Name: Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Apprenez à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain pour l'ingénierie tissulaire vasculaire. Cette méthode efficace utilise des milieux spécialisés sans tri cellulaire.

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Ce matériel est basé sur le travail soutenu par la National Science Foundation sous le Grant No. CMMI-1452943 et par le Collège d’honneurs de l’Université de l’Arkansas. Nous tenons également à remercier la Banque de sang de cordon de l’Arkansas pour nous fournir des unités de sang de cordon.

cette recherche a été menée avec l’approbation de l’Université de l’Arkansas, Institutional Review Board (numéro d’agrément 16-04-722). Unités de sang de cordon ombilical ont recueilli dans une solution de dextrose (CPD) citrate phosphate à l’Arkansas Cord Blood Bank, et les unités qui ne respectent pas l’obligation de stockage ont été données pour la recherche. Unités de sang de cordon ont été envoyées au laboratoire au sein de la collection à une température ambiante de 24 h.
 1. isolement des progénitrices endothéliales de sang de cordon <ol><li>préparation des réactifs.
	<ol><li>Préparer EGM en ajoutant le milieu basal endothélial (EBM) à 10 % sérum fœtal (SVF) additionné de 20 ng/mL de facteur de croissance analogue à l’insuline (IGF), 1 µg/mL d’acide ascorbique, 5 ng/mL recombinant facteur humain de croissance épidermique (rhEGF), 22,5 µg/mL héparine et 0,5 ng/mL endothéliales facteur de croissance vasculaire (VEGF), ainsi que de 10 ng/mL de recombinant humain facteur de croissance fibroblastique B (rhFGF-B), 0,2 µg/mL hydrocortisone et 2 % la pénicilline-streptomycine-glutamine. Stériliser le milieu de culture à l’aide d’un filtre à membrane vide 0,2 µm polyéthersulfone (PES).</li>
		Rat <li>Prepare queue j’ai une solution de collagène à une concentration de 50 µg/mL à l’aide de l’acide acétique 0,02 N. Stériliser cette solution à l’aide d’un filtre de seringue 0,2 µm.</li>
		Plaques 6 puits <li>pré-couche avec 2 mL de rat préparé j’ai tail solution de collagène pour chaque puits. Placez-les dans un incubateur maintenu à 5 % de CO 2 et 37 ° C pendant au moins 1 h avant de semer.</li>
		<li>Diluer environ 25 mL de sang de cordon avec Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) à une concentration de 1:1.</li>
		<li>Prepare radio-immuno précipitation assay (RIPA) tampon à l’aide de chlorure de sodium 150 mM, 1 % X-100 Triton, désoxycholate de sodium 0,5 %, β-glycérophosphate de 1 mM, SDS 0,1 % et 50 mM Tris (pH 8,0).</li>
	</ol></li> <li>Isolement de cellules endothéliales progénitrices.
	<ol><li>Tout chaud préparé réactifs dans un bain d’eau maintenu à 37 ° C avant l’isolement.</li>
		<li>Ajouter 20 mL de réactif moyen gradient de densité dans un tube à centrifuger 50 mL.</li>
		<li>Soigneusement la couche 20 mL de sang de cordon dilué dans le tube à centrifuger contenant le milieu de gradient de densité sans casser cette couche en visant la pipette vers les parois du tube.</li>
		<li>Séparer les composants du sang issu de leur densité ( Figure 1) par centrifugation à 800 g pendant 30 min à température ambiante, avec le frein du rotor centrifuge au large. Ne pas déranger les différentes couches.</li>
		<li>Enlever la couche de plasma par pipetage soigneusement il hors du tube sans déranger les autres cellules de la couche couches jusqu'à ce que la pointe de pipette est en mesure d’atteindre le RNM (voir Figure 1). Jeter le plasma enlevé. 
		Remarque : Lors de l’utilisation de pointes de pipette pour retirer le plasma, laisser une petite couche de plasma au-dessus de la couche MNC ( Figure 1) pour réduire les turbulences.</li>
		<li>Recueillir la couche leuco-plaquettaire qui contient les multinationales à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 18 et le transférer dans un tube à centrifuger fraîche.</li>
		<li>Ajouter un volume égal d’EBM à la centrifugeuse EMNs. collectées ces tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. jeter le surnageant. 
		Remarque : Le culot cellulaire apparaissent en rouge à cause de la présence de globules rouges/érythrocytes.</li>
		<li>Ajouter 5 mL de solution de chlorure d’ammonium à lyser les globules rouges. Incuber à ce tube sur la glace pendant 5-10 min, avec agitation occasionnels. 
		NOTE : Attention doit être prise pendant cette étape à ne pas dépasser la durée de temps, car il peut être nocif pour les multinationales.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C et éliminer le surnageant. Si les érythrocytes persistent, répéter les étapes 1.2.8 et 1.2.9 jusqu'à ce qu’aucune couleur rouge n’est observée dans le culot.</li>
		<li>Resuspendre le culot dans EGM préparé et utilisez l’hémocytomètre pour compter les PTM.</li>
		<li>Aspirer le rat j’ai tail collagène recouvert de plaque 6 puits (de l’étape 1.1.3) et laver les puits trois fois avec 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS).</li>
		<li>Graines le culot de RNM resuspendu dans EGM à la plaque de collagène à une concentration de 1 x 10 7 multinationales dans chaque puits. Placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur.</li>
