Die Quantifizierung der Wirkung als Agonist am G-Protein-gekoppelte Rezeptoren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die relative Affinitätskonstante KB eines Agonisten für den aktiven Zustand eines Rezeptors durch Analyse seiner Konzentrations-Reaktions-Kurve abzuschätzen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Konzentrations-Wirkungs-Kurven einer Gruppe von Agonisten gemessen werden, um eine Reaktion an einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor auszulösen. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die eemax- und EC 50-Werte der Agonisten mit Hilfe der nichtlinearen Regressionsanalyse zu schätzen.

Diese Werte werden dann verwendet, um erste Parameterschätzungen für die anschließende nichtlineare Regressionsanalyse unter Einbeziehung des operationellen Modells zu berechnen. In einem letzten Schritt werden relative Schätzungen der Affinitätskonstanten von Agonisten für den aktiven Zustand des Rezeptors mit Hilfe einer globalen nichtlinearen Regressionsanalyse ihrer Konzentrations-Reaktions-Kurven erhalten. Letztendlich kann unter Verwendung einer modifizierten Form des operationellen Modells die Affinitätskonstante eines Agonisten für den aktiven Zustand eines Rezeptors, der relativ zu dem eines anderen Agonisten exprimiert wird, durch eine globale nichtlineare Regressionsanalyse ihrer Konzentrations-Reaktions-Kurven geschätzt werden.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Wirkstoffforschung zu beantworten, z. B. ob ein Agonist Selektivität für einen bestimmten Signalweg aufweist. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Details der mathematischen Analyse Schwierigkeiten haben. Für die Schätzung der relativen Agonisten-KB-Werte ist eine Reihe von mindestens zwei Agonisten-Konzentrations-Antwort-Kurven erforderlich.

Eine Diskussion der Überlegungen zu solchen Versuchen findet sich im schriftlichen Protokoll. Nachdem Sie die Antwortkurven erhalten haben, subtrahieren Sie die basale Reaktion von der in Gegenwart jeder Agonistenkonzentration gemessenen Reaktion, um die Daten aus den Konzentrationsreaktionsexperimenten in eine Datentabelle einzugeben. In der Prism-Software werden alle logarithmischen Agonistenkonzentrationen in der Spalte X eingegeben. Die Ansprechmessungen für den Agonisten, der den größten maximalen Ansprech- oder eax-Wert zu haben scheint, werden in Spalte A und die für andere Agonisten in benachbarte Spalten mit Buchstaben eingegeben.

Geben Sie die Replikationsmessungen von Konzentrations-Reaktions-Kurven in Unterspalten einer bestimmten Spalte mit Buchstaben ein. Wählen Sie das Diagrammblatt aus, auf dem die Daten gezeichnet sind, und wählen Sie Analysieren, um die Daten durch nichtlineare Regressionsanalyse unter Verwendung der variablen Steigungsgleichung zu analysieren, den Parameter bottom auf Null zu beschränken und die Regressionsanalyse durchzuführen. Notieren Sie die Parameter top und log EC 50 für die Berechnung der anfänglichen Parameterschätzungen.

Um die anfänglichen Parameterschätzungen zu berechnen, ordnen Sie log tau K beobachtet dem negativen log EC 50-Wert des Standardagonisten zu. Als nächstes wird der logarithmische RAI-Wert jedes Testagonisten als Logarithmus der Menge berechnet, die sich aus dem Produkt aus dem eemax-Wert des Testagonisten multipliziert mit dem EC 50 des Standardagonisten dividiert durch das Produkt aus dem emax-Wert des Standardagonisten multipliziert mit EEC 50 des Testagonisten zusammensetzt. In dieser Gleichung werden die Parameter des Standard-Agonisten mit einem Apostroph bezeichnet.

Ordnen Sie dann die logarithmische Affinitätskonstanz des Testagonisten dem negativen Logarithmus ihrer jeweiligen EC-Werte zu. Nachdem Sie die Daten in Prism eingegeben haben, stellen Sie sicher, dass die Daten für den Agonisten mit dem größten EMAX-Wert in Spalte A eingegeben werden.Dieser Agonist wird nun als Standard bezeichnet, während die anderen Agonisten als Testagonisten bezeichnet werden. Geben Sie als Nächstes ein benutzerdefiniertes Gleichungsprotokoll, RAI, in ein Prisma auf mehreren Zeilen ein.

In diesem Fall umfasst die benutzerdefinierte Gleichung insgesamt fünf Agonisten. Geben Sie die anfänglichen Parameterschätzungen von Lock R und die Affinitätskonstanz der Testagonisten ein. M sis wird der EMAX-Wert des Standard-Agonisten zugewiesen und M wird der Wert eins zugewiesen.

Geben Sie nun die anfänglichen Parameterschätzungen der logarithmischen RAI-Werte der Testagonisten ein. Wenden Sie Parametereinschränkungen an, indem Sie log K auf null beschränken und logarithmus GR, m, sis und M auf einen gemeinsamen Wert für alle Datensätze festlegen. Initiieren Sie als Nächstes eine nichtlineare Regressionsanalyse.

