Name: 3 סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: למדו את פרוטוקול A-seq2 למיפוי אתרי עיבוד 3' של pre-mRNA באמצעות ריצוף קצות mRNA. שיטה זו מאפשרת חקר עיבוד RNA וכימות ביטוי גנים במחקר מולקולרי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים תודה גברת Béatrice Dimitriades על העזרה עם התרבות תאים. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מענקים #31003A_170216 ו 51NF40_141735 (NCCR RNA &#38; המחלה).

<ol><li>Jan, C. H., Friedman, R. C., Ruby, J. G., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation%2C+regulation+and+evolution+of+Caenorhabditis+elegans+3%27UTRs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Formation, regulation and evolution of Caenorhabditis elegans 3'UTRs.</a> Nature. 469 (7328), 97-101 (2011).</li>
<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://continuum.io">https://continuum.io</a> (2016).</li>
<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/index.html</a> (2017).</li>
<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Robinson, J. T., Thorvaldsdóttir, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ozsolak, F., Platt, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v461/n7265/full/nature08390.html">Direct RNA sequencing.</a> Nature. 461 (7265), 814-818 (2009).</li>
<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

ריבוי של עזר הגורמים המעורבים בעיבוד pre-mRNA 3' הקצה והליבה משתקף נוף פוליאדנילציה מורכב בהתאמה. בנוסף, פוליאדנילציה הוא גם מגיב לשינויים בתהליכים אחרים כגון שעתוק ו שחבור. 3' סוף המחשוף אתרים ב- pre-mRNAs מזוהים בדרך כלל בהתבסס על זנבות poly(A) האופיינית הנוספים למוצרים המחשוף 5'. רוב שיטות להשתמש oligo(dT) תחל באורכים משתנים המאפשרות המרה ספציפי של פולי (א)-המכיל mRNAs ל cDNAs בתגובה שעתוק במהופך. בעיה נפוצה של גישה זו הוא פנימי לקרקע כדי רצפים א-עשיר וכתוצאה מכך המחשוף מלאכותית אתרים. הוצעו שתי שיטות שמטרתן לעקוף את החפץ הזה בשלב של הכנת הדוגמא. P 3-seq בשיטה 1, מתאמי במיוחד מאתרים בקצוות של זנבות poly(A) עם עזרה של oligo סד ואחריו לעיכול RNase T1 חלקי, שעתוק במהופך עם טרומבוציטופניה, בעקבות התגובות כמו deoxynucleotide היחידה. Heteroduplexes poly(A)-poly(dT) וכתוצאה מכך מתעכלים ואז עם RNase H, והשריד RNA הם מבודדים מאתרים למתאמים, וסודרו. פשוט ואלגנטי שיטה, P 2-seq, המשתמשת פריימר רצף מותאם אישית דילוג רצועת oligo(dT) שנותרו בעקבות רצף תגובות דווח על ידי מחברים אותו 2. בשיטת קשורים, 3' קורא 3, פריימר רב מהמשוער מתוך 5 לנו 45 Ts, מכיל גם של ביוטין הוא annealed ל RNA מפוצלים, ואחריו שוטף מחמירים כדי לבחור עבור מולקולות RNA עם poly(A) זנבות של נוקלאוטידים מעל 50. למרות 3' קריאות באופן דרסטי מפחית את התדירות של לקרקע פנימי, זה לא מונע לחלוטין את זה 3. גם יש כבר הציע פרוטוקולים עבור רצפי RNA ישיר, אבל קריאות וכתוצאה מכך הם קצרים ואם יש שיעור גבוה של שגיאה, גישה זו לא הייתה יותר מפותחת 18,19,20. תיקים עשויים-Seq, הפרוטוקולים חשבים Seq ממוסחר לשלב oligo(dT) מבוסס לקרקע עם צעד לקרקע אקראי עבור ה cDNA השני סטרנד סינתזה 20. השימוש של התגובה שעתוק במהופך בורר תבנית עם רוורס טרנסקריפטאז Moloney מאתר לוקמיה וירוס (MMLV) מוביל אל הדור של cDNAs עם linkers בשלב אחד, ובכך אין הדימרים מתאם יכול להופיע PAS-Seq ופעולות SAPAS 21 , 22.