		<li>Après 24 h, aspirer le milieu et laver les puits une fois avec EGM. Ajouter 3 mL de milieu EGM dans chaque puits et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur.</li>
		<li>Reconstituer la plaque avec un milieu EGM frais tous les jours pendant 7 jours. Après 7 jours, changer le milieu EGM alternats.</li>
		<li>à l’aide d’un microscope en champ clair, prendre des images de la plaque 6 puits tous les jours pour suivre la progression des colonies de cellules endothéliales. Marquer la plaque lorsque les colonies se présentent pour garder une trace de leur croissance. 
		Remarque : Il faut généralement entre 5 et 9 jours pour les colonies apparaissent dans la culture.</li>
	</ol></li> <li>Expansion des cellules endothéliales progénitrices.
	<ol><li>Manteau le flacon de culture T-25 avec rat queue j’ai collagène (50 µg/mL) et placez-le dans le 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur au moins 60 min. aspirer et laver le flacon de culture cellulaire T-25 trois fois avec du PBS 1 x avant le semis des cellules.</li>
		<li>Trypsinize des colonies de cellules endothéliales lorsqu’ils atteignent environ 3 mm de taille à l’aide de 150 µL de solution de trypsine-EDTA 0,05 % dans chaque puits. Replacez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pour 2-3 min.</li>
		<li>Tapoter légèrement la plaque 6 puits pour déloger les cellules attachées. Immédiatement ajouter 2 mL d’EGM et récupérer les cellules dans un tube à centrifuger 15 mL.</li>
		<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et calculer la densité de semis initiale.</li>
		<li>Spin la centrifugeuse 15 mL tubes à 400 g pendant 5 min. Resuspendre le culot dans EGM et la fiole T-25 ~ 500 000 cellules des graines. Marquer cette fiole en tant que Passage 1 et placer le ballon de T-25 retour dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur. 
		Remarque : Les cellules peuvent être plaqués en EBM et DMEM pour comparer la croissance avec EGM.</li>
		<li>Pour plus amples passages, lorsque le ballon atteint 90 % confluence, suivez les étapes 1.3.1 - 1.3.5 et réensemencer les cellules à 10 4 cellules/cm 2 sur T-75 ou T-175 flacons de culture cellulaire. Procéder à la caractérisation des cellules isolées (étapes 2 et 3).</li>
	</ol></li></ol> 2. Caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blotting <ol><li>Ajouter 50-100 µL de lyse tampon à chaque passage en suivant les étapes de l’expansion pour caractériser les cellules isolées. Collecter les protéines d’environ 500 000 ou plusieurs cellules.</li>
	<li>Pipette de haut en bas vigoureusement pour rompre les cellules et libérer les protéines. Recueillir et transmettre la mémoire tampon dans un tube de microcentrifuge.</li>
	<li>Tourner le tube de microcentrifuge à 500 x g et transvaser avec soin le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifuge. Étiqueter et stocker les tubes à-80 ° C pour le stockage à long terme.</li>
	<li>Quantifier la quantité de protéines dans chaque tube en utilisant soit Bradford &#39; s ou BCA assay 27 , 28 , 29.</li>
	<li>Réaliser de Western Blot à l’aide de procédures standard 27 , 28 , 29. Analyser 5 µg de protéines totales pour l’expression de CD31, CD34, VEGFR2 et α-SMA. Utiliser des α-tubuline pour normaliser les données.</li>
</ol> 3. Immunofluorescence indirecte <ol><li>soniquer verre 18 mm lamelles dans 50 % d’éthanol et séchez-les. Laissez les lamelles couvre-objet propre dans la plaque de 12 puits du jour au lendemain dans la hotte de sécurité biologique avec un UV lumière pour stériliser les.</li>
	<li>Enrober les lamelles couvre-objet avec 50 & #181 ; g/mL de rat j’ai tail collagène et la plaque de transfert à un 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pour au moins 60 min.</li>
	<li>Aspirer le collagène et ajouter 1 mL de PBS 1 x à la plaque de 12 puits pour laver les lamelles couvre-objet. Aspirer la solution de PBS 1 x et répéter deux fois.</li>
	<li>Graine 250 000 cultivées EPCs dans chaque puits et les replacer dans les 37 ° C, 5 % CO 2 incubateur pendant au moins 3 jours avant d’effectuer d’immunomarquage.</li>
	<li>Laver la plaque 3 fois avec du PBS 1 x. Ajouter 1 mL de méthanol glacée à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 15 min fixer les cellules.</li>
	<li>Mener d’immunomarquage à l’aide d’un protocole standard 27 , 28 , 29. Utiliser les anticorps à leurs dilutions appropriées (p. ex., CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1/100) et VEGFR2 (01:50)).</li>
	<li>Prendre des images de l’immunomarquage lamelles couvre-objet à l’aide d’un microscope à épifluorescence.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme mentionné précédemment, adhérent EPCs possèdent une morphologie pavées. Nos multinationales isolés a progressé d’une colonie de cellules fusiformes (Figure 2A-2D) dans les premiers stades à une colonie de pavées (Figure 2E-2F) sur une période de dix jours de culture. CPE ont été étiquetés différemment par les différents groupes de recherche, à savoir comme fin de cellules progénitrices endothéliales10</su...

