Vivre imagerie de dédouanement cellulaire par apoptose au cours Drosophila Embryogenèse

L’objectif global de cette procédure est de suivre la dynamique de la clairance cellulaire apoptotique dans l’embryon de drosophile. Ceci est accompli avec des mouches transgéniques contenant un marqueur cytoplasmique GFP, qui marque les populations de cellules phagocytaires Les embryons avec le marqueur Simio GFP sont collectés, lavés et enrobés. Ensuite, les embryons sont positionnés pour l’injection, suivie d’une surveillance du SNC.

La troisième étape est le marquage des cellules apoptotiques en injectant aux embryons des marqueurs spécifiques de phagocytose de l’apoptose, tels qu’un X sur cinq, la dernière étape consiste à faire des enregistrements en accéléré du SNC embryonnaire à l’aide de la microscopie confocale. En fin de compte, les résultats peuvent montrer la localisation et le comportement des cellules apoptotiques et des phagocytes au cours des différentes étapes de l’élimination des cellules apoptotiques grâce à la microscopie confocale à fluorescence. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme l’immunohistochimie sur des embryons fixes est que nous pouvons suivre la dynamique de clairance des cellules apoptotiques.

L’élimination apoptotique des cellules est un processus hautement dynamique contenant diverses étapes. Cette technique permet de suivre les différentes étapes à l’aide de marqueurs spécifiques pour les cellules apoptotiques et les phagocytes. Le protocole commence par la fabrication d’une colle à partir de réactifs conventionnels, déroule du ruban adhésif double face, puis l’enroule pour l’insérer dans un flacon à scintillation.

Remplissez le flacon d’heptane et scellez-le avec param. Fixez ensuite le flacon à un tater de noix et balancez-le doucement pendant 24 heures. À température ambiante, le lendemain, la colle préparée est transférée dans un nouveau flacon.

Utilisez un verre PEs votre pipette pour transférer la colle préparée dans un nouveau fichier. Une fois préparé, utilisez une pointe de pipette pour appliquer la colle sur les lamelles. Dispersez une goutte de colle heptane en une ligne au milieu de la lamelle.

Laissez la colle essayer pendant quelques secondes. Les lamelles peuvent ensuite être conservées à température ambiante dans une boîte fermée jusqu’à un mois après avoir anesthésié les mouches avec du dioxyde de carbone Pool environ 400 mouches dans un récipient de collecte avec une plaque de pose de jus de raisin réchauffée remplacée à 25 degrés Celsius pendant deux heures. Récupérez la plaque de ponte de jus de raisin et couvrez le récipient avec une nouvelle plaque pour garder les mouches heureuses.

La plaque collectée contient des embryons âgés de zéro à deux heures. Remettez la plaque de ponte de jus de raisin collectée avec les embryons dans un incubateur à 25 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils atteignent le point de développement souhaité. Dans cet exemple, les embryons sont incubés entre 10 et 12 heures, de sorte qu’ils se développent au stade 15 ou 16 après leur développement.

Utilisez de l’eau du robinet et un pinceau propre pour transférer les embryons de la plaque dans une cellule. Filtre. Gardez la passoire au-dessus d’un récipient afin que les embryons qui se déversent puissent être récupérés. Rincez les embryons collectés jusqu’à ce que toute la pâte de levure soit éliminée.

Séchez ensuite l’excès d’eau en essuyant l’extérieur de la passoire. Placez la passoire cellulaire dans une boîte de Pétri propre pour retirer le corion suffisamment. Blanchissez à 50 % pour couvrir les embryons dans la passoire cellulaire et attendez deux minutes en les remuant deux à trois fois.

Ensuite, rincez les embryons jusqu’à ce qu’ils ne sentent plus l’eau de Javel. Placez les embryons dans le récipient cellulaire dans une boîte de Pétri propre et couvrez-les d’eau pour éviter qu’ils ne se dessèchent. Pour l’injection des embryons.

Préparez les aiguilles d’injection à l’avance à l’aide d’un extracteur d’aiguille et de filaments de verre à paroi mince. Chargez un microlitre du réactif souhaité dans deux aiguilles, une aiguille servant de sauvegarde. Un marqueur stable qui ne blanchit pas facilement, comme un X sur cinq, fait un bon réactif.

