Un système expérimental pour étudier mécanotransduction dans les cellules des poumons du foetus

Les forces mécaniques jouent un rôle clé dans le développement du poumon et des lésions pulmonaires. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler les rongeurs fœtales du poumon cellules de type II épithéliales et les fibroblastes et de les exposer à une stimulation mécanique en utilisant un

L’objectif de cette procédure est de décrire un système expérimental pour étudier la transduction mécanique dans les cellules pulmonaires fœtales. Ceci est accompli en codant des plaques de culture avec des protéines de matrice extracellulaire. Ensuite, les cellules épithéliales du poumon de souris fœtale de type deux sont isolées, suivies de l’isolement des fibroblastes de souris fœtales.

La dernière étape décrit un système in vitro pour fournir une stimulation mécanique aux cellules pulmonaires. En fin de compte, on peut obtenir des résultats qui montrent une augmentation de la différenciation cellulaire de type deux grâce à la PCR en temps réel, au western blot et aux images d’immunochimie de fluorescence. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la transduction mécano, telles que le développement pulmonaire fœtal et les lésions pulmonaires.

Julian gu, un technicien de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure Pendant que nous travaillons dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles, il produit 120 microgrammes de laminine avec 12 millilitres de stérile à froid, un XPBS par plaque. D’autres protéines de la matrice extracellulaire peuvent être utilisées pour l’enrobage. Consultez le protocole écrit pour plus de détails, puis prenez une plaque non traitée BioFlex et ajoutez deux millilitres de solution stratifiée dans chaque puits jusqu’à une concentration finale de deux microgrammes par centimètre carré.

Assurez-vous que les puits sont complètement recouverts par la solution. Couvrez entièrement l’assiette d’une pellicule plastique et placez-la sur une surface plane dans un environnement à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre au stratifié d’absorber au fond des puits. Les plaques revêtues peuvent être stockées dans ces conditions pendant au moins une semaine tout en conservant un bon fonctionnement ECM le lendemain.

Dans des conditions stériles, lavez les puits trois fois avec un XPBS. Ajoutez ensuite un millilitre de 1 % BSA dans un XPBS à chacun. Bien incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure pour bloquer les sites de liaison non spécifiques sur les membranes.

Là encore, lavez les puits trois fois avec un XPBS. Pour éliminer les protéines non absorbées, ajoutez un millilitre de DMEM dans chaque puits de la plaque. Conservez ensuite la plaque à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules épithéliales du poumon de rongeur fœtal de type deux soient isolées et prêtes pour le placage.

La veille du début de la procédure d’isolement cellulaire, assemblez les coupelles de criblage avec des mailles en nylon de 130 et 15 microns et stérilisez-les à l’autoclavage. Isoclavez également le même nombre de pics de verre de 150 millilitres le jour de la culture. Obtenir des poumons fœtaux à partir d’une souris enceinte chronométrée entre E 17 et 19 de la gestation.

Transférez le tissu dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant du milieu DMEA et placez-le sur de la glace. Préparez un tampon de digestion frais dans un tube à centrifuger de 50 millilitres selon la recette du protocole écrit. Et tout en travaillant dans un filtre à hotte à flux laminaire, stérilisez à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron.

10 millilitres de ce tampon suffisent pour le tissu pulmonaire obtenu à partir d’environ 20 fœtus de souris. Placez le tube conique contenant le tampon de digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Asseyez le dium du tube conique contenant le tissu pulmonaire fœtal et transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de ciseaux stériles ou d’une lame de rasoir, coupez le tissu en morceaux de moins d’un millimètre.

Transférez ensuite le tissu dans le tube conique contenant le tampon de digestion préchauffé. Ensuite, facilitez mécaniquement la digestion du tissu en pipetant la suspension de cellules pulmonaires fœtales de haut en bas une centaine de fois chacune à l’aide de pipettes de taille d’ouverture décroissante. Une fois le processus de digestion terminé, centrifugez l’homogénat à 1 300 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez soigneusement le décubitus dorsal par aspiration et remettez en suspension la pastille contenant les cellules dans 15 millilitres de DMEM plus 20 % FBS. Ensuite, récupérez les coupelles de tamis avec des mailles en nylon de 130 et 15 microns et placez-les sur les béchers stériles de 150 millilitres. Pipeter l’homogénat de la cellule sur la maille de 100 microns.

Prélevez le filtrat et pipetez-le sur la maille de 30 microns. Lavez la maille de 30 microns plusieurs fois avec du DMEM frais plus 10 %FBS. La plupart des cellules de type deux s’agglutinent et ne passent pas à travers le maillage.

Ces lavages éliminent les cellules non épithéliales qui peuvent être attachées aux amas. Appliquez le filtrat de la maille de 30 microns dans la coupelle du tamis de 15 microns. Encore une fois, lavez plusieurs fois comme auparavant.

