3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא ללכוד ולרצף mRNA שלושה קצוות ראשוניים, ובכך לאפשר מחקרים של עיבוד mRNA, במיוחד שלושה מחשוף ופוליאדנילציה, כמו גם כימות ביטוי גנים. פרוטוקול A-seq2 וחבילת ניתוח הנתונים המוצגים כאן, יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי היצירה והתפקוד של איזופורמים של תעתיק בסוגי תאים ורקמות שונות. היתרונות העיקריים של שיטת A-seq2 הם בכך שהיא נמנעת מרצף דרך מתיחות פולי (A) ארוכות והיא אינה מייצרת דימרים של מתאם.

תאים הגדלים ל-80% מפגש משמשים להליך זה. הסר את מצע הגידול ושטוף את התאים פעם אחת עם PBS. ליזה ישירה של התאים בצלחת על ידי הוספת מיליליטר אחד של מאגר ליזה לכל באר ושימוש במרית גומי כדי לנתק לחלוטין את חומר התא משטח הצלחת.

השתמש בקצה פיפטה של מיליליטר אחד כדי להעביר את הליזט הצמיג מכל באר לצינור פלסטיק של 15 מיליליטר. שתף את ה-DNA עם מזרק מיליליטר אחד המחובר למחט היפודרמית בגודל 23. בצע מספר תנועות נמרצות למעלה ולמטה של הבוכנה, עד שהליזט כבר לא צמיג.

העבירו את הליזאט לצינור של 1.5 מיליליטר. סובב בטמפרטורה של 20, 000 פעמים גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, כדי להסיר את הפסולת. אוספים את הסופרנטנט הצלול מהליזאט.

הוסף לאוליגו d(T)25 חרוזים מגנטיים והשהה מחדש את התערובת. הניחו את הצינורות על גלגל מסתובב למשך 10 דקות. לאחר מכן, הניחו את הצינורות על מתלה מגנטי למשך שתי דקות.

הסר את הנוזל הצלול. הוסף 0.8 מיליליטר של מאגר A לכל צינור וסובב את הצינור ב-180 מעלות פעמיים עד שלוש. הסר את המאגר A מהכביסה השנייה.

מוסיפים 0.8 מיליליטר חיץ B לכל צינור ומשאירים על המדף למשך שתי דקות. כדי להוציא את ה-mRNA הקשור מהחרוזים, הסר את מאגר B, הוסף 33 מיקרוליטר מים לכל צינור והשהה מחדש את החרוזים. מחממים ל-75 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות על בלוק לב.

מיד, סובב את הצינורות למשך שנייה אחת והניח אותם על המתלה המגנטי. העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש. הוסף 66 מיקרוליטר של מאגר הידרוליזה אלקליין לכל צינור, ערבב וחמם בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות בדיוק על בלוק חימום.

מיד מצננים את הצינורות על קרח. לאחר מכן, בצע בידוד RNA באמצעות ערכת ניקוי RNA, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי להתחיל בהליך זה, הוסף לכל דגימת RNA 14 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פולינוקלאוטיד קינאז.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס, למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, טען את תגובות הקינאז על עמודי סיבוב מוכנים. סובב את העמודים ב 735 פעמים גרם למשך שתי דקות.

השליכו את העמודים והניחו את הצינורות עם התגובות שנאספו על קרח. כדי לחסום את שלושת הקצוות העיקריים של שברי RNA כדי למנוע את הצטברותם בתגובות קשירה עוקבות, הוסף לכל דגימה 17.5 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פולי (A) פולימראז. מערבבים ומסובבים שנייה אחת.

דגירה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוסף 32.5 מיקרוליטר מים לכל תגובה וטהר את ה-RNA, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. התחל הליך זה על ידי הנחת התגובות ברכז ואקום למשך 10 דקות, כדי להפחית את הנפח לשישה מיקרוליטר.

לאחר מכן הוסף לכל תגובה 24 מיקרוליטר של RNA ligase Master Mix. דגרו את התגובות על מערבל מחומם בטמפרטורה של 24 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות, עם ערבוב לסירוגין באלף סל"ד. למחרת מוסיפים 17 מיקרוליטר מים לכל תגובה ומערבבים.

טהר את ה-RNA, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מניחים את האלויטים ברכז ואקום למשך שלוש דקות, כדי להפחית את הנפח ל -11 מיקרוליטר. העבר את התגובות לצינורות PCR של 200 מיקרוליטר לתגובת השעתוק ההפוך.

הוסף מיקרוליטר אחד של פריימר. מחממים ב-70 מעלות צלזיוס במחזור PCR למשך חמש דקות ולאחר מכן משאירים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסף שמונה מיקרוליטר של תערובת מאסטר שעתוק הפוך לכל צינור וערבב.

הכניסו את הצינורות למחזור PCR. מחממים ל-55 מעלות למשך 10 דקות ול-80 מעלות למשך 10 דקות נוספות. המשיכו על הקרח.

הכן חרוזי סטרפטווידין, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הוסף את תגובת השעתוק ההפוכה לתמיסת החרוז ודגר בארבע מעלות צלזיוס על גלגל מסתובב למשך 20 דקות. בעזרת מתלה מגנטי שוטפים את החרוזים פעמיים עם מאגר קשירת ביוטין ופעמיים עם מאגר TEN.