Plusieurs chercheurs ont étudié les caractéristiques et le potentiel humain EPCs5,10,11,12,13. CPE peut être qualifiée de circuler les cellules qui ont la capacité d’adhérer aux tissus endothéliales dans les sites d’hypoxie, ischémie, des blessures ou la formation de tumeurs et contribuent à la formation de nouvelles structures vasculaires4,14. Leur implication observée dans la néovascularisation, sous forme de vasculogénèse postnatal, a conduit à la compréhension de la physiopathologie de ces cellules et leur utilisation dans des applications thérapeutiques4,15, 16. le nombre de CPE chez un individu s’est avéré être en corrélation avec la pathologie cardiovasculaire9,15,16,17,18,19 ,,20. D’autres études ont également différenciées EPCs dans un phénotype de fibroblastes-comme soupape et proposé que ces cellules pourraient être utilisées pour l’ingénierie tissulaire cardiaque vannes7,21.
Les molécules de surface de cellule particulière nécessaires pour isoler les EPCs n’ont pas été clairement identifiés en raison de divergences entre les enquêtes4. L’adhérence des multinationales à une certaine matrice, avec une exposition à une variété de conditions de culture, a été interprétée par plusieurs groupes1,17,22,23, suggérant que putatifs EPCs peuvent afficher les différentes propriétés phénotypiques. Ces propriétés incluent un manque de capacité de phagocytose, la formation du tube en Matrigel et la captation des lipoprotéines de basse densité Dil-acétylé. La haute clonogéniques et potentiel prolifératif sont deux propriétés avec laquelle EPCs peuvent être hiérarchisés5. CPE peut également former des tubules in vitro lorsque co-cultivées avec des poumons foetaux humains fibroblastes4. Ces cellules sont connues pour exprimer des marqueurs de surface des cellules endothéliales et de partager certaines des marqueurs hématopoïétiques13,24,25. Les marqueurs positivement exprimées largement acceptées pour le phénotypage EPCs sont CD31, CD34, récepteur de facteur de croissance endothélial vasculaire 2 (VEGFR2), von Willebrand (vWF) de facteur, CD133, c-Kit et vasculaires endothéliales cadhérine (VE-cadhérine)4 , 18. cellules qui expriment conjointement CD90, CD45, CD14, CD115 ou actine muscle lisse-alpha (α-SMA) ne sont pas considérés comme être EPCs en raison de leur capacité potentielle, proliférative limitée à phagocyter les bactéries et incapacité de former de novo humaine navires en vivo4,7. Cet article décrit un protocole modifié pour l’isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain sans besoin de n’importe quelle cellule protocoles de tri. Pour cet article, nous avons utilisé le CD31, CD34 et VEGFR2 comme les marqueurs positifs, avec α-SMA comme indicateur négatif.
Dans cet article, nous proposons une méthode d’isoler et de cultiver des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical sans cellule tri à l’aide spécialisée de milieu de croissance endothéliale additionné de facteurs de croissance (EGM). Cette EGM contient le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) et le facteur de croissance fibroblastique (FGF), qui améliorent la survie, la prolifération et la migration des cellules endothéliales26. Il comprend également l’acide ascorbique, qui est responsable du maintien de la morphologie de pavées des cellules ; insuline-comme le facteur de croissance-1 (IGF-1), qui fournit angiogénique et fonction migrateur ; et l’héparine, ce qui provoque la meilleure stabilité à long terme des facteurs de croissance en moyenne26. Autres facteurs de croissance, ajoutés le milieu de culture de cellules endothéliales comprend une supplémentation en facteur de croissance épidermique (EGF), qui aide à stimuler la prolifération cellulaire et la différenciation et hydrocortisone, qui sensibilise les cellules à EGF26 . Nous montrons que l’utilisation de ce support de croissance spécifique conduit à un nombre plus élevé de l’EPCs par rapport à la moyenne basale endothéliale (EBM) ou moyen d’Eagle modifié (DMEM de Dulbecco).

