Analyse métabolique des larves de Drosophila melanogaster et un cerveau adulte

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le métabolisme cérébral de la drosophile et sur la façon dont la prolifération excessive des cellules gliales affecte la reprogrammation métabolique, que l’alimentation ou le comportement modifie le métabolisme. Le principal avantage de cette technique est que les cerveaux de mouches peuvent être analysés métaboliquement comme un tissu entier intact avec des résultats reproductibles obtenus en mesurant un seul cerveau à la fois. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du métabolisme du cerveau de la mouche, elle peut également être appliquée à d’autres tissus et systèmes modèles tels que les disques imaginaux et C. elegans, respectivement.

Pour préparer les contentions microtissulaires, dans le contenant de stockage, choisir une contention microtissulaire par cerveau mesuré, plus au moins trois pour l’utilisation comme témoins seulement. À l’aide d’un panier en filet et d’une plaque à six puits, rincez les dispositifs de retenue avec de l’éthanol à soixante-dix pour cent et lavez-les à l’eau désionisée trois fois, chaque fois pendant deux minutes. Effectuez des lavages à l’eau supplémentaires si les dispositifs de contention dégagent toujours une odeur d’alcool.

Lavez les micro-tissus de contention dans un milieu de test et laissez-les dans la solution jusqu’à ce qu’ils soient prêts à l’emploi. Pour disséquer le cerveau larvaire de Drosophila melanogaster, sélectionnez les larves de la fin du troisième stade à partir d’une fiole de mouches Organ R cultivées. Placez la larve dans le puits d’une plaque de disséquage propre contenant 500 microlitres de 1x PBS.

Ensuite, lavez la larve en la secouant doucement dans le puits et transférez-la dans un autre puits propre. Ensuite, placez la plaque d’observation sous le microscope de dissection. Saisissez la larve par la partie médiane à l’aide d’une pince à épiler tout en saisissant les crochets à l’aide d’une deuxième pince à épiler.

Tirez doucement et doucement la larve dans des directions opposées à l’aide des deux jeux de pinces à épiler. Visualisez le cerveau qui reste généralement attaché aux crochets oculaires et qui a généralement des disques antennaires oculaires qui y sont attachés. À l’aide des crochets oculaires pour maintenir le cerveau en place, retirez soigneusement les tissus supplémentaires.

Enfin, séparez les crochets oculaires du cerveau. Ensuite, utilisez une pince à épiler pour transférer le cerveau disséqué dans un nouveau puits contenant 1x PBS. Pour ajouter les cerveaux disséqués à une plaque d’essai métabolique de 96 puits, ajoutez d’abord 50 microlitres de milieu d’essai à tous les puits, y compris les puits expérimentaux, de contrôle, de contention uniquement et de fond.

Ensuite, placez soigneusement un cerveau dans chaque puits. Sous le microscope de dissection, utilisez une microsonde à aiguille courbée pour pousser les cerveaux au fond du puits. Positionnez doucement les cerveaux au milieu des trois sphères surélevées à l’aide de la sonde.

Pour ajouter une restriction micro-tissulaire à la plaque de test métabolique à 96 puits, placez-la d’abord sur le bord. Sous un microscope, orientez-le avec l’anneau en plastique vers le bas et la maille sur le dessus. Ensuite, retirez la plaque du microscope.

Utilisez la pince à épiler pour saisir la retenue des deux côtés et déposez-la doucement dans le puits. Utilisez une microsonde à aiguille pliée pour enfoncer la contention dans le puits. Les contraintes de micro-tissus doivent être correctement positionnées sur le cerveau centré dans chaque puits pour que cette technique donne des résultats significatifs.

Au microscope, vérifiez que le cerveau disséqué peut être vu à travers la contention tissulaire et qu’il est centré dans le puits et répétez la procédure pour tous les puits qui seront utilisés dans le test. Ajoutez soigneusement 130 microlitres de milieu de test dans chacun des puits expérimentaux, de contrôle et de contention uniquement. Vérifiez que le cerveau et les micro-tissus n’ont pas bougé lors de l’ajout du milieu.

Ensuite, ajoutez 180 microlitres de milieu de dosage dans les quatre puits d’angle pour les utiliser comme contrôle de fond. Dans cette procédure, retirez la plaque utilitaire et ajoutez la plaque cellulaire sans le couvercle dans la même orientation que l’analyseur métabolique. Sélectionnez Plaque de cellule de charge pour que l’instrument prenne la plaque cellulaire et ferme le plateau, puis commence le test.

Une fois le test terminé, retirez la plaque cellulaire et la cartouche éjectées. À l’aide d’un microscope à dissection, vérifier que les cerveaux et les microtissus sont toujours correctement positionnés dans le puits une fois l’analyse terminée et exclure de l’analyse tout puits présentant des anomalies. Lorsque les conditions optimisées sont respectées, les tests avec les cerveaux larvaires et adultes donnent des lectures d’OCR légèrement supérieures à 150 picomoles par minute au sixième point temporel stabilisé, environ 25 minutes après le début de l’essai.

Ce taux est maintenu pendant au moins 30 minutes et jusqu’à deux heures. L’ECAR est légèrement plus faible dans les cerveaux adultes que dans les cerveaux larvaires au sixième point temporel et est maintenue pendant au moins 30 minutes. Ce résultat correspond à une augmentation de la glycolyse au cours des stades larvaires pour soutenir la croissance.

Une injection avec un inhibiteur mitochondrial, tel que l’oligomycine, abaisse les lectures de l’OCR pour révéler la respiration dépendante de l’ATP et un traitement ultérieur avec de la roténone et de l’antimycine A abaisse l’OCR pour révéler la consommation d’oxygène non mitochondriale. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de centrer le cerveau et de s’assurer que la retenue des micro-tissus est bien en place avant d’exécuter le test et pendant l’analyse. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la PCR quantitative et l’analyse par western blot peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la façon dont l’expression des gènes contribue au phénotype métabolique observé.