3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללכוד ולרצף קצוות' 3 של mRNA, ובכך לאפשר מחקרי עיבוד של mRNA, ובמיוחד שסוף קצה' 3 ופוליאדניליציה, כמו גם כימות של ביטוי גנים. פרוטוקול ה-A-seq2 וחבילת ניתוח הנתונים המוצגים כאן, יכולים לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי היווצרותן ותפקודן של איזופורמים של תמלילים בסוגי תאים ורקמות שונים. היתרונות המרכזיים של שיטת A-seq2 הם שהיא מונעת ריצוף דרך רצפי poly(A) ארוכים ואינה מייצרת דימרים של אפדפטורים.

לפרוצדורה זו משתמשים בתאים שהגיעו ל-80% התמסרות (confluency). הסירו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. בצעו ליזיס ישיר של התאים על הפלטה על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת ליזיס לכל באר, והשתמשו בשפכטל גומי כדי להפריד לחלוטין את חומר התאים מפני השטח של הפלטה.

השתמשו בקצה פפית של 1 מיליליטר כדי להעביר את הליזאט הצמיגי מכל באר לתוך מבחנה פלסטיק של 15 מיליליטר. ערבבו את ה-DNA באמצעות מזרק של 1 מיליליטר שמחוברת אליו מחט היפודרמית בנחש (gauge) 23. בצעו מספר תנועות חזקות של הבוכנה למעלה ולמטה, עד שהליזאט לא יהיה צמיגי יותר.

העבירו את הליזאט למבחנה של 1.5 מיליליטר. סבבו ב-20,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, כדי להסיר את השאריות. אספו את העלייה הצלולה מהליזאט.

הוסיפו חרוזי מגנט oligo d(T)25 וערבבו מחדש את התערובת. הניחו את המבחנות על גלגל סיבוב למשך 10 דקות. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על מעמד מגנטי למשך שתי דקות.

הסיר את הנוזל השקוף. הוסף 0.8 milliliters של buffer A לכל מבחנה וסובב את המבחנה ב-180 מעלות פעמיים עד שלוש פעמים. הסר את buffer A מהשטיפה השנייה.

הוסיפו 0.8 milliliters של buffer B לכל מבחנה והשאירו על המעמד למשך שתי דקות. כדי לאלוט את ה-mRNA הקשור מהחרו지를, הסירו את buffer B, הוסיפו 33 microliters של מים לכל מבחנה, ותלו את החרו지를 מחדש. חממו ל-75 degrees Celsius למשך חמש דקות על בלוק חימום.

מיד לאחר מכן, סובבו את המבחנות למשך שנייה אחת והניחו אותן על המגנט. העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה. הוסיפו 66 µL של alkaline hydrolysis buffer לכל מבחנה, ערבבו וחממו ב-95 °C למשך בדיוק חמש דקות על בלוק חימום.

קררו מיד את המבחנות על קרח. לאחר מכן, בצעו בידוד RNA באמצעות ערכה לניקוי RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו לכל דגימת RNA 14 µL של תערובת מאסטר (Master Mix) של פולינוקלאוטיד קינאז.

הדגירה תתבצע בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את תגובות הקינאז לעמודי ספין (spin columns) מוכנים. סובבו את העמודים ב-735 ×g למשך שתי דקות.

שפכו את התכולה מהעמודות והניחו את המבחנות עם התגובות שנאספו על קרח. כדי לחסום את הקצוות 'פיריימ' (3') של מקטעי ה-RNA על מנת למנוע את קונקטמריזציית הם בתגובות ליגציה עוקבות, הוסיפו לכל דגימה 17.5 microliters של poly(A)polymerase Master Mix. ערבבו וסובבו במערך צנטריפוגי למשך שנייה אחת.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוסיפו 32.5 µL של מים לכל תגובה וטהרו את ה-RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחילו הליך זה על ידי הנחת התגובות במרכז ריכוז בוואקום למשך 10 דקות, כדי להפחית את הנפח ל-6 µL.

לאחר מכן, הוסיפו לכל תגובה 24 µL של תערובת מאסטר (Master Mix) של RNA ligase. דגרו את התגובות על שייקר מחומם בטמפרטורה של 24 °C למשך 16 שעות, עם ערבוב לסירוגין במהירות של 1,000 RPM. למחרת, הוסיפו 17 µL של מים לכל תגובה וערבבו.

טהרו את ה-RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו את התמיסות שחולצו (eluites) במרכז ריכוז בוואקום למשך שלוש דקות, כדי להפחית את הנפח ל-11 µL. העבירו את התגובות למבחנות PCR בנפח 200 µL לצורך תגובת השעתוק ההפוך.

הוסיפו מיקרוליטר אחד של פריימר. חממו בטמפרטורה של 70 °C במכשיר PCR למשך חמש דקות, ולאחר מכן השאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר (Master Mix) לשעתוק הפוך לכל מבחנה וערבבו.

הניחו את המבחנות במכשיר PCR. חממו ל-55 °C למשך 10 דקות ולאחר מכן ל-80 °C למשך 10 דקות נוספות. שמרו על קרח.

הכינו חרוזי streptavidin, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הוסיפו את תגובת השעתוק ההפוך לתוך תמיסת החרוזים והדגרירו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על גלגל סיבוב למשך 20 דקות. בעזרת מתקן מגנטי, שטפו את החרוזים פעמיים בבופר biotin bindingB ופעמיים בבופר TEN.

