour libérer le tronc cérébral, placez une petite quantité de superglue sur la scène Vibram devant le bloc de gélose à l’aide d’une pince à épiler coudée doucement mais rapidement. Soulevez le tronc cérébral au niveau de la moelle épinière et placez le tissu sur la superglue avec le côté rostral vers le bas et le côté dorsal vers la lame vibram.

Retirez l’excédent de colle avec un mouchoir en papier ou du papier filtre. Remplissez doucement l’étage vibram avec environ 100 millilitres de LCR A oxygéné. Si le tranchage est effectué rapidement, il est possible d’utiliser le LCR A oxygéné préparé.

Dès la première section. Positionnez la lame Vibram de manière à ce qu’elle soit à un angle de 20 à 22 degrés par rapport à l’étage Vibram. Démarrez le vibram à l’amplitude d’oscillation maximale.

Déplacez ensuite la platine vers le haut de la lame de manière à ce que le haut du tissu soit parallèle à la lame. Avant de trancher. Déplacez rapidement la lame vers le tissu du tronc cérébral, mais ralentissez considérablement juste avant que la lame n’entre en contact avec le tissu.

Maintenant que la lame est en place, commencez à trancher le tissu avec le mouvement vers l’avant le plus lent possible. Une fois à travers toute la section coronale du tissu, éloignez doucement les tranches de la lame avec un pinceau et jetez-les. Abaissez l’étage de vibrato par pas de 300 à 500 micromètres et coupez.

Encore une fois, répétez jusqu’à ce que les signatures anatomiques soient visibles dans le tissu du tronc cérébral, en éliminant toutes les tranches précédentes. Maintenant, coupez et collectez du tissu du tronc cérébral contenant des structures auditives à 200 à 1000. Épaisseurs micrométriques recueillant soigneusement les tranches utilisables dans l’ordre de tranchage.

Si les tranches doivent être utilisées pour la physiologie in vitro, qui sera montrée dans une section ultérieure de cette vidéo, elles doivent à ce stade être stockées individuellement dans des chambres personnalisées faites de tubes en plastique creux ouverts en haut et de mailles en nylon collées en bas. Chaque chambre individuelle est reliée à une chambre de stockage plus grande dans laquelle environ 350 millilitres de LCR A sont continuellement bullés. Si les tranches doivent être utilisées pour des cultures biologiques typiques, voir la section suivante immédiatement après la collecte des tranches, transférer des tranches avec environ 500 millilitres de LCR A à l’aide d’une pipette en verre poli au feu équipée à une extrémité d’une poire en caoutchouc sur une plaque de 48 puits sur de la glace.

Placer une tranche par puits et maintenir l’ordre de tranchage. Une fois terminé, en recueillant toutes les tranches d’un cerveau, apportez la plaque à 48 puits dans le capot de culture tissulaire. Récupérez la plaque à six puits qui a été préparée plus tôt de l’incubateur et apportez-la également à la hotte.

Placez un insert de membrane dans un puits avec du milieu de culture, en vous assurant qu’aucune bulle d’air n’est piégée en dessous. À l’aide d’une pipette en verre, transférez une tranche dans une goutte de LCR A sur la membrane humide. Insérez et retirez tout excès de LCR qui se trouve encore sur le dessus à l’aide d’une micro pipette.

Répétez l’opération pour un maximum de quatre tranches par membrane et positionnez les tranches de manière à ce qu’elles ne se touchent pas ou ne touchent pas le bord de la membrane. Stockez les cultures dans un incubateur à 35 degrés Celsius et entretenez-les en changeant le milieu de culture trois fois par semaine sous une hotte de culture de tissus. Placez chaque tranche dans une chambre de maintien individuelle à l’aide d’une pipette en verre poli au feu équipée à une extrémité de la poire en caoutchouc.

Continuer à maintenir l’ordre de tranchage. La chambre de rétention doit être remplie d’un LCR préparé plus tôt et alimenté en permanence par des bulles avec un mélange de 95 % d’oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone pendant toute la durée des expériences de physiologie. Laissez les tranches s’équilibrer en plaçant la chambre de maintien dans un bain-marie à 35 degrés Celsius pendant environ une heure, puis laissez-la reposer à température ambiante pendant 30 minutes.

Les tranches peuvent être utilisées jusqu’à six heures après avoir été retirées du bain chaud. Après 30 minutes à température ambiante, les tranches peuvent être transférées de la chambre de maintien vers une chambre d’enregistrement de 0,5 millilitre montée sur un microscope pour des expériences électrophysiologiques. Un schéma représentatif et des images de coupe in vitro du circuit auditif du poulet sont présentés ici.

Les images en coupe sont typiques de la région auditive du tronc cérébral et, avec de la pratique, peuvent être facilement identifiées. Les entrées excitatrices ORL du nerf auditif ou d’un N projettent à la fois le noyau magnocellis ou NM et le noyau angulaire ou N na. Le NM projette des entrées excitatrices bilatérales vers le noyau, les lamines ou la NL des deux côtés du tronc cérébral.

Une entrée inhibitrice du noyau olivar supérieur ou des projections SON vers les projets na, nm et nl. Ici, une tranche coronale du tronc cérébral auditif d’un poulet E 11 est montrée après sept jours. Dans la culture.

Les neurones ont été marqués à l’aide de méthodes immunohistochimiques, un anticorps contre la protéine associée aux microtubules deux, qui se produit dans le soma et les dendrites, marque les neurones en vert. Un groupe de neurones NM et d’axones est marqué en rouge par électroporation d’un colorant rin. Les terminaisons axonales ipsilatérales nm indiquées par les pointes de flèches blanches peuvent être vues en saillie vers les dendrites NL dorsales.

On voit ici les changements de tension membranaire superposés en réponse aux étapes de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes des tissus aigus et cultivés à quatre et sept jours de culture. Notez les changements dans la chute de tension hyperpolarisante, la forte réduction du courant sortant et le déclenchement potentiel à simple action qui se développent de manière similaire dans l’approche de culture en tranches. Par rapport à l’âge équivalent, les potentiels membranaires aigus au repos des tissus étaient compris entre moins 55 et moins 60 millivolts Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en moins de 15 minutes si elle est effectuée correctement.

Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser des techniques stériles appropriées, Et après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des tranches de tige de tresse auditive de poulet à utiliser pour des enregistrements physiologiques ou à utiliser pour la culture.