Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les cellules progénitrices endothéliales du sang de cordon ombilical humain. Cette méthode décrit l’isolement des cellules progénitrices endothéliales du sang de cordon en vue de leur utilisation potentielle en tant que cellules autologues pour l’ingénierie tissulaire des greffes vasculaires. Le principal avantage de cette technique est que la procédure d’isolement peut être effectuée dans des milieux spécialisés sans qu’il soit nécessaire de trier les aminés.

Les cellules progénitrices endothéliales isolées peuvent être utilisées pour étudier la néovascularisation, et des rapports ont également suggéré que ces cellules peuvent être utilisées comme biomarqueurs pour identifier les patients à risque de maladies cardiovasculaires. Avant de commencer la procédure d’isolement, pré-enduire six plaques de puits avec deux millilitres de queue de rat fraîchement préparée, une solution de collagène par puits. Équilibrez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant au moins une heure.

Diluez ensuite environ 25 millilitres de sang de cordon ombilical avec HBSS à une concentration d’un pour un. Ensuite, ajoutez 20 millilitres de réactif de milieu à gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres et distribuez soigneusement 20 millilitres de sang de cordon dilué le long de la paroi du tube pour superposer le sang sur le milieu. Séparez les cellules par centrifugation, puis retirez soigneusement la couche de plasma.

À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 18, prélever la cellule mononucléée contenant la couche leucocytaire dans un nouveau tube de 50 millilitres. Et ajoutez un volume égal de milieu basal endothélial aux cellules. Lavez les cellules par centrifugation et lysez les globules rouges dans le palais résultant avec cinq millilitres de solution de chlorure d’ammonium sur de la glace.

Après cinq à 10 minutes avec des secousses occasionnelles, recueillir les cellules par centrifugation et remettre en suspension la pastille blanche dans un milieu de croissance endothéliale frais. Après avoir compté, aspirez le collagène de chaque puits de la plaque à six puits et lavez les puits trois fois dans du PBS. Ensemencez les cellules mononucléées à un fois 10 à la septième cellule par deux millilitres de milieu par concentration de puits.

Et remettez la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, rincez une fois les cellules avec un milieu de croissance endothélial frais. Remplacez ensuite le lavage par trois millilitres de milieu de croissance endothéliale frais et remettez les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire.

À l’aide d’un microscope à champ clair, obtenez des images quotidiennes des cellules pour suivre la progression des colonies de cellules endothéliales, en marquant les plaques où les colonies se forment pour suivre leur croissance. Lorsque les colonies de cellules endothéliales atteignent une taille d’environ trois millimètres, enduisez un flacon de culture T25 avec de la queue de rat fraîche et du collagène pendant au moins une heure dans l’incubateur de culture cellulaire. Ensuite, récoltez les cellules avec 150 microlitres de trypsine-EDTA à 0,05 % par puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois minutes.

Tapotez doucement la plaque pour déloger les cellules attachées. Lorsque les cellules commencent à se détacher, ajoutez immédiatement deux millilitres de milieu de croissance endothéliale frais et tirez les cellules dans un seul tube conique de 15 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et remettre la pastille en suspension dans un milieu de croissance endothéliale frais.

Après avoir compté, ensemencez les cellules dans le ballon enrobé de collagène à cinq fois 10 à la cinquième cellule dans trois millilitres de milieu par densité de ballon, et marquez le ballon comme passage un. Ensuite, retournez le ballon dans l’incubateur, en réensemenceant les cellules chaque fois que la colonie atteint 90 % de confluence. Après l’ensemencement sur les plaques traitées au collagène, la première excroissance de la colonie est généralement observée entre les jours cinq et neuf.

Les colonies continuent de croître et d’acquérir une morphologie cellulaire en forme de fuseau dans les premiers stades de la culture, qui évolue ensuite vers une morphologie semblable à celle d’un pavé. Le nombre total de cellules récoltées à chaque passage augmente en corrélation directe avec le nombre total de jours en culture. L’analyse par transfert Western révèle une expression précoce de CD 31 et de CD 34 par les cellules endothéliales en culture, qui semble diminuer avec le passage ultérieur.

L’expression du récepteur deux du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire est cependant maintenue dans le temps, bien qu’à un niveau d’expression légèrement inférieur à celui observé après le premier passage. Il convient de noter que les cellules progénitrices endothéliales ne sont pas positives pour le marqueur cellulaire mésenchymateux alpha actine musculaire lisse, contrairement par exemple aux lysats de cellules interstitielles valvulaires, qui peuvent être inclus comme contrôle positif. L’ensemble de la procédure d’isolement peut être réalisé en moins de cinq heures selon l’unité de sang de cordon obtenue.

Après avoir isolé et ensemencer les cellules mononucléées dans un milieu de croissance endothéliale, il faut généralement entre cinq et neuf jours pour que les colonies EPC apparaissent dans la culture. La méthode d’isolement proposée utilise des milieux spécialisés pour la culture des cellules progénitrices endothéliales, et évite l’utilisation d’un cytomètre en flux, en ce qui concerne la nécessité d’avoir des marqueurs endothéliaux. Cette méthode fournit également un protocole efficace pour obtenir de grandes quantités de cellules progénitrices endothéliales sur une courte période de temps.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les cellules progénitrices endothéliales des unités de sang de cordon ombilical humain. N’oubliez pas que le sang de cordon ombilical humain peut être dangereux et que l’élimination appropriée des déchets de sang et de produits de culture cellulaire doit être suivie.