Reconstitution de β-caténine dégradation dans Xenopus Extrait des oeufs

Un procédé est décrit pour l'analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d'oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines.

L’objectif global de l’expérience suivante est d’utiliser le système d’extrait d’œuf de xénope biochimique acellulaire pour analyser la bêta-catine dans le chiffre d’affaires. Ceci est réalisé en ajoutant d’abord et/ou en épuisant les effecteurs suspects à l’extrait d’œuf xip activé afin d’identifier les modulateurs du renouvellement de la bêta-caténine comme une deuxième étape exogène in vitro, transcrit et traduit la bêta-caténine, soit radiomarquée avec S 35, soit fusionnée avec la luciférase est ajoutée à l’extrait d’œuf XUS, qui est activement dégradé dans les conditions natives. Ensuite, collectez des points temporels afin d’évaluer les changements dans les niveaux de bêta-katine et de protéines au fil du temps.

On obtient des résultats qui montrent si une modulation particulière de l’extrait d’œuf de xénope augmente ou diminue les taux de bêta-catine et de dégradation sur la base de l’autoradiographie et/ou de la détection de la luminescence. L’avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que les expériences de chasse d’impulsion ou de poursuite de heide cyclique dans des cellules cultivées, est que l’extrait d’œuf de xénope fournit un système biochimique acellulaire dans lequel on peut analyser la régulation des protéines au niveau des protéines, et il n’a pas la complexité supplémentaire de la transcription active. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la transduction du signal en identifiant les régulateurs des protéines de signalisation clés telles que la bêta-catina.

Travailler avec de l’extrait de xénope permet à l’utilisateur d’épuiser facilement les composants d’une voie et d’ajouter une quantité définie d’une protéine. Pour déterminer ses effets dépendants de la dose, utilisez de l’extrait d’œuf XUS fraîchement préparé ou décongelez-le rapidement, l’extrait congelé et placez-le sur de la glace. Effectuez toutes les manipulations à froid, préparez des billes d’anticorps ou d’affinité granulées à un 10ème du volume de l’extrait afin de minimiser la dilution de l’extrait, prélevez le plus de liquide possible des billes avant l’ajout de l’extrait.

À l’aide d’embouts de chargement de gel à longues extrémités effilées, l’extrait est ici ajouté à la résine de liaison GST. Faites pivoter le mélange de billes d’extraction à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, faites tourner le mélange de billes d’extraction à 12 600 G dans une micro-fuge à quatre degrés Celsius pendant 30 secondes.

En prenant soin de ne pas transférer de perles avec l’extrait. Transférez l’extrait épuisé dans un tube de micro-fuge frais sur de la glace. Confirmer l’efficacité de l’appauvrissement par immuno-transfert, à la fois l’extrait appauvri et les billes.

Parce que T et la dégradation dépendent de l’énergie, elles épuisent rapidement les réserves endogènes de A TP. Par conséquent, afin de maintenir une dégradation robuste de la T, vous devez utiliser un mélange de régénération d’énergie. Préparez un mélange de 20 fois régénération d’énergie ou RE comme détaillé dans le protocole de texte.

Décongelez rapidement l’extrait d’œuf d’opus en frottant le tube congelé entre les mains. Placez le tube sur de la glace juste avant que tout l’extrait n’ait fondu. Ajouter 10 microlitres de régénération d’énergie.

Mélanger dans une aliquote d’extrait d’œuf de xénope. Mélangez soigneusement en effleurant rapidement le tube et le tourbillon d’impulsion de rotation, et placez immédiatement sur de la glace. Aliquote les volumes appropriés pour l’essai de dégradation dans des tubes de micro-fuge pré-réfrigérés sur de la glace.

Pour vous préparer aux tests de bêta-caténine radiomarquée et de dégradation, prélevez deux à cinq microlitres d’extrait pour chaque point temporel afin d’effectuer le test de dégradation de la bêta-caténine radio-marquée dans l’extrait d’œuf XUS. Tout d’abord, préparez la bêta-caténine radiomarquée comme décrit dans le protocole texte. Ajoutez ensuite un à trois microlitres de bêta-caténine traduite in vitro à 20 microlitres de mélange réactionnel xip sur de la glace mélangée soigneusement par un rapide mouvement du tube et une courte impulsion de vortex.