בשיטת א-seq2 המובאת כאן בולט שלה ניצול נוקלאוטיד cleavable (דו) בתוך פריימר oligo(dT) biotinylated. שינוי זה משלב את התועלת של העשרת oligo(dT) hybridized, polyadenylated מטרות עם ההסרה של רוב הרצף25 oligo (dT) מן השברים מבודד לפני ספריות מוכנות ושמירה על שלושה Ts, אשר מצביעים על נוכחות מוקדמת של הזנב poly(A). לעומת זאת, שיטות לנצל RNase H כדי להסיר poly(A) של מולקולות RNA באקראי להשאיר מספר כמו. מאז ב- A-seq2, רצף נעשית מקצה 3' גדילים תחושה אנטי, המחשוף אתרים הם חזו את להיות ממוקם לאחר מוטיב NNNNTTT בראשית קורא רצף raw. Tetramers אקראי לשמש לא רק כדי לאפשר בסיס התקשרות אלא גם חיסול של PCR הגברה חפצים. גם ניתן לאכלס יותר UMIs. האפשרות לראשוניות פנימי נשאר ב- A-seq2, מופנית שהמפתחות, תחילה על-ידי מחיקת 3' מסתיים עם רצף במורד הזרם מקודד genomically, A-עשיר ולאחר מכן על-ידי מחיקת 3' סוף אשכולות שלא ניתן להסביר על ידי לקרקע פנימי- האות A עשיר poly(A) עצמה. ניתוח האחרונות של אתרי poly(A) להסיק באופן ייחודי על ידי מספר רב של פרוטוקולים מציין באתרים ייחודיים A-seq2 יש את התפלגות נוקלאוטיד הצפוי ואת המיקום בתוך גנים, הדומה אחרים 3' לסיים את רצפי פרוטוקולים.
שלב קריטי ב- A-seq2 הוא הבחירה של polyadenylated RNA הסרת ribosomal RNAs RNAs קטנים שונים. הדבר מתבצע בקלות הרבה ביותר על-ידי ערכת ה-mRNA-בידוד עם oligo (dT)25 beads מגנטי. בעקרון, הכולל RNA מבודדת עם פנול המכיל פתרונות גם נותן באיכות גבוהה RNA יכולה להיות עוד יותר נתונה לבחירה על ידי ערכת ה-mRNA-בידוד או oligo (dT) agarose. צעד זה יכולים להיות מגוונים ב- A-seq2 הוא הטיפול עם אלקליין הידרוליזה שניתן מקוצר או מורחב כדי להשיג RNA מקטעי בגדלים שונים. קריטי הוא גם תוספת של 3' dATP 3' הקצוות של קטעים RNA באמצעות פולימראז poly(A) זה יעיל. בפרוטוקול המתוארים כאן, טיפול זה מוחל על כל חלקי רנ א, כדי להימנע concatemerization במהלך התגובה מצדו. ולבסוף, נציין כי למרות רנ א ליגאז 1 משמש בדרך כלל ליגאז RNA, זה גם ligates ה-DNA נטושים יחיד ביעילות, כפי שעשינו כאן. מאתרים ומפסיקים להשתמש במתאם כדי 5' סוף cDNA מולקולות.
לכן, הוא א-seq2 יעיל וקל ליישם פרוטוקול לצורך זיהוי ה-pre-mRNA 3' סוף עיבוד אתרים. התפתחויות עתידיות יכולות לכלול שמצמצם עוד יותר את המורכבות את הפרוטוקול ואת כמות החומר הנדרש. קבוצת כלי ניתוח נתונים חישובית נוספים הקשורים מאפשרים עיבוד הומוגנית של 3' סיום רצף קריאות שהושג עם מגוון רחב של פרוטוקולים.

