L’Assemblée et la Purification du Prototype spumavirus Intasomes

Recombinant intégrase rétrovirale et oligomères d’ADN imitant les extrémités de l’ADN virales peuvent former un complexe enzymatiquement actif connu comme un intasome. Intasomes peut être utilisé pour les études cinétiques, structurales et biochimiques. Ce protocole détaille comment assembler et purifier le prototype spumavirus intasomes.

L’objectif global de cette procédure est d’assembler et de purifier des prototypes d’intasomes viraux mousseux qui peuvent ensuite être utilisés pour des études biochimiques, structurales et cinétiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la rétrovirologie telles que la mécanique et la dynamique de l’intégration. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler des complexes d’intégration plutôt qu’un mélange hétérogène d’espèces.

La démonstration visuelle de cette méthode est bénéfique car la récupération et la solubilisation des complexes d’intégration sont essentielles pour assurer un rendement optimal en intasome. Pour commencer, combinez le tampon 1XTEN, 10 oligomolaires 1 et 10 oligo-2 micromolaires dans un volume final de 1,5 millilitre. Ensuite, aliquote 25 microlitres du mélange dans 60 tubes de réaction à changement de polymérase de 0,2 millilitre.

Recuit l’ADN à l’aide d’un thermocycleur avec les temps et les températures indiqués dans le protocole texte. Après la réaction, combinez les réactions de recuit des 60 tubes. Chargez ensuite 500 microlitres de deux unités de concentration de filtre ultracentrifuge de 0,5 millilitre et de trois kilodaltons.

Concentrez l’ADN viral recuit par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 14 000 fois fois g pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir jeté le flux, ajoutez 250 microlitres de l’ADN viral recuit restant dans chaque unité de filtration. Répétez l’essorage jusqu’à ce qu’il reste environ 50 microlitres et jetez le flux.

Ensuite, l’échantillon est remplacé par un tampon TE en le lavant trois fois avec 450 microlitres de TE. Après l’échange de tampon, retournez l’unité de filtration et tournez à 1000 fois g pendant deux minutes à température ambiante. Le volume final rémanent pour chaque unité de filtration doit être d’environ 50 microlitres. Combinez les rétentats et transférez-les dans un tube à bouchon à vis de 1,5 millilitre.

Enfin, mesurez l’absorbence ultraviolette de 260 nanomètres de l’ADN viral pour calculer la concentration d’ADN. Pour assembler les intasomes, combinez 50 millimolaires de bis-tris propane pH 7,5, 500 millimolaires de chlorure de sodium, 120 micromolaires d’intégrase PFV et 50 micromolaires d’ADN viral dans un volume total de 150 microlitres. Nettoyez un morceau de 10 centimètres de long de 10 millimètres de diamètre, un tube de dialyse de coupure de poids moléculaire de six à huit kilodaltons et les clips associés avec de l’eau distillée double ou de l’eau de la plus haute pureté disponible.

Coupez une extrémité de la tubulure, rincez l’intérieur de la tubulure de dialyse trois fois avec un à deux millimètres de tampon de rinçage. Retirez autant de tampon de rinçage que possible à l’aide de la pipette et de la fine pointe de chargement du gel. Ensuite, transférez l’ensemble intasome dans la tubulure de dialyse à l’aide de la pipette et d’une fine pointe de chargement de gel.

Assurez-vous que l’ensemble est expulsé directement dans le fond de la tubulure de dialyse. Fixez l’extrémité ouverte de la tubulure de dialyse en minimisant la quantité d’air introduite dans la tubulure. Placez ensuite la tubulure dans le tampon de dialyse.

Dialysez pendant la nuit avec des agitations douces afin que le tube tourne mais ne soit pas dans un vortex. Assurez-vous que la tubulure de dialyse est immergée et mobile. Après environ une heure, le précipité devrait être visible à l’intérieur de la tubulure.

Préparez deux pointes de pipette à large calibre en prélevant deux à quatre millilitres de l’extrémité d’une pointe de 200 microlitres avec une nouvelle lame de rasoir ou de scalpel sur une surface propre. Retirez la tubulure de dialyse du tampon de dialyse. Pour éviter la dilution de l’échantillon d’intasome avec un tampon de dialyse qui peut rester à l’extrémité de la tubulure près du clip, utilisez une micropipette avec une petite pointe de pipette pour éliminer tout excès de tampon de dialyse.

