Name: Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours Drosophila Embryogenèse (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Découvrez l'imagerie en direct du dédouanement cellulaire apoptotique chez les embryons de Drosophila. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour visualiser la phagocytose et améliorer la compréhension des processus de biologie cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par une réintégration Marie Curie Grant (IRG249084). Nous remercions tous les membres du laboratoire Kurant.

Pour suivre la dynamique de l&#39;élimination des cellules apoptotiques in vivo deux populations de cellules doivent être étiquetés: les cellules phagocytaires et les cellules apoptotiques. Pour marquer des populations de cellules phagocytaires nous utilisons une ligne Drosophila contenant le marqueur simu-cytGFP, qui marque les cellules phagocytaires exclusivement dans l&#39;embryon: les macrophages, les cellules gliales et de l&#39;ectoderme 8. On peut utiliser différents marqueurs pour les cellules phagocytaires, y compris les lignes contenant un pilote Gal4 hemocyte spécifique (CRQ-Gal4) ou des cellules gliales spécifique Gal4 conducteur (repo-Gal4) et un rapporteur fluorescent génétiquement codés sous contrôle UAS (UAS-GFP). Pour surveiller les cellules apoptotiques au moment du dédouanement des cellules apoptotiques, nous utilisons différents apoptose / marqueurs de phagocytose. Annexine V (Molecular Probes) sert de marqueur précoce des cellules apoptotiques 10; Phiphilux (OncoImmunin) est un fluorogène substrat caspase-3, qui est utilisé comme un apopto tardsis marqueur, et Lysotracker (Molecular Probes) fonctionne comme un marqueur phagosome. Nous injectons ces réactifs en utilisant le système de micro-injection PicoPump PV 820. 1. Préparatifs <ol><li> Colle Heptane: Déroulez ruban adhésif double face et de mettre autant que vous le pouvez dans un flacon à scintillation, remplissez avec de l&#39;heptane, sceller la fiole avec du Parafilm et le rock pendant 24 heures. Ajouter heptane si la colle est trop épaisse. </li><li> Nous permettons aux mouches pondent sur une plaque préchauffée jus de raisin agar + levure collez pendant 2 heures, puis de transférer la plaque à 25 ° C pendant 10-12 heures (selon le stade désiré) avant la micro-injection et l&#39;heure des enregistrements de déchéance des embryons injectés. Nous recueillons des embryons à partir des plaques d&#39;agar maintenue à 25 ° C, fournissant ainsi des embryons de stade 15 ou 16 du développement. </li><li> préparation de l&#39;aiguille: Pour préparer aiguilles pour injection, nous utilisons un «instrument Sutter &#39;extracteur d&#39;aiguilles et minces filaments de verre à parois (tube capillaire FHC). La pointe du capillaire commun est rompun d&#39;un diamètre de 0,5 à 2 um. </li><li> Lamelle avec de la colle: En utilisant une pointe de pipette disperser une goutte de colle à l&#39;heptane en une ligne au milieu de la lamelle. Laissez sécher pendant quelques secondes. Préparer un peu de ces lamelles. </li></ol> 2. Préparation embryon <ol><li> Recueillir des embryons à partir de plaques d&#39;agar et de les transférer à un tamis cellulaire (SPL sciences de la vie) à l&#39;aide d&#39;un pinceau propre et l&#39;eau courante. La crépine est maintenue sur un gobelet à recueillir les eaux usées. </li><li> Lavez embryons dans la passoire de la cellule avec de l&#39;eau jusqu&#39;à ce que toute la pâte de levure est enlevée. </li><li> Sécher l&#39;excès d&#39;eau en l&#39;essuyant à l&#39;extérieur du filtre à l&#39;aide Kimwipes. </li><li> Placez le tamis cellulaire dans une boîte de Petri propre et ajouter suffisamment d&#39;eau de Javel à 50% pour couvrir les embryons dans le tamis cellulaire. Dechorionate les embryons pendant 2 min de temps en temps (2-3 fois) les remuant. </li><li> Rincez