שחזר את החרוצים ב-50 µL של TEN buffer. הוסף שני µL של תערובת אנזים uracil DNA glycosylase והדגר ב-37 °C למשך שעה במיקסר, תוך ערבוב לסירוגין. הוסף 50 µL של מים, 11 µL של RNase H buffer ומיקרוליטר אחד של Rnase H לכל תגובה.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. הניחו את המבחנות על המגנט (magnetic rack) והעבירו את הנוזל המכיל את ה-cDNA המגזוז למבחנה חדשה. טהרו את ה-cDNA המגזוז באמצעות ערכה לטיהור PCR, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

העבירו את ה-cDNA המטוהר למרכז ריכוז בוואקום למשך שמונה דקות כדי לרכז אותו לנפח של 7 µL. כדי לבצע ליגציה של מתאמי 5' לקצוות ה-5' של ה-cDNA המבודד, הוסיפו לכל דגימה 23 µL של RNA ligase Master Mix והדגירו בטמפרטורה של 24 °C למשך 20 שעות. לבסוף, הוסיפו 70 µL של מים לכל תגובה.

מבוצע PCR פיילוט כדי לקבוע את מספר מחזורי ה-PCR האופטימלי להגעה להגברה של הספרייה, בתוך השלב האקספוננציאלי. העבירו בפיפטה את הרכיבים הבאים לשפרורת PCR בנפח 200 microliter: 25 microliters של תערובת DNA polymerase, 20 microliters של תגובת ליגציה, two microliters של מים, 1.5 microliter של פריימר PCR קדימה ו-1.5 microliter של פריימר PCR אינדקס אחורה. הפעילו את מכשיר המחזור (cycler) עם התוכנית הבאה: שלוש דקות ב-95 degrees Celsius, ואחריהן 20 מחזורים של 20 שניות ב-98 degrees Celsius, 20 שניות ב-67 degrees Celsius ו-30 שניות ב-72 degrees Celsius.

אספו מנות של 7 µL ישירות מהסייקלר, לאחר המחזורים המצוינים. הפרידו את התוצרים על ג'ל אגרוז 2% והדמינו את נדירות תוצרי ה-PCR. קבעו את מספר המחזורים בתחילת ההגברה האקספוננציאלית (במקרה זה, 12 מחזורים), והשתמשו במספר מחזורים זה עבור תגובת PCR בקנה מידה גדול.

הפרידו את התוצרים מתגובת ה-PCR בקנה מידה גדול על ג'ל אגרוז 2% וגזרו את פלחי הג'ל המכילים תוצרי DNA של 200 עד 350 נוקלאוטידים. לאחר מכן, חלצו את ה-DNA מפלחי הג'ל באמצעות ערכת בידוד ג'ל (gel extraction kit), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בסרטון זה יוצגו רק השלבים החישובים החשובים ביותר.

פרטים נוספים זמינים בפרוטוקול הכתוב. התחילו בשבט (cloning) של מאגר ה-Git ובמעבר לספרייה שנוצרה acabado. צרו סביבה המכילה את התוכנה והפעילו סביבה זו.

הורידו את רצף הגנום של האורגניזם ממנו הופקו נתוני A-seq2. פתחו את קובץ התצורה והגדירו את פרמטרי הקלט, כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב. התחילו את הניתוח.

התגובה של גן ספציפי, NUP214, להשתקת החלבון HNRNPC, נבחנה על ידי ניתוח קריאות a-seq2 משני דגימות של תאי HEK-293, שטופלו ב-RNA מפריע קטן (siRNA) של ביקורת או ב-siRNA של HNRNPC. הקריאות שתיעדו אתרי poly(A) שאונוטציה על ידי צינור הניתוח נשמרו בפורמט BAM, ששימש כקלט לדפדפן הגנום IGD. הקצוות של ה-prime three של שיאי הקריאות מופו לקצוות prime three של mMRNA המאannotated ב-ensemble.

הפרופילים מעידים על שימוש מוגבר באיזופורמה הארוכה של ה-UTR' 3 בעקבות knockdown של HNRNCR. לאחר השליטה בשיטה, פרוטוקול ה-A-seq דורש שמונה שעות של עבודה מעשית או כיומיים עד שלושה ימים, ללא احتساب הזמן עבור תרבית התאים והליגציות למשך הלילה. בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לתכנן תחילה סט ראשוני התואם לפלטפורמת הרצף המשמשת במעבדתכם.

לאחר השגת הקצוות של ה-3' של ה-mRNA, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קישור צולב (cross linking) ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation), כדי לזהות רגולטורים של עיבוד קצוות 3' של pre-mRNA. שיטת A-seq2 סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום עיבוד ה-RNA לחקור את הרגולציה וההשלכות של פוליאדנילציה אלטרנטיבית בסוגי תאים בודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים ספריות של קצוות 3' של mRNA, מנתחים את נתוני הריצוף, מזהים אתרי poly(A) חדשים ומכמתים את השימוש בהם.

אנו מקווים ש-A-seq2 יקל על עבודתכם בחקר הבקרה של עיבוד mRNA ויוביל לתובנות חדשות רבות.