Retirez le clip de cette extrémité de la tubulure de dialyse. Lors de la récupération de l’ensemble, il est important de recueillir autant de solution et de précipiter que possible. À l’aide de l’embout de l’hélice à alésage large, l’échantillon, y compris le précipité, à l’intérieur de la tubulure de dialyse dans un tube de 1,5 millilitre sur de la glace.

Notez le volume total de la matière récupérée. Le volume total est généralement d’environ 140 microlitres. L’échantillon avec précipité est à 200 millimolaires de chlorure de sodium.

Augmentez le sel jusqu’à une concentration finale de chlorure de sodium de 320 millimolaires en ajoutant le volume approprié d’une solution mère de chlorure de sodium de cinq molaires. Transférez le seau à glace avec l’échantillon dans une chambre froide à quatre degrés Celsius. À l’aide de l’embout de pipette à perce large, le précipité est remis en suspension et solubilisé par pipetage.

Répétez l’opération toutes les 20 minutes pendant au moins une heure. La majeure partie du précipité doit être mise en solution. Pour purifier l’intasome, équilibrez une colonne de chromatographie d’exclusion stérique ou SEC réticulée avec un tampon SEC à un débit de 0,4 millilitre par minute.

Centrifuger l’échantillon d’intasome dans un microfuge à 14 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius pour granuler tout précipité restant. Après avoir soigneusement retiré le surnageant, chargez-le sur une boucle d’injection de 200 microlitres. Appliquez l’exemple à la colonne SEC.

Éluer avec 25 millilitres de tampon de fonctionnement SEC et collecter 95 fractions de 270 microlitres. Observez que le chromatogramme SEC affiche trois pics A280 et A260. Combinez deux microlitres de chaque fraction de pic d’intasome dans 50 nanogrammes d’ADN plasma super enroulé de trois kilobases dans un tampon de réaction dans un volume de réaction final de 15 microlitres.

Incluez également un contrôle négatif sans ajout d’intasome PFV. Incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Arrêtez la réaction avec 0,75 microlitre de protéinase K et 0,75 microlitre de SDS.

Ensuite, incubez l’échantillon à 55 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, ajoutez trois microlitres de glycérol à 50 % à chaque réaction d’intégration. Chargez le volume total de la réaction à un pour cent en poids par volume de gel d’agarose.

Chargez également un microlitre de marqueur d’ADN de 10 kilobases dans les couloirs de chaque côté des échantillons. Dans une voie extérieure, chargez six microlitres de colorant G orange. Faites fonctionner le gel à tension constante, 10 volts par centimètre, à température ambiante pendant une heure, ou jusqu’à ce que la face du colorant G orange atteigne la fin du gel.

Imagez immédiatement le gel d’agarose à l’aide d’un scanner fluorescent réglé pour détecter le bromure d’éthidium. Cette image devrait montrer une intégration concertée en tant que bande qui fonctionne fidèlement à la taille de trois kilobases. Après avoir quantifié les bandes de chaque voie à l’aide d’un logiciel d’imagerie, sélectionnez les fractions qui ont l’activité d’intégration la plus concertée.

Répartissez chaque fraction en aliquotes de cinq microlitres. Enfin, congelez les aliquotes dans de l’azote liquide avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius. Un chromatogramme représentatif d’une purification d’assemblage d’intasome PFV est représenté.

Trois pics sont visibles. Le pic central est en corrélation avec les intasomes correctement assemblés. L’efficacité d’intégration en fraction du pic de chromatographie centrale est indiquée.

L’activité des Intasomes a été testée sans et avec gel et décongélation. La congélation et la décongélation n’ont montré aucune différence dans le gel d’agraose coloré au bromure d’éthidium des produits de réaction d’intégration. Ici, le plasbide super-enroulé, les produits d’intégration concertés, les produits d’intégration à demi-visée et l’ADN viral n’ayant pas réagi sont indiqués.

La quantification de l’efficacité d’intégration à partir de l’image du bromure d’éthidium confirme également qu’il n’y a pas de perte d’activité d’intégration après la congélation et la décongélation. Cela permet un stockage à long terme. La molécule de marquage et la position affectent l’efficacité de l’assemblage de l’intasome PFV.

Des intasomes non marqués et un marqueur interne Cy5 affichent une efficacité d’assemblage équivalente. Cependant, l’étiquette finale Cy5 ou la biotine réduit l’efficacité de l’assemblage. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours si elle est correctement exécutée.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que des dosages biochimiques et de molécules uniques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant l’intégration, la cinétique et la dynamique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’assembler, de purifier et d’évaluer fonctionnellement les intasomes PFV.