abondamment avec de l&#39;eau jusqu&#39;à ce que les embryons en vrac l&#39;odeur d&#39;eau de Javel. </li><li> Placez le tamis cellulaire dans un récipient propreBoîte de Pétri et couvrir les embryons avec de l&#39;eau pour éviter le dessèchement haut. </li><li> Avant de commencer réglage des embryons, charger 1 pl du réactif désiré en deux aiguilles (parfois une aiguille peut être bouchée). Il faut environ cinq minutes pour que le liquide atteigne la pointe de l&#39;aiguille. </li><li> Coupez un morceau rectangulaire d&#39;agar jus de raisin et le placer sur une lame de microscope. Transfert d&#39;embryons dechorionated de la boîte de Pétri à la pièce de gélose à l&#39;aide d&#39;un pinceau propre. </li><li> Sous un microscope de dissection fluorescent sélectionner correctement mis en scène embryons exprimant le marqueur GFP en utilisant un pinceau humide et placez chaque embryon près du bord de la pièce d&#39;agar-agar dans une rangée un après l&#39;autre (figure 1A). Les embryons doivent être placés avec leur face ventrale de la phagocytose d&#39;imagerie par les cellules gliales dans le système nerveux central (SNC). </li><li> Mettre en place environ 10 embryons dans une rangée. </li><li> Attacher les embryons à une lamelle recouverte au milieu d&#39;une bande de colle heptane (figure 1B, C </strong&gt;). </li><li> Placez la lamelle dans la chambre de déshydratation pendant environ 5 minutes (cela dépend de l&#39;humidité de la pièce et la quantité à injecter). </li><li> Après séchage jusqu&#39;à couvrir les embryons avec de l&#39;huile d&#39;halocarbures 700 (Sigma) pour éviter une déshydratation. </li><li> Placer la lamelle couvre-objet sur une lame de microscope, avec des embryons vers le haut. Vous pouvez mettre une goutte d&#39;eau sur la lame pour empêcher le déplacement de la lamelle. Les embryons sont maintenant prêtes pour l&#39;injection. emplacement d&#39;injection est typiquement sur le côté latéral au milieu de l&#39;embryon. </li></ol> 3. Injection d&#39;embryons <ol><li> Fixer l&#39;aiguille à un micromanipulateur. </li><li> Pour briser la pointe de l&#39;aiguille mis au bord de la lamelle dans le champ de vision et d&#39;ajuster l&#39;aiguille au même plan focal. Très déplacer soigneusement la lamelle jusqu&#39;à ce qu&#39;elle touche le bout de l&#39;aiguille et la casse. </li><li> En se concentrant sur les embryons, placez l&#39;aiguille dans le pétrole et vous assurer d&#39;obtenir une goutte de liquide à partir de l&#39;aiguille. Cela signifie que la pointe de l&#39;aiguille a étébien cassé. </li><li> En évitant de toucher le support d&#39;aiguille déplace l&#39;embryon dans l&#39;aiguille et injecter une goutte dans l&#39;embryon. Déplacer l&#39;embryon loin et passer à la suivante jusqu&#39;à ce que tous les embryons sont injectés. </li></ol> 4. Imaging Nous avons l&#39;image des embryons sur un microscope confocal inversé avec un objectif 40X ou 100X. Nous recherchons un embryon bien positionné avec le CNS dans le milieu, ce qui montre l&#39;expression de la GFP solide et un bon étiquetage des cellules apoptotiques après l&#39;injection. Pour le temps des enregistrements de déchéance d&#39;embryons vivants, nous choisissons généralement 5 ou 6 tranches confocale (2 um d&#39;épaisseur chacune). Ensuite, nous faisons une projection de 3 tranches (6 um d&#39;épaisseur) afin d&#39;observer des cellules entières. Nous utilisons des marqueurs pour les cellules apoptotiques qui sont stables et ne blanchissent pas facilement. Pour éviter GFP blanchiment nous faire des enregistrements à des intervalles de 60 sec. Dans certains cas, les embryons peuvent commencer à roulerpendant le temps d&#39;enregistrement vidéo. Par conséquent, nous prenons un coup d&#39;œil de temps en temps à l&#39;enregistrement afin d&#39;arrêter et recommencer si nécessaire.