Placez maintenant un morceau rectangulaire de gélose au jus de raisin sur un microscope. Faites glisser et transférez les embryons de la passoire à la gélose. À l’aide d’un pinceau propre sous un microscope à dissection fluorescente, sélectionnez les embryons correctement stagés pour l’injection à l’aide du marqueur GFP.

À l’aide d’un pinceau humide, déplacez les embryons sélectionnés en une rangée de 10 avec le côté ventral vers le haut. Positionnez le rang au bord du bloc agro. La GFP peut être observée dans le système nerveux central de l’embryon.

Fixez maintenant les embryons à une lamelle avec une bande de colle heptane. La bonne position des embryons est très importante pour le succès de l’injection. Prenez votre temps et assurez-vous que les embryons sont alignés avec précision dans la bonne orientation.

Ensuite, placez la lamelle dans la chambre de déshydratation pendant environ cinq minutes. Après avoir séché les embryons, couvrez-les d’huile de carbone Hello carbon oil 700 pour éviter une déshydratation supplémentaire. Enfin, placez une goutte d’eau sur une lame de microscope.

Ensuite, placez la lèvre de couverture avec les embryons sur la lame de microscope humide. Les embryons sont maintenant prêts à être injectés. Commencez par attacher une aiguille à un manipulateur microm et à la pompe pico.

La pompe contrôle la quantité de liquide injecté en poussant l’azote dans l’aiguille. Une pédale commande l’éjection de l’azote au microscope. Concentrez-vous sur la pointe de l’aiguille et positionnez-la près du bord de la lamelle avec la pointe de l’aiguille et la lamelle très soigneusement.

Déplacez la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche la pointe de l’aiguille et la brise. Le diamètre de l’ouverture doit être d’un demi-mètre à deux micromètres. Concentrez-vous maintenant sur les embryons.

Introduisez l’aiguille dans l’huile. Si la pointe de l’aiguille a été correctement cassée, il doit y avoir une goutte de liquide qui s’écoule dans l’huile. Lorsque vous appuyez sur la pédale sans toucher le porte-aiguille, déplacez la platine de manière à ce que le bord latéral de l’embryon soit percé par l’aiguille.

Injectez rapidement une goutte de solution dans l’embryon. Éloignez l’embryon et passez au suivant jusqu’à ce que les 10 embryons soient injectés. Imagez les embryons à l’aide d’un microscope confocal inversé avec un objectif 40 x ou 100 x.

Recherchez un embryon bien positionné avec le SNC au milieu, montrant une forte expression de GFP et un marquage des cellules apoptotiques. Pour faire des enregistrements en accéléré, choisissez cinq ou six coupes confocales à bâtonnet micron à ces endroits. Faites un balayage toutes les 60 secondes, un intervalle auquel le blanchiment de la GFP ne devrait pas être un problème.

Ensuite, faites une projection de trois tranches de six microns d’épaisseur pour observer l’ensemble des cellules. Dans certains cas, un embryon peut commencer à rouler pendant l’enregistrement vidéo. Par conséquent, surveillez l’enregistrement afin de ne pas perdre de temps à déplacer les embryons.

Un embryon de stade 15 correctement positionné montre le SNC embryonnaire au milieu avec une glie bien marquée marquée par un g macrophages M, qui sont pour la plupart à l’extérieur du spectacle du SNC. Forte expression cytoplasmique de la GFP. Les cellules ectodermiques E sont également marquées par la GFP cytoplasmique.

Ces cadres montrent des cellules apoptotiques marquées avec un ex sur cinq et un ectoderme et des macrophages marqués avec cite GFP. Chaque image est une projection de trois tranches et chaque tranche a une épaisseur de deux microns. De nombreux ex sur cinq cellules positives sont à l’intérieur et à l’extérieur du SNC.

L’événement encadré montre une cellule gliale engloutissant une particule apoptotique. Notez le comportement de sondage de la cellule gliale. Il touche la particule apoptotique à quelques reprises avant de s’engager dans l’engloutissement de la cellule apoptotique après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la clairance des cellules apoptotiques pour explorer la phagocytose des cellules apoptotiques au cours du développement. En utilisant cette technique, nous pouvons explorer le comportement hautement dynamique de la clairance cellulaire apoptotique.