לכידת ורצף של mRNA 3' הקצוות מאפשר חקר עיבוד mRNA כימות של ביטוי גנים. עקב הזנבות שלהם poly(A), mRNAs האיקריוטים יכול ביעילות להיטהר מן התא סך הכל lysates עם חרוז. מרותק למיטה oligo-deoxythymidine (oligo(dT)) מולקולות, אשר יכול גם פריים cDNA סינתזה. עם זאת, גישה זו יש שני חסרונות. ראשית, המופרת של א' כי הם פנימי תעתיקים יכול גם פריים cDNA סינתזה, וכתוצאה מכך אתרי poly(A) כדין. Poly(A) השני, הומוגניות מותח מהוות אתגרים ספציפיים עבור רצף, מלבד היותו לא אינפורמטיבי לזיהוי תעתיק. גישות שונות הוצעו כדי לעקוף את מגבלות אלו, כגון שעתוק במהופך דרך poly(A) זנבות ואחריו RNase H עיכול (seq P 3- 1), שימוש פריימר רצף מותאם אישית המסתיימת ב- 20 Ts (2, P-seq 2), פולסים עם כיוון מוקדם של שברי RNA עם poly(A) זנבות של נוקלאוטידים מעל 50 עם פריימר45 CU5T ולאחריו RNase H עיכול (3' קריאות 3), ושימוש של פריימר oligo-dT המכיל 3' המתאם סיכת ראש (A-seq 4).
שיטה א'-seq2 פיתחה לאחרונה 5 שואפת לעקוף את רצף דרך poly(A), באותו זמן כדי למזער את הפרופורציה של הדימרים הנוצרים על-ידי עצמית מצדו של מתאמי, במיוחד המתרחשים כאשר ריכוז מולרי של מתאמי עולה ריכוז הוספה. בעיה זו ניתן לסלק כאשר שני מתאמי מאתרים לאותו סוג של polynucleotide מסתיים כמו א-seq2, שבו 3' המתאמים מאתרים לסוף 5' קטעים RNA, המתאמים 5' 5' בסוף cDNAs לאחר שעתוק במהופך. השיטה היא נוחה יותר מאשר שלנו בעבר המוצע A-seq - שבו היה רצף של 5'-כדי-3 ' כיוון ובכך הדורשות דיוק נשלט RNA פיצול-, תוך שמירה על רמת דיוק גבוהה של זיהוי אתר poly(A). סביב 80% הקריאות ברצף בדגימות טיפוסי למפות באופן ייחודי הגנום, להוביל זיהוי של יותר מ-20,000 poly(A) אתר אשכולות, יותר מ-70% אשר חופפים עם המבואר 3' UTRs.
בקצרה, פרוטוקול א-seq2 מתחיל עם ה-mRNA ולהפיק מצדו של מתאמי הפוכה המשלים 3' 5' בקצוות של קטעים RNA. פוליפוני (א)-RNAs המכיל נארזים הפוכה עיבד עם פריימר oligo(dT) ארוך נוקלאוטיד 25 (nt) המכיל של נוקלאוטיד עיגון בקצה 3', על dU במיקום 4 ו של ביוטין 5' בסוף, המאפשר קשירה של cDNA כדי streptavidin מגנטי חרוזים. רוב הראשיים, כולל של ביוטין, יוסר cDNA על-ידי פצילות ב- dU על ידי שילוב אנזים המשתמש, המכילה DNA אורציל glycosylase (UDG), את ה-DNA glycosylase-lyase Endonuclease השמיני. התגובה הזו יוצא מסתיימת ללא פגע מצדו של מתאם 5', ואת השמאלית Ts שלושה לאחר המחשוף להישאר כדי לסמן את המיקום של הזנב poly(A). כי 5' והן 3' מתאמים המחוברים על ידי מצדו הנמען 5' הקצוות, הדימרים מתאם לא נוצרים. ארבעה נוקלאוטיד אקראי-שהרובוט הציג בראשית קורא מאפשר רזולוציה אשכול בכלים רצף המדינה-of-the-art, יכול לשמש גם מזהה ייחודי מולקולרית (UMI) באיתור ובהסרה של PCR הגברה חפצים. הגודל של UMI ניתן להגדיל עוד יותר כפי שנעשה מחקרים אחרים 6. הפרוטוקול יוצר קריאות שמבטלות משלימים mRNA 3' הקצוות, הכל מתחיל עם tetramer אקראי ואחריו 3 Ts. עיבוד של קורא את יש את 3 Ts האבחון שלהם 5' סוף מתחיל התיקון של ה-PCR הגברה חפצים על ידי ניצול של UMIs, הסרה של 3' מתאם רצפים, ולהפוך קומפלמנטציה. קריאות כי ייתכן שיש מקורם oligo(dT) לקרקע באתרים A עשיר פנימי גם מזוהה שהמפתחות, יימחקו. האתרים כדין בדרך כלל חסר אחד 18 מאופיין היטב וממוקם אותות poly(A) שנשמרת שאמור להיות ~ 21 נוקלאוטידים במעלה הזרם של האתר המחשוף לכאורה 7.