<table><tbody><tr><td>A) Pour l’isolement et la culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Ce produit est livré avec tous les facteurs de croissance nécessaires pour rendre le Croissance endothéliale Medium Fetal</td></tr><tr><td>Bovin</td><td>Serum Thermofisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Heatlhcare</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline équilibrée de Hank</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>1x tampon de phosphate Saline</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail I Collagen</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Amresco</td><td>0714-500ML</td><td></td></tr><tr><td>0,05 % Trypsine-EDTA</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>tampon HEPES</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s</td><td>Medium Thermofisher Scientific</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>B) Anticorps et lysats cellulaires</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 ;</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>dilution 1:250 pour Western blot</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7045</td><td>dilution 1:100 pour Western blot</td></tr><tr><td>&alpha ;-SMA</td><td>abcam</td><td>ab5694</td><td>dilution 1:100 pour Western blot</td></tr><tr><td>&alpha ;-tubuline</td><td>abcam</td><td>ab7291</td><td>dilution 1:2 500 pour Western blot</td></tr><tr><td>VEGFR2</td><td>abcam</td><td>sc504</td><td>Dilution 1:100 pour Western blot</td></tr><tr><td>Lysat de cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc24709&nbsp ;</td><td></td></tr><tr>Lysat <td></td><td></td> de <td>cellules interstitielles valvulaires</td><td>Lignée cellulaire primaire cultivée en laboratoire et lysée avec un tampon RIPA</td></tr><tr><td><fort>C) Western blot et immunomarquage</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x tampon Tris/Glycine/SDS</td><td>Biorad</td><td>161-0772</td><td>Utilisé comme tampon courant</td></tr><tr><td>10x tampon Tris/Glycine</td><td>Biorad</td><td>161-0771</td><td>Utilisé comme tampon de transfert</td></tr><tr><td>Membrane de transfert Immobilon-FL</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL0010</td><td>Il s’agit d’une membrane de transfert PVDF qui a 45 & micro ; m taille des pores et est mentionné dans le protocole comme membrane western blot</td></tr><tr><td>4x tampon d’échantillon Laemmli</td><td>Biorad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Biorad</td><td>161-0710</td><td></td></tr><tr><td>10 % Criterion TGX gel préfabriqué</td><td>Biorad</td><td>5671033</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold antifade</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>P36930</td><td>Utilisé pour le montage de lamelles immunocolorées pour le stockage à long terme</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>VWR Analytique</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Human Umbilical Cord Blood