השעו מחדש את החרוזים ב-50 מיקרוליטר של מאגר TEN. מוסיפים שני מיקרוליטרים של תערובת האנזים אורציל DNA גליקוזילאז ודוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה במיקסר, עם ערבוב לסירוגין. הוסף 50 מיקרוליטר מים, 11 מיקרוליטר מאגר RNase H ומיקרוליטר אחד של Rnase H, לכל תגובה.

דוגרים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הניחו את הצינורות על המדף המגנטי והעבירו את הנוזל המכיל את ה-cDNA השסוע לצינור חדש. טהר את ה-cDNA השסוע באמצעות ערכת טיהור PCR, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

הנח את ה-cDNA המטוהר ברכז ואקום למשך שמונה דקות כדי להתרכז לנפח של שבעה מיקרוליטר. כדי לחבר חמישה מתאמי פריים לחמשת הקצוות הראשוניים של ה-cDNA המבודד, הוסף לכל דגימה 23 מיקרוליטר של RNA ligase Master Mix ודגירה ב-24 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות. לבסוף, הוסף 70 מיקרוליטר מים לכל תגובה.

פיילוט PCR מבוצע כדי לקבוע את המספר האופטימלי של מחזורי PCR כדי להגיע להגברת הספרייה, בשלב האקספוננציאלי. הכניסו את הדברים הבאים לתוך שפופרת PCR של 200 מיקרוליטר: 25 מיקרוליטר של תערובת DNA פולימראז, 20 מיקרוליטר של תגובת קשירה, שני מיקרוליטר מים, 1.5 מיקרוליטר של פריימר PCR קדימה ו-1.5 מיקרוליטר של פריימר אינדקס PCR הפוך. הפעל את רוכב האופניים עם התוכנית הבאה: שלוש דקות ב-95 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 20 מחזורים של 20 שניות ב-98 מעלות צלזיוס, 20 שניות ב-67 מעלות צלזיוס ו-30 שניות ב-72 מעלות צלזיוס.

אסוף שבע אליקוטים של מיקרוליטר ישירות מהמחזור, לאחר המחזורים המצוינים. הפרד את המוצרים על ג'ל אגרוז 2% ודמיין נדידה של מוצרי PCR. קבע את מספר המחזורים בתחילת ההגברה האקספוננציאלית, 12 מחזורים בדוגמה זו, והשתמש במספר מחזורים זה לתגובת PCR בקנה מידה גדול.

הפרד את המוצרים מתגובת ה-PCR בקנה מידה גדול על ג'ל אגרוז של 2% וחתוך את פרוסות הג'ל המכילות 200 עד 350 תוצרי DNA נוקלאוטיד. לאחר מכן, חלץ את ה-DNA מפרוסות הג'ל עם ערכת מיצוי הג'ל, כמתואר בפרוטוקול הטקסט. רק השלבים החישוביים החשובים ביותר יוצגו בסרטון זה.

פרטים נוספים זמינים בפרוטוקול הטקסט. התחל בשכפול מאגר Git ושינוי לספרייה החדשה שנוצרה. צור סביבה המכילה את התוכנה והפעל סביבה זו.

הורד את רצף הגנום של האורגניזם, ממנו התקבלו נתוני A-seq2. פתח את התצורה file והגדר את פרמטרי הקלט, כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט. התחל את הניתוח.

התגובה של גן ספציפי, NUP214 להפלת חלבון HNRNPC, נבדקה על ידי ניתוח קריאות a-seq2 משתי דגימות של תאי HEK-293, שטופלו ב-RNA מפריע קטן או ב-RNA מפריע קטן של HNRNPC. הקריאות שתיעדו אתרי פולי (A) עם הערות על ידי צינור הניתוח נשמרו בפורמט BAM, ששימש כקלט לדפדפן הגנום IGD. שלושת הקצוות הראשוניים של פסגות הקריאה, ממופים ב-mMRNA שלושה קצוות ראשוניים המסומנים באנסמבל.

הפרופילים מצביעים על שימוש מוגבר באיזופורם הארוכים של שלושת ה-UTR הראשוניים עם נוק-דאון של HNRNCR. לאחר השליטה, פרוטוקול A-seq לוקח שמונה שעות של זמן מעשי או כיומיים עד שלושה, מבלי לספור את הזמן לתרבית התאים ולקשירת הלילה. כאשר מנסים את הפרוטוקול, חשוב לתכנן תחילה סט ראשוני התואם לפלטפורמת הריצוף המשמשת במיקום שלך.

לאחר שהשגת mMRA שלושה קצוות ראשוניים, ניתן ליצור שיטות אחרות, כמו קישור צולב ומשקעים חיסוניים, כדי לזהות רגולטורים של עיבוד קדם-mRNA שלושה קצוות ראשוניים. A-seq2 סלל את הדרך לחוקרים בתחום עיבוד RNA, לחקור את הרגולציה וההשלכות של פוליאדנלציה חלופית בסוגי תאים בודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור ספריות של שלושה קצוות ראשוניים של mRNA, לנתח את נתוני הריצוף שלך, לזהות אתרי פולי (A) חדשים ולכמת את השימוש שלך.

אנו מקווים ש-A-seq2 יקל על עבודתך בהתחלת הרגולציה של עיבוד mRNA ויוביל לתובנות חדשות רבות.