Prévention de stress thermique Effets indésirables chez les rats par Bacillus subtilis Strain

Nous avons décrit un protocole de prévention des effets du stress thermique chez le rat par prétraitement oral avec des bactéries bénéfiques. Ce protocole peut être modifié et utilisé pour diverses voies d’administration et pour l’analyse de différents composés.

L’objectif global de cette expérience est d’évaluer l’effet préventif de la souche BSB3 de B. subtilis contre les complications après stress thermique. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans la prévention des effets néfastes du stress thermique. Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut être utilisée pour évaluer différentes approches afin d’atténuer les complications du stress thermique.

Ludmila Globa fera la démonstration de cette procédure. Et Oleg Pusovyy, associé de recherche de notre laboratoire. Pour commencer, avec une seule colonie de Bacillus subtilis BSB3 qui a été cultivée pendant la nuit sur une plaque de gélose nutritive.

Inoculez dix millilitres de bouillon nutritif dans une fiole. Cultivez la culture pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Préparez 500 millilitres de milieu de sporulation selon la recette indiquée ici.

Et autoclave à 121 degrés Celsius pendant 20 minutes. Laissez le milieu refroidir à 50 degrés Celsius avant d’ajouter les solutions stériles suivantes. Dans une armoire stérile, refroidissez le milieu préparé à température ambiante à 40 degrés Celsius pendant 20 minutes.

Et versez 25 millilitres dans chacune des 20 boîtes de Pétri stériles. Laissez le milieu se solidifier pendant la nuit. Ensuite, étalez 0,5 millilitre de la culture de Bacillus subtilis BSB3 pendant la nuit sur la surface des plaques de milieu de sporulation.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant cinq jours jusqu’à 90 % de sporulation. Utilisez ensuite la microscopie à haute résolution pour vérifier la présence de spores à haute brillance. Pour récolter les bactéries, ajoutez un millilitre de PBS dans les plaques et utilisez un épandeur de cellules stériles pour gratter les bactéries de la surface.

Rangez la suspension à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Confirmer la viabilité de la bactérie en plaquant 0,1 millilitre de la dilution appropriée d’une suspension bactérienne sur des plaques de milieu de sporulation et incuber à 37 degrés Celsius pendant 18 à 24 heures. À l’aide d’un compteur de colonies, comptez les colonies bactériennes et calculez le titre de bactéries dans la suspension testée.

Préparez ensuite une suspension bactérienne dans du PBS à une concentration finale de un fois dix à huit UFC par millilitre. Après avoir traité les rats par gavage oral avec B. subtilis BSB3 ou PBS pendant deux jours, puis en subdivisant les animaux et en prenant leur température, maintenez les rats des groupes un et deux à température ambiante pendant 25 minutes. Placez les animaux des groupes trois et quatre dans une chambre climatique à 45 degrés Celsius et 55 % d’humidité relative pendant 25 minutes.

Après la mesure de la température rectale de chaque rat, placez à nouveau tous les animaux à température ambiante pendant quatre heures. Ensuite, après avoir euthanasié les animaux, recueilli le sang du tronc et isolé les organes conformément au protocole textuel, placez chaque échantillon d’organe dans des tubes stériles pré-pesés et pesez. Ajoutez du PBS stérile dans chaque tube pour obtenir une dilution de un à dix poids par volume de l’échantillon, et utilisez un homogénéisateur de tissus en verre stérile pour générer des suspensions de tissus homogènes.

Ensuite, utilisez du PBS stérile pour faire des dilutions en série de chaque échantillon. Déposer ensuite 0,1 millilitre de toutes les dilutions sur la surface de MacConkeys et 5 % de gélose sanguine. Et la gélose au sang brucella avec de l’hémine et de la vitamine K1. Après avoir incubé les plaques, utilisez un compteur de colonies pour compter les colonies sur chaque groupe de plaques.

Exprimez les résultats en nombre d’unités formant des colonies, ou UFC, par gramme de tissu. Après avoir préparé et coloré des coupes de l’intestin grêle selon le protocole textuel, utilisez un microscope à haute résolution pour mesurer les villosités intestinales et l’épaisseur totale de la paroi de la muqueuse. Analysez au moins quatre échantillons de chaque rat et effectuez au moins 20 mesures dans chaque échantillon.

Pour effectuer une microscopie optique haute résolution d’échantillons de sang, utilisez la plate-forme d’isolation vibratoire comme base pour le système de microscope avec une caméra vidéo et un ordinateur pour enregistrer des images en direct. Après avoir calibré les images de test selon le protocole de texte, placez sept microlitres de sang fraîchement prélevé sur chaque rat sur une lame de verre et ajoutez une lamelle. Ensuite, photographiez et enregistrez dix images de 72 par 53,3 micromètres carrés dans chaque échantillon.

Enfin, à l’aide d’un logiciel qui fournit des images optiques à haute résolution en temps réel, mesurez la concentration des vésicules. La température corporelle moyenne des animaux avant et immédiatement après le stress thermique était de 36,7 plus ou moins 07 degrés Celsius et de 40,3 plus ou moins 0,17 degrés Celsius, respectivement. L’exposition des rats à la chaleur a entraîné une inhibition significative de la hauteur des villosités et de l’épaisseur totale des muqueuses.

Cependant, le traitement avec la souche BSB3 avant le stress, a protégé l’intestin de l’effet nocif de la chaleur. Pour la translocation des bactéries de l’intestin, les ganglions lymphatiques mésentériques, le foie et la rate ont été analysés. Comme illustré ici, les bactéries ont été isolées à une concentration de 1,7 fois dix contre trois plus ou moins 4,6 fois dix pour deux UFC par gramme de tissu uniquement dans des échantillons de ganglions lymphatiques mésentériques et de foie de rats traités au PBS exposés à la chaleur.

D’autre part, tous les échantillons analysés provenant d’animaux témoins et d’animaux soumis à un stress thermique ayant reçu la souche BSB3 étaient stériles. Aucun changement dans les taux de cytokines IL 1beta, IL-6, TNFalpha ou d’interféron gamma n’a été enregistré chez les rats stressés par la chaleur. Cependant, les niveaux d’IL-10 et de LPS étaient élevés chez les animaux traités au PBS avant le traitement thermique.

Par conséquent, le prétraitement de B. subtilis BSB3 a empêché l’augmentation de l’IL-10 et du LPS dans le sérum après le traitement thermique. Enfin, une augmentation significative de la concentration des vésicules libres a été observée dans le sang des rats ayant reçu du PBS avant le stress thermique, mais pas chez les animaux traités par BSB3. Il est important de se rappeler d’utiliser des matériaux pyrogènes pour les collectes de sang et la précision de maintenir les liquides sériques à moins 20 degrés Celsius qu’avec des congélations et des décongélations répétées, et de suivre une procédure stérile lors de l’analyse de la translocation bactérienne.

Suivre cette procédure, comme l’administration de bactéries après un stress thermique, peut être effectuée afin de répondre à des questions supplémentaires sur les complications du stress thermique.