Un système expérimental pour étudier mécanotransduction dans les cellules des poumons du foetus

L'objectif de cette procédure est de décrire un système expérimental permettant d'étudier la transduction mécanique dans les cellules pulmonaires fœtales. Cela est réalisé en revêtant des plaques de culture avec des protéines de la matrice extracellulaire. Ensuite, les cellules épithéliales de type II du poumon de souris fœtale sont isolées, suivies de l'isolement des fibroblastes de souris fœtale.

La dernière étape décrit un système in vitro permettant d'appliquer une stimulation mécanique aux cellules pulmonaires. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus, montrant une augmentation de la différenciation des cellules de type deux par PCR en temps réel, par immunobuvardage (western blot) et par des images d'immunochimie en fluorescence. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanotransduction, telles que le développement pulmonaire fœtal et les lésions pulmonaires.

Le démonstrateur sera Julian Gu, un technicien de mon laboratoire. Tout en travaillant dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles, préparez 120 microgrammes de laminine avec 12 millilitres de PBS 1X froid et stérile par plaque. D'autres protéines de la matrice extracellulaire peuvent être utilisées pour le revêtement. Consultez le protocole écrit pour plus de détails, puis prenez une plaque BioFlex non traitée et ajoutez deux millilitres de la solution de laminine dans chaque puits, pour une concentration finale de deux microgrammes par centimètre carré.

Veillez à ce que les puits soient entièrement recouverts par la solution. Recouvrez complètement la plaque avec du film plastique et placez-la sur une surface plane à quatre degrés Celsius pendant la nuit pour permettre au revêtement de s'adsorber au fond des puits. Les plaques revêtues peuvent être conservées dans ces conditions pendant au moins une semaine tout en conservant une bonne fonction de la matrice extracellulaire le lendemain.

En conditions stériles, laver les puits trois fois avec un XPBS. Puis ajouter un millilitre de BSA à 1 % dans un XPBS à chacun. Incuber les puits à 37 degrés Celsius pendant une heure afin de bloquer les sites de fixation non spécifiques sur les membranes.

Ensuite, laver à nouveau les puits trois fois avec un XPBS. Pour éliminer les protéines non absorbées, ajouter un millilitre de DMEM dans chaque puits de la plaque. Puis conserver la plaque à 37 degrés Celsius jusqu'à ce que les cellules épithéliales de type II des poumons de rongeur fœtal soient isolées et prêtes à être mises en culture.

La veille du début de la procédure d'isolement cellulaire, monter les tamis en utilisant des mailles en nylon de 130 et 15 microns, puis les stériliser par autoclavage. Autoclaver également le même nombre de flacons en verre de 150 millilitres le jour de la culture. Obtenir des poumons fœtaux de souris gestante à jauge horaire au stade E 17 à 19 de la gestation.

Transférez le tissu dans un tube à centrifuger de 50 millilitres contenant le milieu DMEA et placez-le sur de la glace. Préparez un tampon de digestion frais dans un tube à centrifuger de 50 millilitres selon la recette indiquée dans le protocole écrit. Pendant que vous travaillez sous une hotte à flux laminaire, stérilisez par filtration à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron.

10 millilitres de ce tampon suffisent pour les tissus pulmonaires obtenus à partir d'environ 20 foetus de souris. Placer le tube conique contenant le tampon de digestion dans un bain-marie à 37 degrés Celsius. Aspirez le dium du tube conique contenant le tissu pulmonaire fœtal et transférez le tissu dans une boîte de Pétri stérile à l’aide de ciseaux stériles ou d’un rasoir, puis hachez le tissu en morceaux de moins d’un millimètre de taille.

Transférez ensuite le tissu dans le tube conique contenant le tampon de digestion préchauffé. Ensuite, facilitez mécaniquement la digestion du tissu en aspirant et en rejetant la suspension de cellules pulmonaires fœtales cent fois de haut en bas à l’aide de pipettes dont l’ouverture diminue progressivement. Une fois le processus de digestion terminé, centrifugez l’homogénat à 1 300 tr/min pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, retirez soigneusement le surnageant par aspiration et resuspendez le culot contenant les cellules dans 15 millilitres de DMEM supplémenté de 20 % de FBS. Ensuite, récupérez les tamis munis de mailles en nylon de 130 et 15 microns et placez-les au-dessus des béchers stériles de 150 millilitres. Déposez l'homogénat cellulaire sur la maille de 100 microns à l'aide d'une pipette.

Recueillir le filtrat et le transférer à la pipette sur le tamis de 30 microns. Rincer plusieurs fois le tamis de 30 microns avec du DMEM frais supplémenté de 10 % de SBF. La majorité des cellules de type deux s'agglomèrent et ne traversent pas le tamis.

Ces lavages éliminent les cellules non épithéliales qui pourraient être attachées aux agrégats. Appliquez le filtrat provenant du tamis de 30 microns sur le tamis de 15 microns. Procédez à nouveau à plusieurs lavages comme précédemment.