<ol><li>Kinchen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+to+die+for%3A+signaling+to+apoptotic+cell+removal+in+worm%2C+fly+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse.</a> Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosome+maturation%3A+going+through+the+acid+test%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosome maturation: going through the acid test.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).</li>
<li>Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytic+signaling%3A+you+can+touch%2C+but+you+can%27t+eat%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagocytic signaling: you can touch, but you can't eat.</a> Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).</li>
<li>Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagocytosis%3A+elegant+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Phagocytosis: elegant complexity.</a> Immunity. 22, 539-550 (2005).</li>
<li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+apoptotic+cells%3A+getting+rid+of+the+corpses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li>
<li>Henson, P. M., Hume, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+cell+removal+in+development+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis.</a> Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).</li>
<li>Kurant, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+CNS+clear%3A+glial+phagocytic+functions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila.</a> Glia. 59, 1304-1311 (2011).</li>
<li>Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six-microns-under+acts+upstream+of+Draper+in+the+glial+phagocytosis+of+apoptotic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons.</a> Cell. 133, 498-509 (2008).</li>
<li>Mergliano, J., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-independent+cell+engulfment+mirrors+cell+death+pattern+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos.</a> Development. 130, 5779-5789 (2003).</li>
<li>van den Eijnde, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+exposure+of+phosphatidylserine+during+apoptosis+is+phylogenetically+conserved%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved.</a> Apoptosis. 3, 9-16 (1998).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils n&#39;ont aucun intérêt financier concurrents.

Clairance cellulaire par apoptose est une dernière étape critique de l&#39;apoptose, qui est hautement dynamique. Par conséquent études en temps réel du processus sont d&#39;une importance capitale. Nous décrivons ici un protocole qui permet la surveillance de la clairance des cellules apoptotiques dans le développement des embryons de drosophile vivre. Dans cette procédure, deux populations de cellules doivent être marqués à l&#39;aide de marqueurs spécifiques: les cellules apoptotiques et les phagocytes. Le j...

L&#39;élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure est crucial pour le développement embryonnaire ainsi que pour l&#39;homéostasie tissulaire chez l&#39;adulte. Phagocytose des cellules apoptotiques ou l&#39;autorisation cellulaire par apoptose est un processus très dynamique qui se déroule en quatre étapes: (1) le recrutement de phagocytes à la cellule apoptotique («Trouvez-moi»), (2) la reconnaissance de la cellule comme une cible pour la phagocytose ( «eat-me») et (3) l&#39;engloutissement, suivi par (4) maturation du phagosome et de la dégradation de la particule apoptotique 1-5. Il existe deux types de phagocytes: macrophages «professionnels» et les cellules dendritiques immatures, et le «non-professionnels» les cellules voisines tissu-résidents, qui sont cruciales pour le dédouanement des cellules apoptotiques pendant métazoaires développement 6,7. En développement chez la drosophile, l&#39;élimination des cellules superflues par apoptose se produit dans trois mphases Ain, d&#39;abord dans le milieu à la fin embryon, puis au milieu chrysalide, puis de nouveau au début des adultes. Au cours de l&#39;embryogenèse particules apoptotiques sont éliminés par les phagocytes «professionnels», les macrophages et les cellules gliales par ectoderme et 8,9 «non-professionnel». Dans nos précédents travaux, nous avons identifié un récepteur phagocytaire, Six-microns-sous (SIMU), qui est exprimé exclusivement dans les cellules phagocytaires cours de l&#39;embryogenèse. En utilisant le promoteur simulation, nous avons généré un marqueur spécifique des populations de cellules phagocytaires (simu-cytGFP) qui nous permet de suivre les macrophages, les cellules gliales ectoderme et simultanément dans un embryon en développement Live 8. En outre, en utilisant des marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques dans les différentes étapes de l&#39;apoptose, nous sommes en mesure de suivre la dynamique de dégagement cellulaire par apoptose in vivo.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><fort>Réactif</fort></td></tr><tr><td>Annexine V </td><td>Sondes moléculaires</td><td>A35108</td><td></td></tr><tr><td>PhiPhiLux G2D2</td><td>OncoImmunin</td><td>A304R2G-5</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>LysoTracker</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’halocarbure 700</td><td>Sigma</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Material</td></tr><tr><td>Tube capillaire</td><td>FHC</td><td>30-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Crépine à cellules</td><td>SPL</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Pinceau</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; drosophila</em&gt; embryogenèse