Cette étape recrute les cellules de type deux qui peuvent être passées à travers le maillage de 30 microns. Collectez les cellules non filtrées agglomérées des mailles de 30 et 15 microns pour un enrichissement supplémentaire des cellules de type deux. Retenir le filtrat de la maille de 15 microns si des fibroblastes pulmonaires de rongeurs fœtaux doivent être cultivés.

Sinon, jetez ce filtrat. Plus loin. Purifiez la population de cellules épithéliales de type deux en ajoutant un média et en incubant les cellules non filtrées des gobelets à mailles de 30 et 15 microns dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés pendant 30 minutes après cette centrifugeuse d’incubation le super nom comme précédemment, granulez les cellules, puis remettez en suspension la pastille dans deux millilitres de DMEM pro pipette de fœtus sans sérum un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits du stratifié revêtu BioFlex six plaques à six puits à ce stade, les cellules apparaissent en amas lorsqu’elles sont observées au microscope, incubent la plaque dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Une incubation de 24 heures est optimale et un minimum de six heures d’incubation est requis.

Avant de commencer les expériences de déformation mécanique, prélevez le filtrat de la maille de 15 microns et transférez-le dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes pour permettre au fibroblaste d’adhérer, d’aspirer et de jeter le sate. Remplacez ensuite le volume dans le flacon par du DMEM sans sérum et incubez pendant la nuit. Le lendemain, récoltez les cellules avec 0,25 % de trypsine dans de l’EDTA de 0,4 millimolaire et placez-les sur des plaques BioFlex enrobées de fibronectine à incuber dans un incubateur de culture tissulaire réglé à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, idéalement pendant 24 heures avant de commencer les expériences de contrainte mécanique.

Une incubation d’au moins six heures est requise si un nombre précis de cellules est requis pour les expériences. Les cellules de type deux sont maintenues dans des flacons de DMEM de 75 centimètres carrés sans sérum après l’isolement, et le lendemain, les cellules sont comptées par essais, puis la monocouche assise ne doit pas être supérieure à 80 % confluente avant le début des expériences. Le jour de l’expérience de stimulation mécanique, le milieu de culture cellulaire est remplacé par deux millilitres de DMEM frais sans sérum par puits, puis la plaque est montée dans une unité de souche flex cell FX 5 000.

Ensuite, appliquez la déformation biaxiale EQU sur les membranes. Le régime de déformation varie en fonction de la simulation des forces mécaniques in vivo. Comme indiqué dans le protocole écrit, les cellules cultivées sur des membranes étirées non ST.

Des animaux cultivés en parallèle sont utilisés comme témoins pour l’expérience. À la fin de l’expérience, les monocouches peuvent être traitées pour analyser les changements dans l’expression des gènes par PCR en temps réel ou les changements dans l’abondance des protéines par transfert Western. De plus, des monocouches peuvent être fixées pour des expériences d’immunochimie pour cette technique.

Après la fixation, des membranes astiques sont découpées dans les plaques et montées sur des lames de verre en utilisant 10 à 20 microlitres d’eau comme agent de montage avant la perméation et l’incubation avec des anticorps. La super donnée de l’expérience peut également être utilisée pour étudier la présence de substances libérées telles que des facteurs de croissance ou des cytokines. Cette image montre des cellules épithéliales fœtales de type E 18 parmal fixées qui ont été isolées comme dans ce protocole et plaquées sur des plaques BioFlex codées avec de la laminine.

Les cellules ont été réparées et la photo a été prise. Le lendemain, les cellules d’étirement non ST ont été plaquées. La pureté des cellules a été déterminée à 90 plus ou moins 5 % par analyse microscopique de la morphologie des cellules épithéliales et immunomarquage pour la protéine tensioactive C. Les figures suivantes présentent des données provenant de cellules épithéliales fœtales de type deux qui ont été exposées à une déformation cyclique de 5 % à 40 cycles par minute pendant 16 heures.

Ce transfert de nord de l’expression de l’ARNm de la protéine C du tensioactif illustre que la souche induit une différenciation cellulaire de type deux à l’aide de différents substrats ECM. Les signes plus moins représentent respectivement l’exposition à la tension ou l’absence d’exposition à la fatigue. Les données d’expression sont présentées dans l’histogramme sous la forme d’une moyenne plus ou moins SEM, le N étant égal à trois et l’astérisque indiquant une valeur P inférieure à 0,05.

Ces images d’immunochimie de fluorescence montrent les niveaux de protéine C du tensioactif en vert. Chez le fœtus, deux cellules non exposées à des contraintes mécaniques sur les noyaux gauches et exposées à des contraintes mécaniques sur les noyaux droits ont été contre-colorées avec du dapi, qui apparaît bleu. Cet histogramme quantifie les résultats du transfert Western de trois expériences montrant que l’étirement mécanique augmente les niveaux de protéine C du tensioactif.

Dans cette expérience, le N est égal à trois et l’astérisque indique une valeur P inférieure à 0,05. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’accélérer les cellules pulmonaires fœtales et de les exposer à un étirement mécanique.