L’existence de cellules endothéliales progénitrices (EPCs) dans le sang périphérique et son implication dans la vasculogénèse a été signalée par Ashara et ses collègues1. Plus tard, d’autres documenté l’existence de types similaires de EPCs provenant de la moelle osseuse2,3. Plus récemment, Yoder et Ingram a révélé que EPCs provenant du sang de cordon ombilical avaient un potentiel prolifératif plus élevé par rapport à ceux isolés d’adulte périphérique de sang4,5,6. En dehors de n’être impliqué en postnatal vasculogénèse, EPCs ont également montré des promesse comme une source de cellules pour créer tissulaire cardiaque et vasculaire vanne constructions7,8. Il existe différents protocoles d’isolement, dont certaines impliquent le tri cellulaire des cellules mononucléaires (PTM) dérivés les sources mentionnées plus tôt avec l’aide de marqueurs endothéliales et hématopoïétiques, ou cultivant ces multinationales avec la croissance endothéliale spécialisée moyenne, ou une combinaison de ces techniques9. Ici, nous présentons un protocole pour l’isolement et culture des CPE à l’aide spécialisée endothélial additionné de facteurs de croissance, sans utiliser d’immunosorting, suivie de la caractérisation des cellules isolées à l’aide de Western Blot et immunomarquage.

Isolement et l’Expansion des cellules progénitrices endothéliales : Un schéma (Figure 1) est fourni en décrivant le protocole global. Les couches de composants sanguins différents ont été observés après centrifugation en gradient de densité du sang de cordon ombilical humain avec milieu de gradient de densité. Après ensemencement MNCs sur les plaques imprégnées sur le collagène, l’excroissance des colonies fut observée entre 5 jours et 7 (...

Ce protocole vise à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical. Parmi les applications incluent l’utilisation de ces cellules comme biomarqueur pour identifier les patients à risque cardiovasculaire, traitement des maladies ischémiques, et constructions de création valve tissulaire cardiaque et vasculaire.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