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

L&#39;élimination correcte des cellules indésirables ou aberrante par apoptose et la phagocytose ultérieure (clairance cellulaire par apoptose) est cruciale pour le développement normal chez tous les organismes pluricellulaires. Clairance cellulaire par apoptose est un processus hautement dynamique, intimement associée à la mort cellulaire, les cellules apoptotiques unengulfed sont à peine vus in vivo dans des conditions normales. Afin de comprendre les différentes étapes de dégagement des cellules apoptotiques et de comparer les phagocytes «professionnels» - les macrophages et les cellules dendritiques de «non-professionnel» - cellules voisines tissu-résidents, l&#39;imagerie in vivo en direct du processus est extrêmement précieux. Ici, nous décrivons un protocole pour l&#39;étude de clairance des cellules apoptotiques dans les embryons de drosophile en direct. Pour suivre la dynamique des différentes étapes de la phagocytose que nous utilisons marqueurs spécifiques des cellules apoptotiques et les phagocytes. En outre, nous pouvons surveiller deux systèmes phagocyte en parallèle: les macrophages «professionnels» et «semi-profeglie ssional »dans le système nerveux central en développement (SNC). La méthode décrite ici utilise l&#39;embryon de drosophile comme un excellent modèle pour l&#39;étude en temps réel de la clairance des cellules apoptotiques.

images représentatives d&#39;un film dans lequel les cellules apoptotiques sont étiquetés avec l&#39;annexine V et cellules gliales, ectoderme et les macrophages sont étiquetés avec simu-cytGFP sont présentés dans la figure 2. Chaque image est une projection de 3 tranches de 2 um chacun. L&#39;embryon de l&#39;étape 15 est correctement positionné montrant le SNC embryonnaire dans le milieu de la glie bien étiquetés (g). Macrophages (M), qui sont pour la plupart à l&...

Nous décrivons ici une méthode efficace pour étudier la dynamique de la clairance des cellules apoptotiques<em&gt; In vivo</em&gt;. Cette méthode emploie vivre<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons comme un modèle puissant pour la surveillance phagocytose des cellules apoptotiques en utilisant un marquage spécifique des cellules apoptotiques et les phagocytes.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryogenèse

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

L'objectif général de cette procédure est de suivre la dynamique de l'élimination des cellules apoptotiques dans l'embryon de drosophile. Cela est réalisé à l'aide de mouches transgéniques contenant un marqueur GFP cytoplasmique, qui étiquette les populations de cellules phagocytaires. Les embryons portant le marqueur GFP Simio sont collectés, lavés et recouverts. Ensuite, les embryons sont positionnés pour injection, puis le système nerveux central est surveillé.La troisième étape consiste à marquer les cellules apoptotiques en injectant dans les embryons des marqueurs spécifiques de la phagocytose de l'apoptose, tels qu'un X sur cinq, la dernière étape étant d'effectuer des enregistrements en lapse de temps du SNC embryonnaire à l'aide d'une microscopie confocale. En définitive, les résultats peuvent montrer la localisation et le comportement des cellules apoptotiques et des phagocytes au cours des différentes étapes de l'élimination des cellules apoptotiques par microscopie confocale en fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme l'immunohistochimie sur des embryons fixés, est que nous pouvons suivre la dynamique de l'élimination des cellules apoptotiques.L'élimination des cellules apoptotiques est un processus hautement dynamique comprenant diverses étapes. Cette technique permet de suivre les différentes étapes à l'aide de marqueurs spécifiques pour les cellules apoptotiques et les phagocytes. Le protocole commence par la préparation d'un adhésif à partir de réactifs classiques : déroulez un ruban adhésif double face, puis roulez-le à nouveau pour l'insérer dans un flacon de scintillation.Remplissez le flacon avec de l'heptane et scellez-le avec du parafilm. Ensuite, fixez le flacon à un agitateur rotatif et faites-le osciller doucement pendant 24 heures. À température ambiante, le lendemain, la colle préparée est transférée dans un nouveau flacon.Utilisez une pipette en verre pour transférer la colle préparée vers un nouveau fichier. Une fois préparée, utilisez une pointe de pipette pour appliquer la colle sur les lamelles. Répartissez une goutte de colle à l'heptane en une ligne au milieu de la lamelle.Laisser sécher la colle pendant quelques secondes. Les lamelles peuvent ensuite être conservées à température ambiante dans une boîte fermée pendant jusqu'à un mois après avoir anesthésié les mouches au dioxyde de carbone. Rassembler environ 400 mouches dans un récipient de collecte avec une plaque de ponte au jus de raisin réchauffée, placée à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Récupérer la plaque de ponte au jus de raisin et couvrir le récipient avec une nouvelle plaque pour maintenir les mouches en bon état.La plaque recueillie contient des embryons âgés de zéro à deux heures. Remettez la plaque de jus de raisin contenant les embryons dans un incubateur à 25 degrés Celsius jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de développement souhaité. Dans cet exemple, les embryons sont incubés entre 10 et 12 heures, de sorte qu'ils parviennent au stade 15 ou 16 après leur développement.Utilisez de l'eau du robinet et un pinceau propre pour transférer les embryons de la plaque vers un filtre à cellules. Maintenez le filtre au-dessus d'un récipient afin de récupérer tout embryon qui pourrait être renversé. Rincez les embryons recueillis jusqu'à ce que toute la pâte de levure soit éliminée.Ensuite, retirez l'excès d'eau en essuyant l'extérieur du tamis. Placez le tamis à cellules dans une boîte de Pétri propre pour éliminer suffisamment la corona. Ajoutez de l'eau de javel à 50 % pour recouvrir les embryons dans le tamis à cellules et laissez agir deux minutes, en remuant deux à trois fois.Ensuite, rincez soigneusement les embryons jusqu'à ce qu'ils n'aient plus l'odeur de l'eau de Javel. Placez les embryons contenus dans la cellule dans une boîte de Pétri propre et recouvrez-les d'eau pour éviter qu'ils ne s'assèchent. Pour l'injection des embryons.Préparez à l'avance les aiguilles d'injection à l'aide d'un tireur d'aiguilles et de filaments en verre à paroi mince. Chargez un microlitre du réactif souhaité dans deux aiguilles, l'une servant de secours. Un marqueur stable qui ne s'estompe pas facilement, tel qu'un X en cinq, constitue un bon réactif.Placez maintenant un morceau rectangulaire d'agar au jus de raisin sur une lame de microscope et transférez les embryons depuis le tamis vers l'agar. À l'aide d'un pinceau propre et sous un microscope stéréoscopique à fluorescence, sélectionnez les embryons correctement stagés pour l'injection en utilisant le marqueur GFP.