Détermination des espèces et Quantification en mélanges utilisant la spectrométrie de masse MRM de Peptides appliquée à l'authentification de la viande

L’objectif global de cette méthode est d’utiliser la spectrométrie de masse à réaction multiple pour identifier et quantifier les espèces présentes dans les mélanges de viande crue afin de l’utiliser comme outil de détection de la fraude alimentaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’intégrité alimentaire, comme la confirmation de la présence d’espèces dans des produits comme les saucisses ou les hamburgers. Notre approche est basée sur la spectrométrie de masse du composant protéique.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle peut donner un résultat rapide et quantitatif. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons remarqué que les protéines connues sous le même nom et les différentes espèces sont en fait suffisamment différentes pour permettre l’identification des espèces, mais suffisamment similaires pour permettre la quantification. Dénaturer thermiquement les myoglobines de référence purifiées en chauffant l’échantillon dans un bloc chaud à 95 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Refroidissez l’échantillon pendant environ 15 minutes jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante. Ajoutez ensuite 30 milligrammes d’urée pour améliorer la digestion et mélangez. Ajouter une solution de trypsine à l’échantillon dans un rapport de un à 30 entre l’enzyme et le substrat en poids.

Mélangez ensuite par vortex doux et laissez-le protéolyser pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, dessalez l’échantillon de post-protéolyse en diluant d’abord l’échantillon un à deux volume par volume avec de l’eau. Activez une cartouche polymère en phase inverse remplie de 30 milligrammes de matériau en phase inverse en ajoutant un millilitre de méthanol.

Ensuite, équilibrez la cartouche en ajoutant un millilitre d’acide formique à un pour cent. Chargez l’échantillon sur la cartouche sous l’effet de la gravité. Maintenant, lavez avec un millilitre de méthanol à cinq pour cent contenant un pour cent d’acide formique.

Éluez les peptides avec un millilitre d’eau acétonitrile dans deux tubes microcentrofuge d’un millilitre préremplis de cinq microlitres de DMSO. Ensuite, retirez le solvant sous vide à 50 degrés Celsius à l’aide d’un évaporateur centrifuge pendant 120 minutes. Ensuite, redissolvez le résidu dans 250 microlitres d’eau acétonitrile.

Transférez la solution dans un flacon d’échantillonneur automatique de faible volume. Localiser les séquences de myoglobine pour les différentes rencontres dans la base de données UniProt. Entrez les séquences de myoglobine dans la case cible du logiciel de prédiction du peptide et de la transition.

Si nécessaire, passez la souris sur un peptide pour révéler sa liste de fragments. Après avoir saisi les préférences comme décrit dans le protocole texte, cliquez sur Exporter et sélectionnez Liste de transitions pour créer une feuille de calcul contenant les transitions et les paramètres MRM générés. Mettre en place un système de chromotographie liquide ou HPLC haute performance à gradient binaire avec un passeur d’échantillons et une colonne HPLC à noyau C18 connectée à un spectromètre de masse triple quadripôle fonctionnant en mode électronébulisation positive avec détection MRM.

Dans la section d’édition des paramètres du logiciel de collecte de données de spectrométrie de masse en chromotographie liquide, sélectionnez le type de balayage MRM et la polarité positive. Saisissez les valeurs Q1, Q3, heure, ID, DP et CE pour les transitions créées dans la feuille de calcul et enregistrez la méthode d’acquisition. Après avoir configuré les paramètres de la méthode comme décrit dans le protocole texte, accédez au logiciel de collecte de données, cliquez sur Acquérir et sélectionnez Équilibrer.

Dans la boîte qui s’ouvre, sélectionnez la méthode d’acquisition requise pour commencer l’équilibrage de l’instrument. Ensuite, placez les flacons d’échantillons dans un rack dans l’échantillonneur automatique. Cliquez sur Fichier et sélectionnez Nouveau, puis Lot d’acquisition.

Dans le nom de l’échantillon, insérer l’identité de chacun des échantillons à analyser. Voir le protocole texte pour plus de détails sur la façon de visualiser les données acquises. Utilisez une viande préalablement congelée puis réduite en poudre.

Préparez une gamme de mélanges de viande en pesant les quantités respectives de viande dans des tubes à centrifuger en plastique de 15 millilitres. Ajoutez quatre millilitres de tampon d’extraction à la poudre de viande. Après un tourbillon de 30 secondes, extrayez sur un agitateur de laboratoire à température ambiante pendant deux heures à 250 cycles par minute.

Transférez deux millilitres d’extrait dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres et centrifugez pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 17 000 G.Transférez 200 aliquotes de 200 microlitres de surnageant dans des tubes à centrifuger de deux millilitres. Séchez les échantillons à l’aide d’un évaporateur centrifuge avant de déterminer la concentration en protéines des échantillons, comme décrit dans le protocole textuel. Pour effectuer la protéolyse des mélanges de viande, redissolvez le résidu séché dans un millilitre de solution de bicarbonate d’ammonium de 25 millimolaires.

Bien mélanger par vortex et effectuer la protéoloysie comme précédemment. Ensuite, configurez et exécutez le LCMS de la même manière à l’aide de la MRM planifiée. Affichez le chromatogramme complet dans le logiciel de visualisation des données.

Affichez successivement les ions extraits pour chaque jeu de transition. Vérifiez visuellement que chaque cluster contient le nombre requis de pics en forme de cloche au temps de rétention prévu. Confirmant ainsi l’existence du peptide sélectionné.

Ensuite, double-cliquez sur Assistant de quantification dans la barre de navigation. Dans la fenêtre Sélectionner des échantillons, créez un ensemble de quantification en sélectionnant un seul fichier de données. Sélectionnez ensuite un ou plusieurs échantillons disponibles.

Sélectionnez Suivant pour afficher les paramètres et la boîte de requête. Conservez les paramètres par défaut et sélectionnez Suivant pour afficher Sélectionner la méthode. Dans la liste déroulante Méthode, sélectionnez le fichier de méthode d’intégration, enfin sélectionnez Terminer.

Enregistrez le tableau des résultats, exportez-le sous forme de fichier texte et ouvrez-le dans une feuille de calcul pour examiner les données comme décrit dans le protocole texte. Cette figure montre les transitions MRM les plus intenses pour le cheval obtenues à partir d’un mélange poids pour poids de 1 pour cent avec du bœuf. En revanche, la ligne rouge montre la transition entre le bœuf et le bœuf lorsqu’il n’y a pas de cheval présent.

Il s’agit d’un graphique de la quantité de cheval mesurée par rapport à la quantité préparée de cheval dans le bœuf, exprimée sous forme de ratios. Le graphique montre clairement comment la méthode peut être utilisée pour effectuer des mesures quantitatives. Une fois maîtrisé et lors de l’utilisation d’un traitement par lots, le débit par cette méthode peut atteindre jusqu’à 20 échantillons par 24 heures.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de ne pas oublier de sélectionner une protéine appropriée pour l’analyse d’extraction. La myoglobine est un bon candidat pour l’examen des espèces de viande rouge car elle est abondante, soluble dans l’eau et stable à la chaleur. Cette procédure peut être étendue à d’autres espèces à identifier et à quantifier simultanément.

Le nombre maximum n’est limité que par la vitesse de balayage de la spectométrie de masse. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour utiliser l’empreinte digitale pepto dans des domaines tels que la protection des consommateurs et des marques.