Die Ergebnisse liefern die beobachteten log K und log RAI-Werte der Test-Agonisten Für die Schätzung der Agonisten KB-Werte in absoluten Einheiten inverser molarer Einheiten werden zellbasierte vitro-Assays verwendet, die eine konstitutive Rezeptoraktivität aufweisen. Wählen Sie Agonisten und gestalten Sie das Experiment wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Berechnen Sie die konstitutive Rezeptoraktivität und die Reaktion auf jede Konzentration von Agonisten als die gemessene Reaktion abzüglich der basalen Reaktion in Zellen, die nicht mit dem hier gezeigten Rezeptor transfiziert wurden, eine Reaktion auf verschiedene Agonisten, die auf diese Weise für einen Signalweg berechnet wurden und für die vorläufige Analyse eine sehr geringe konstitutive Aktivität aufweisen.

Geben Sie zunächst die Daten in das Prisma ein, wie für die nicht-konstitutive Aktivität beschrieben. Annehmen. Geben Sie auch die durch die konstitutive Rezeptoraktivität verursachte Reaktion in die entsprechenden Buchstaben in der Zeile ein, die einer logarithmischen Agonistenkonzentration von minus 20 entspricht. Hier wird ein großer negativer Logarithmus eingegeben, um eine Agonistenkonzentration von Null zu approximieren.

Analysieren Sie die Daten wie zuvor, mit der Ausnahme, dass für die konstitutive Aktivität der Parameter bottom so eingeschränkt werden sollte, dass er für alle Datensätze gemeinsam genutzt wird. Zeichnen Sie den gemeinsamen Parameter sowie die Parameter top und log EC für jeden Agonisten auf. Nach Bestimmung der logarithmischen Affinitätskonstanz des Standardagonisten in getrennten Experimenten wird die anfängliche Schätzung des beobachteten logarithmischen K-Wertes jedes partiellen Testagonisten als Logarithmus des Ausdrucks berechnet, der sich aus der Differenz zwischen dem emax-Wert des Standardagonisten und dem Testagonisten dividiert durch das Produkt von EC 50 und der Differenz zwischen dem eemax-Wert des Standardagonisten und der konstitutiven Reaktion zusammensetzt.

Berechnen Sie die anfängliche Schätzung der logarithmischen KB für jeden Agonisten und die anfängliche Schätzung der logarithmischen T cis, um die Agonisten-KB-Werte zu schätzen. Geben Sie die Daten in Prism ein und geben Sie dann eine benutzerdefinierte Gleichung ein. Loggen Sie KB auf mehreren Zeilen in das Prisma ein, wie hier für den Zustand von zwei Agonisten gezeigt.

Geben Sie als Nächstes die anfänglichen Parameterschätzungen ein, indem Sie die Affinitätshaltung jedes Agonisten eingeben. Dem logarithmischen T sis-Schätzwert, dem M sis-Schätzwert und dem M-Schätzwert wird Mis der EMAX-Wert des Standardagonisten zugewiesen, und M wird der Wert eins zugewiesen. Geben Sie abschließend die anfänglichen Schätzungen von log kb ein.

Wenden Sie Parametereinschränkungen an, indem Sie log K one auf seinen zuvor bestimmten Wert beschränken und log T sis, m sis und M auf einen gemeinsamen Wert für alle Datensätze festlegen. Initiieren Sie eine nichtlineare Regressionsanalyse. Die Ergebnisse ergeben die logarithmischen KB-Werte des Standard-Agonisten, den beobachteten logarithmischen K und die logarithmischen KB-Werte von partiellen Agonisten.

Die maximale Reaktion des Systems, der log T cys-Wert für den freien Rezeptorkomplex und der Wandlersteigungsfaktor in dem hier gezeigten operationellen Modell ist die durch Muskarinagonisten induzierte Phosphoinositid-Hydrolyse in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, die den Muskarinrezeptor M drei stabil exprimiert. Die Konzentrations-Wirkungskurven ausgewählter Muskarin-Agonisten wurden in diesem Assay gemessen, und die Daten wurden wie hier beschrieben analysiert, um den KB-Wert jedes Agonisten im Verhältnis zu dem von Oxo Tremaine M zu schätzen. Die theoretischen Kurven stellen die Anpassung der kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung an die Daten dar. Die logarithmischen RAI-Schätzungen sind für Kabale, a Recline, Pilocarpin und McNeil dargestellt.

A 3, 4 3. Es wurden die entsprechenden Abschätzungen des maximalen Ansprechverhaltens des Systems und des Flankensteilungsfaktors des Aufnehmers ermittelt. Die log K beobachteten Werte der Agonisten wurden ebenfalls für jeden gezeigten Agonisten gefunden.

Hier sind die Ergebnisse von Experimenten zur durch Muskarinagonisten stimulierten Phosphoinositid-Hydrolyse in HC 2 93-Zellen. Die stabil exprimierende transiente Expression von G alpha 15 des Muskarinrezeptors M 3 führte zu einem Anstieg der basalen Phosphoinositidhydrolyse, was auf die konstitutive Rezeptoraktivität zurückgeführt wurde. Die Daten wurden analysiert, um die logarithmischen KB-Werte von Oxo Tremaine M und MacNeil, A 3 43 zu schätzen.

Die theoretischen Kurven stellen die Anpassung der kleinsten Quadrate der Regressionsgleichung an die Daten dar. Die logarithmischen KB-Schätzungen sind für Oxo Tremoring M und McNeil, A 3 43 dargestellt. Die Schätzung des beobachteten K-Wertes von McNeil A 3 43 wurde ebenfalls bestimmt.

Einmal gemeistert, kann diese Datenanalysetechnik in wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl relative als auch tatsächliche KB-Werte aus den Konzentrations-Reaktions-Kurven von Agonisten schätzen können, um eine Reaktion stromabwärts im Signalweg eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors auszulösen.