Il s’agit d’une étape importante. Un extrait d’œuf XUS est très visqueux et un mélange incomplet affectera la consistance des résultats : pulsation, essorage et placement sur glace. Démarrez la réaction de dégradation de la bêta-caténine en déplaçant les tubes à température ambiante au moment désigné.

Prélever un à cinq microlitres de l’échantillon et mélanger immédiatement avec un volume de cinq fois de tampon d’échantillon SDS pour arrêter la réaction et s’assurer que la réaction de dégradation est complètement terminée. Agitez le tube plusieurs fois et tourbillonnez vigoureusement pour effectuer la page SDS. La radiographie automatique effectue une équivalence d’un microlitre de l’extrait pour chaque point temporel par voie.

Les résultats peuvent être quantifiés à l’aide d’image, d’image J quant, ou d’un autre logiciel d’imagerie préféré. La dégradation de la bêta-caténine dans l’extrait d’œuf xap devrait être mise en évidence par la diminution de l’intensité dépendante du temps de la bêta-kaine radio-marquée dans la bande. Pour préparer la bêta-caténine, la luciférase synthétise non radiomarquée à la bêta-caténine.

Utilisation du système couplé à la traduction de transcription avec un mélange complet d’acides aminés. Confirmez la production de la bêta-caténine marquée à la luciférase en mesurant l’activité de la luciférase de 0,5 à un microlitre de la réaction. Évaluez la luminescence de fond en mesurant la luminescence d’un mélange réactionnel non traduit pour effectuer le test de dégradation de la bêta-catine luciférase Tout d’abord, décongelez et préparez l’extrait d’œuf de xénope comme précédemment.

Ajoutez ensuite la fusion de bêta-catine et de luciférase traduite in vitro dans la réaction xip préparée. Mélangez sur de la glace et mélangez bien. Comme précédemment, mettez l’extrait à température ambiante pour démarrer la réaction de dégradation.

Prélever une partie aliquote de la réaction au point de temps indiqué et congeler instantanément dans de l’azote liquide. Prélever des échantillons en trois exemplaires pour analyse à chaque point temporel. L’extrait congelé peut être conservé à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt à être analysé.

Décongeler les échantillons sur de la glace et les transférer sur des plaques blanches standard à 96 puits sur glace avant le traitement. Pour l’activité de la luciférase, la dégradation dépendante de la bêta-caténine dépendante de GS GSK peut être facilement démontrée de plusieurs façons en utilisant l’extrait d’œuf XUS. La dégradation de la bêta-caténine radio-marquée S 35 dans l’extrait XUS est inhibée par l’ajout de l’inhibiteur du protéasome MG 1 32.

Le mutant bêta-caténine est stabilisé dans l’extrait d’œuf XUS par rapport à la bétaïne de type sauvage et les inhibiteurs protéiques de GSK trois inhibent de manière similaire la dégradation de la bêta-caténine. Enfin, l’appauvrissement de GSK 3 à partir de l’extrait d’œuf xip inhibe la dégradation de la bêta-caténine peut être sauvée par l’ajout de GSK trois exogènes. Le test de dégradation de la bêta-caténine luciférase dans l’extrait d’œuf xip a été utilisé pour évaluer la dégradation de la bêta-katine et de la luciférase.

Le taux de dégradation de la bêta-katine et de la luciférase est similaire à celui de la protéine bêta-caténine non marquée. La régulation de la dégradation pour la fusion bêta-katine et luciférase est essentiellement identique à celle de la protéine de non-fusion. Comme l’ajout de chlorure de lithium a entraîné l’inhibition de la bêta-catine et des changements dans le renouvellement de la luciférase, le signal radioactif de la bêta-catina.

La protéine luciférase est parallèle aux changements de l’activité enzymatique de la luciférase au fil du temps lors de la tentative de cette procédure. Il est important de garder tous les réactifs sur de la glace et de bien mélanger les réactions avant de tenter ce test. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier les régulateurs et d’analyser la bêta-catine et le renouvellement à l’aide du système d’extrait d’œuf de xénope acellulaire.