The existence of endothelial progenitor cells (EPCs) in peripheral blood and its involvement in vasculogenesis was first reported by Ashara and ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules progénitrices endothéliales à partir de sang de cordon ombilical humain. Cette méthode décrit l'isolement de cellules progénitrices endothéliales à partir de sang de cordon afin de leur utilisation potentielle comme cellules autologues pour l'ingénierie tissulaire de greffons vasculaires. Le principal avantage de cette technique est que la procédure d'isolement peut être réalisée dans des milieux spécialisés sans nécessiter de tri cellulaire par fluorescence.Les cellules progénitrices endothéliales isolées peuvent être utilisées pour étudier la néovascularisation, et certaines études ont également suggéré que ces cellules pourraient servir de biomarqueurs afin d'identifier les patients à risque de maladies cardiovasculaires. Avant de commencer la procédure d'isolement, recouvrez au préalable les plaques à six puits avec deux millilitres de solution fraîchement préparée de collagène de type I de queue de rat par puits. Équilibrez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % CO2 pendant au moins une heure.Ensuite, diluez environ 25 millilitres de sang de cordon avec du HBSS à une concentration égale. Ajoutez ensuite 20 millilitres de réactif de milieu de gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres, puis versez soigneusement 20 millilitres de sang de cordon dilué le long de la paroi du tube afin de superposer le sang sur le milieu. Séparez les cellules par centrifugation, puis retirez soigneusement la couche plasmatique.À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 18, prélevez le culot blanchâtre contenant les cellules mononucléées dans un nouveau tube de 50 millilitres. Ajoutez un volume égal de milieu basal endothélial aux cellules. Lavez les cellules par centrifugation et lysez les globules rouges dans le culot obtenu à l’aide de cinq millilitres de solution de chlorure d’ammonium sur glace.Après cinq à dix minutes avec un léger agitation occasionnelle, recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre le culot blanc dans un milieu de croissance endothélial frais. Après dénombrement, aspirer le collagène de chaque puits de la plaque à six puits et rincer les puits trois fois avec du PBS. Ensemencer les cellules mononucléées à une concentration de un fois dix puissance sept cellules par deux millilitres de milieu par puits.Et remettre la plaque dans l'incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, rincer les cellules une fois avec un milieu de croissance endothélial frais. Ensuite, remplacer le rinçage par trois millilitres de milieu de croissance endothélial frais, puis remettre les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire.À l’aide d’un microscope en champ clair, acquérir quotidiennement des images des cellules afin de suivre la progression des colonies de cellules endothéliales, en marquant les plaques à l’endroit où apparaissent les colonies pour suivre leur croissance. Lorsque les colonies de cellules endothéliales atteignent environ trois millimètres de diamètre, enrober un flacon de culture T25 de collagène de type I de queue de rat frais pendant au moins une heure dans l’incubateur de culture cellulaire. Ensuite, récolter les cellules avec 150 microlitres de trypsine-EDTA 0,05 % par puits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant deux à trois minutes.Frapper doucement la plaque pour détacher les cellules adhérentes. Dès que les cellules commencent à se détacher, ajouter immédiatement deux millilitres de milieu de croissance endothélial frais et transférer les cellules dans un tube conique de 15 millilitres. Recueillir les cellules par centrifugation et resuspendre le culot dans du milieu de croissance endothélial frais.Après le comptage, ensemencer les cellules dans un flacon revêtu de collagène à une densité de cinq fois 10 à la puissance 5 cellules dans trois millilitres de milieu par flacon, puis marquer le flacon comme passage un. Remettre ensuite le flacon dans l’incubateur et repiquer les cellules chaque fois que la colonie atteint une confluence de 90 %. Après ensemencement sur les plaques traitées au collagène, l’expansion de la première colonie est généralement observée entre les jours cinq et neuf.Les colonies continuent de croître et acquièrent une morphologie cellulaire en fuseau aux premiers stades de la culture, qui évolue ensuite vers une morphologie en pavé. Le nombre total de cellules récoltées à chaque passage augmente en corrélation directe avec le nombre total de jours en culture. Une analyse par immunobuvardage révèle une expression précoce du CD 31 et du CD 34 par les cellules endothéliales cultivées, qui semble diminuer lors des passages ultérieurs.L'expression du récepteur du facteur de croissance endothélial vasculaire deux est toutefois maintenue au fil du temps, bien que légèrement inférieure au niveau d'expression observé après le premier passage. À noter que les cellules progénitrices endothéliales ne sont pas positives pour le marqueur des cellules mésenchymateuses, l'actine alpha de muscle lisse, contrairement par exemple aux lysats de cellules interstitielles valvulaires, qui peuvent être inclus comme témoin positif. L'ensemble de la procédure d'isolement peut être réalisé en moins de cinq heures, selon l'unité de sang de cordon obtenue.Après l'isolement et la mise en culture des cellules mononucléées dans un milieu de croissance endothélial, il faut généralement entre cinq et neuf jours pour que les colonies de CEP apparaissent en culture. La méthode d'isolement proposée utilise des milieux spécialisés pour la culture des cellules progénitrices endothéliales et évite l'utilisation d'un cytomètre en flux, en ce qui concerne la nécessité de détecter des marqueurs endothéliaux. Cette méthode fournit également un protocole efficace permettant d'obtenir de grandes quantités de cellules progénitrices endothéliales en un court laps de temps.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les cellules progénitrices endothéliales à partir d'unités de sang de cordon ombilical humain. N'oubliez pas que le sang de cordon ombilical humain peut présenter un danger, et que l'élimination appropriée du sang usagé et des produits de culture cellulaire doit être respectée.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ce protocole vidéo illustre l'isolement et la culture de cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) de cordon ombilical humain. Une fois isolé ces cellules peuvent être utilisées pour des dosages angiogenèse in vitro comme le dosage optimisé fibrine billes de gel a également démontré par le laboratoire de M. Hughes.