Cette étape permet de recruter les cellules de type deux qui ont pu traverser le tamis de 30 microns. Récupérez les cellules agrégées non filtrées provenant des tamis de 30 et de 15 microns pour une purification supplémentaire des cellules de type deux. Conservez le filtrat du tamis de 15 microns si vous prévoyez de cultiver des fibroblastes pulmonaires de rongeur fœtal.

Sinon, jetez ce filtrat. Ensuite, purifiez la population de cellules épithéliales de type deux en ajoutant du milieu et en incubant les cellules non filtrées provenant des coupelles en tamis de 30 et 15 micromètres dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés pendant 30 minutes. Après cette incubation, centrifugez le surnageant comme précédemment, décantez le culot cellulaire, puis resuspendez le culot dans deux millilitres de DMEM sans sérum. À l’aide d’une pipette, ajoutez un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits de plaques BioFlex à six puits revêtues de laminine. À ce stade, les cellules apparaissent groupées lorsqu’observées au microscope. Incubez la plaque dans une étuve à culture tissulaire réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Une incubation de 24 heures est optimale, et une incubation minimale de six heures est requise.

Avant de commencer les expériences de contrainte mécanique, prélevez le filtrat du tamis de 15 microns et transférez-le dans un flacon de culture tissulaire de 75 centimètres carrés à 37 degrés Celsius pendant 30 à 60 minutes afin de permettre l'adhésion des fibroblastes, aspirez puis jetez le surnageant. Remplacez ensuite le volume dans le flacon par du DMEM sans sérum et incubez toute la nuit. Le jour suivant, récoltez les cellules avec une solution de trypsine 0,25 % dans l'EDTA 0,4 millimolaire et ensemencez-les sur des plaques BioFlex revêtues de fibronectine ; incubez-les dans une étuve à culture tissulaire réglée à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, idéalement pendant 24 heures avant de commencer les expériences de contrainte mécanique.

Une incubation d'au moins six heures est requise si un nombre spécifique de cellules est nécessaire pour les expériences. Les cellules de type deux sont maintenues en flacons DMEM sans sérum de 75 centimètres carrés après leur isolement, et le jour suivant, les cellules sont trypsinisées, comptées, puis semées. La monocouche ne doit pas dépasser 80 % de confluence avant le début des expériences. Le jour de l'expérience de stimulation mécanique, le milieu de culture cellulaire est remplacé par deux millilitres de DMEM frais sans sérum par puits, puis la plaque est montée dans une unité de contrainte Flexcell FX 5,000.

Ensuite, appliquez une déformation biaxiale EQU aux membranes. Le régime de déformation varie selon la simulation des forces mécaniques in vivo. Comme indiqué dans le protocole écrit, les cellules cultivées sur des membranes non-ST étirées.

Des cultures parallèles sont utilisées comme témoins pour l'expérience. À la fin de l'expérience, les monocouches peuvent être traitées afin d'analyser les modifications de l'expression génique par PCR en temps réel ou les variations de l'abondance protéique par immunobuvardage. En outre, les monocouches peuvent être fixées pour des expériences d'immunochimie utilisant cette technique.

Après fixation, les membranes élastiques sont découpées dans les plaques et montées sur des lames de verre à l’aide de 10 à 20 microlitres d’eau comme agent de montage, avant perméabilisation et incubation avec des anticorps. Les surnageants provenant de l’expérience peuvent également être utilisés pour étudier la présence de substances libérées, telles que des facteurs de croissance ou des cytokines. Cette image montre des cellules épithéliales fœtales de type II à E18, fixées de façon parmal, isolées selon ce protocole et mises en culture sur des plaques BioFlex revêtues de laminine.

Les cellules ont été fixées et la photographie a été prise. Le jour suivant, les cellules non étirées selon le protocole ST ont été ensemencées. La pureté des cellules a été déterminée à 90 ± 5 % par analyse microscopique de la morphologie des cellules épithéliales et par immunomarquage de la protéine C du surfactant. Les figures suivantes présentent des données provenant de cellules épithéliales fœtales de type II qui ont été exposées à une contrainte cyclique de 5 % à raison de 40 cycles par minute pendant 16 heures.

Ce northern blot d'expression de l'ARNm de la protéine C du surfactant illustre que la contrainte mécanique induit la différenciation des cellules de type II sur différents substrats de matrice extracellulaire. Les signes plus et moins représentent respectivement l'exposition ou l'absence d'exposition à la contrainte. Les données d'expression sont présentées dans l'histogramme sous forme de moyenne ± erreur type de la moyenne (ETM), avec N = 3, et l'astérisque indique une valeur P inférieure à 0,05.

Ces images d'immunohistochimie en fluorescence montrent les niveaux de la protéine C du surfactant en vert. À gauche, des cellules fœtales de type II non exposées à une contrainte mécanique, et à droite exposées à une contrainte mécanique ; les noyaux ont été contre-colorés au DAPI, qui apparaît en bleu. Cet histogramme quantifie les résultats de western blot provenant de trois expériences, montrant que l'étirement mécanique augmente les niveaux de la protéine C du surfactant.

Dans cette expérience, N est égal à trois et l'astérisque indique une valeur P inférieure à 0,05. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment accélérer les cellules pulmonaires fœtales et les exposer à une extension mécanique.