À l’aide d’un pinceau humide, déplacer les embryons sélectionnés en une rangée de 10, avec leur face ventrale vers le haut. Placer cette rangée au bord du bloc d’agarose. On peut observer la GFP dans le système nerveux central de l’embryon.Fixez maintenant les embryons sur une lame à l’aide d’une bande de colle à l’heptane. La position correcte des embryons est très importante pour la réussite de l’injection. Prenez votre temps et assurez-vous que les embryons soient alignés avec précision dans l’orientation appropriée.Ensuite, placez la lame couvre-objet dans la chambre de déshydratation pendant environ cinq minutes. Après avoir séché les embryons, recouvrez-les d'huile au carbone Hello 700 pour éviter une déshydratation supplémentaire. Enfin, déposez une goutte d'eau sur une lame de microscope.Ensuite, placez le bord du couvercle avec les embryons vers le haut sur la lame de microscope humide. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés. Commencez par fixer une aiguille à un micromanipulateur et à la pompe pico.La pompe contrôle la quantité de liquide injecté en poussant de l'azote dans l'aiguille. Une pédale commande l'éjection intermittente de l'azote sous le microscope. Mettez l'extrémité de l'aiguille au point et positionnez-la près du bord de la lame, en veillant très attentivement à ce que l'extrémité de l'aiguille et la lame soient bien au point.Déplacez la lamelle jusqu'à ce qu'elle touche la pointe de l'aiguille et la casse. Le diamètre de l'ouverture doit être compris entre un demi et deux micromètres. Mettez maintenant au point les embryons.Introduisez l'aiguille dans l'huile. Si la pointe de l'aiguille a été correctement cassée, une goutte de liquide doit s'écouler dans l'huile. Lorsque vous appuyez sur la pédale sans toucher le porte-aiguille, déplacez la platine de manière à ce que le bord latéral de l'embryon soit transpercé par l'aiguille.Injectez rapidement une goutte de solution dans l'embryon. Éloignez l'embryon et passez au suivant jusqu'à ce que les 10 embryons soient injectés. Observez les embryons au microscope confocal inversé avec un objectif 40 x ou 100 x.Recherchez un embryon bien positionné avec le SNC au centre, présentant une forte expression de la GFP et une marquage des cellules apoptotiques. Pour effectuer des enregistrements en lapso-temporel, choisissez cinq ou six coupes confocales à fixer au micromètre à ces emplacements. Effectuez une numérisation toutes les 60 secondes, un intervalle pour lequel le photoblanchiment de la GFP ne devrait pas poser de problème.Ensuite, réalisez une projection de trois coupes d'une épaisseur de six micromètres afin d'observer l'ensemble des cellules. Dans certains cas, un embryon peut commencer à rouler pendant l'enregistrement vidéo. Surveillez donc l'enregistrement pour ne pas perdre de temps avec des embryons en mouvement.Un embryon au stade 15 correctement positionné montre le SNC embryonnaire au centre, avec des cellules gliales bien étiquetées marquées par un macrophage g M, qui se trouvent principalement à l'extérieur du SNC. Expression cytoplasmique forte de la GFP. Les cellules ectodermiques E sont également marquées par la GFP cytoplasmique.Ces images montrent des cellules apoptotiques marquées avec un ex in five et l’ectoderme et les macrophages marqués avec cite GFP. Chaque image est une projection de trois coupes, chaque coupe ayant une épaisseur de deux micromètres. De nombreuses cellules positives pour ex in five se trouvent à l’intérieur et à l’extérieur du SNC.L'événement encadré montre une cellule gliale en train d'ingérer une particule apoptotique. Remarquez le comportement exploratoire de la cellule gliale. Elle touche la particule apoptotique plusieurs fois avant de s'engager dans l'ingestion de la cellule apoptotique après son développement.La technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l'élimination des cellules apoptotiques pour explorer la phagocytose des cellules apoptotiques au cours du développement. En utilisant cette technique, nous pouvons étudier le comportement hautement dynamique de l'élimination des cellules apoptotiques.

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La microscopie à fluorescence à base de feuilles de lumière est l’outil le plus précieux en biologie du développement. Un problème majeur dans les études comparatives est la variance ambiante. Notre protocole décrit un cadre expérimental pour l’imagerie en direct simultanée de plusieurs spécimens et, par conséquent, aborde cette question de manière proactive.

Imagerie en direct simultanée d’embryons d’insectes multiples dans des microscopes à fluorescence à feuille de lumière à base de chambre d’échantillonnage

Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Découvrez l'imagerie en direct du dédouanement cellulaire apoptotique chez les embryons de Drosophila. Cette méthode utilise la microscopie confocale pour visualiser la phagocytose et améliorer la compréhension des processus de biologie cellulaire.

Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours

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