הפרוטוקול דורש כ 8 הפעם תרגולים h, לא כולל תרבית תאים, את ligations לילה. המשויך לקרוא ניתוח תוכנה מאפשרת זיהוי אתר של poly(A) ומדויקים. מתוך אתר poly(A) אשכולות שנוצרו בהתבסס על דגימות 4 מודגשת עוד יותר את כתב היד (שני ביולוגי ושכפול של שליטה siRNA ותאים סי HNRNPC-שטופלו) 84% חפיפה עם ג'ין המבואר, ועל אלה, 75% חפיפה עם 3' UTR, 86% עם כל אחד 3' UTR או של אקסון מסוף. מקדם המתאם פירסון של ביטוי של 3' קצוות הדגימות שכפל 0.92, הערכים של מעל 0.9 מתקבלים בדרך כלל עם השיטה. לפיכך, A-seq2 היא שיטה נוחה זה נותן תוצאות מאוד לשחזור.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגרוז, טהור במיוחד</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 ביו-אנלייזר</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>קורדיספין טריפוספט (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>DNA בקבוקונים עם קשירה נמוכה, 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s פוספט חוצץ מלח</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT ערכת</td><td>אמביון</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>GR-צבע ירוק</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>השתמש בדילולציה של 1:10,000</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 או NextSeq 500 רצפים מהדור הבא</td><td>Illumina</td><td>שאל עם הספק</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA פולימראז תערובת</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי נוקלאז</td><td>אמביון</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>פולי (A) פולימראז, שמרים</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>פולי (A) פולימראז, E.coli</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>ערכת</td> מיצוי ג'ל QIAEX <td></td></tr><tr><td>II</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיצוי ג'ל QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, ריכוז גבוה</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0437M</td><td>כולל ערכת ניקוי RNA PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, מעכב ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Superscript IV reverse transcriptase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER תערובת אנזימים</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 מתלה מגנטי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>מיקסר מחומם עם מכסה מחומם</td></tr><tr><td>עמודות MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline מאגר הידרוליזה, 1.5 x</td><td></td><td></td><td>ערבוב חלק 1 0.1 M Na2CO3 ו-9 חלקים 0.1 M NaHCO3. הוסף EDTA ל -1 מ"מ. התאם את ה-pH ל-9.2. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>5x poly(A) פולימראז מאגר</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 מ"מ Tris-HCl, pH 7.0, 3 מ"מ MnCl2, 0.1 מ"מ EDTA, 1 מ"מ DTT, 0.5 מ"ג/מ"ל BSA אצטיל, 50% גליצרול</td></tr><tr>מאגר <td></td><td></td><td>קשירת ביוטין</td><td>20 מ"מ Tris&shy; Cl pH 7.5, 2 M NaCl, 0.1% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>TEN מאגר</td><td></td><td></td><td>10 מ"מ Tris&shy; Cl, pH 7.5, 1 מ"מ EDTA, 0.02% NP&shy; 40</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>רצף</חזק></td></tr><tr><td><חזק>אוליגונוקלאוטידים לפי ערכות הכנה לדגימות