Isolement de cellules humaines endotheliales de veine ombilicale (HUVEC)

Ce protocole décrit l'isolement et à l'expansion ultérieure des cellules stromales mésenchymateuses et les cellules endothéliales formant colonie sans l'utilisation de sérum animal pour générer des paires autologues à des fins de transplantation expérimentale.

Isolement et animale expansion sans sérum du cordon ombilical humain dérivé cellules stromales mésenchymateuses (CSM) et des cellules endothéliales progénitrices Colony Forming (CPEF)

Cellules endothéliales formant colonie (CPEF) sont les cellules endothéliales circulantes avec robuste potentiel prolifératif clonal qui affichent...

Caractérisation phénotypique et fonctionnelle des cellules endothéliales formant colonie dérivés du sang de cordon ombilical humain

Cet article décrit tout d'abord une procédure pour isoler les cellules endothéliales humaines de veines ombilicales puis montre comment utiliser ces cellules pour examiner la transmigration des neutrophiles dans des conditions d'écoulement. En utilisant une chambre d'écoulement à faible volume faite d'un polymère avec des caractéristiques optiques de verre, des cellules vivantes d'imagerie de fluorescence de populations de cellules rares est également possible.

Isolement des cellules humaines endothéliales de veines ombilicales et leur utilisation dans l&#39;étude de la Transmigration des neutrophiles en conditions d&#39;écoulement

Nous décrivons ici un protocole pour isoler des sous-ensembles de précurseurs des lymphocytes B du sang de cordon ombilical. Une quantité suffisante et de qualité des acides nucléiques peut être extrait des cellules et utilisées dans des essais ultérieurs en utilisant l'ADN ou de l'ARN.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Ce protocole permet la génération et la caractérisation fiables de cellules endothéliales de croissance sanguine (BOEC) à partir d’un petit volume de sang périphérique adulte. Les BOEC peuvent être utilisés comme substitut des cellules endothéliales de patients atteints de troubles vasculaires et comme substrat pour la génération de cellules souches pluripotentes induites.

Génération et de la Culture du sang excroissance des cellules endothéliales de sang périphérique humain

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

des cellules progénitrices endothéliales (EPCs) sont fondamentalement impliqués dans la néovascularisation des tissus ischémiques. Cette méthode décrit l'isolement de EPCs humains provenant du sang périphérique, ainsi que l'identification de leur potentiel migratoire avec des échantillons de sérum de patients de chirurgie cardiaque.

Isolement de cellules progénitrices endothéliales de volontaires sains et de leur potentiel migratoire Influencé par échantillons de sérum après chirurgie cardiaque

Nous décrivons ici l’ex vivo expansion des cellules souches hématopoïétiques CD34+ cellules provenant du sang de cordon ombilical traitement avec une combinaison d’un cocktail de cytokine et l’APV. Cette méthode conduit à un degré significatif d’expansion ex vivo de csh primitif des deux cliniques ou les applications de laboratoire.

Expansion ex Vivo de cellules souches hématopoïétiques CD34 de dérivés du sang de cordon ombilical humain+ des cellules à l’aide de l’acide valproïque

Ici, nous présentons un protocole pour la caractérisation immunophenotypic et la différenciation induite par cytokine du sang de cordon dérivé CD34- cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice aux quatre lignées myéloïdes. Les applications de ce protocole comprennent des études sur l'effet des mutations de la maladie myéloïde ou de petites molécules sur la différenciation myéloïde descellules CD34.

Différenciation pan-myéloïde du sang de cordon humain Dérivé CD34- Cellules hématopoïétiques de tige et progénitrice

Apprenez à isoler les cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain pour l'ingénierie tissulaire vasculaire. Cette méthode efficace utilise des milieux spécialisés sans tri cellulaire.

Isolement des cellules endothéliales progénitrices du sang de cordon ombilical humain

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