RNA קטנות של Illumina TruSeq, עבור רצפי GA-IIx ו-Hiseq2000/2500</חזק></td><td><חזק>מיקרוסינת</חזק></td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>מיקרוסינת'</td><td></td><td>5' אמינו וביישי; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&sביישן; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' אמינו וביישי; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, פריימר RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A או C)</td></tr><tr><td>PCR פריימר קדימה, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>פריימר הפוך, RPI1, ברקוד</td><td>במיקרוסינת'</td><td></td> <td>מודגש5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Oligonucleotides על פי ערכות הכנה לדגימות RNA קטנות של Illumina TruSeq HT, עבור רצפי HiSeq2000/2500 ו-NextSeq500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>מיקרוסינת'</td><td></td><td>5'-אמינו-GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, פריימר RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotin-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3'PCR</td></tr> <tr><td>פריימרים קדימה (D501-506)</td><td>Microsynth או Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>פריימרים הפוכים (D701-D712)</td><td>מיקרוסינת' או אילומינה</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'תיעוד</td></tr> <tr><td>לריבוב Illumina:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

מחקרים בעשור האחרון נחשפו מגוון מורכב ודינמי, של ה-pre-mRNA המחשוף ותגובות פוליאדנילציה. mRNAs עם זמן 3' ללא תרגום אזורים (UTRs) נוצרות בתאים הבדיל ואילו תאים מתרבים מעדיפים לבטא תעתיקים עם קצר 3' UTRs. אנו מתארים פרוטוקול A-seq, (י) בהגרסה השנייה שלה, אשר פותחה כדי למפות פוליאדנילציה אתרים ברמת הגנום וללמוד ברגולציה של ה-pre-mRNA 3' סיום העיבוד. גם בפרוטוקול הנוכחי זה מנצל polyadenylate (זנב poly(A)) הנוספים במהלך להן של mRNAs יונקים ביותר להעשיר עבור mRNAs מעובד באופן מלא. מתאם ה-DNA עם deoxyuracil על מעמדה הרביעי מאפשר עיבוד מדויק של קצה 3' mRNA קטעים על רצף. לא כולל התרבות תאים, את ligations בין לילה, הפרוטוקול דורש כ 8 h הפעם תרגולים. יחד עם זאת, חבילת תוכנה קלה לשימוש עבור הניתוח של הנתונים רצף נגזר מסופק. A-seq2 ותוכנת ניתוח המשויך לספק פתרון יעיל ואמין המיפוי של 3' ה-pre-mRNA מסתיים במגוון רחב של מחלות, מ-106 או פחות תאים.

פוליפוני (א)-המכיל RNA היה מבודד מן התאים בתרבית, מפוצל על ידי הידרוליזה אלקליין, cDNAs נעשו על ידי הפוך תמלול עם תחל oligo(dT). CDNA וכתוצאה מכך היה מתאושש על streptavidin חרוזים, dU היה ביקע ב התגובה כריתה מסוים אורציל, מתאמי היו מאתרים כדי 5' ו 3' קצוות השבר cleaved ושל השרוול היו וסודרו. איור 1 מציג קו מיתאר גרפי של הניסוי.
עבור תאים הלה ו- HEK293, 106 תאים היו מספיקות לזהות אתרי poly(A) עבור הרוב המכריע של חלבונים גנים בסופו של ההליך. עם זאת, עבור סוגי תאים או רקמות שייתכן צורך לבדוק את הרוויה במספר אתרים poly(A) מזוהה כמספר של תאים המשמשים את הניסוי אחרים מגדילה. תוצאות נציג ה-PCR פיילוט צעד, של המקטע דנ א ניתוח המדגם לפני רצף מוצגים באיור2.
איור 3 מראה את השלבים מראש עיבוד של ניתוח חישובית, החל מקובץ fastq המתקבל הרצפים (sequencer) ומסתיימת בדקנו איכות, חיתוך מתאם קריאות לפיהן ניתן למפות את הגנום. איור 4 מציג את השלבים ניתוח המתחילות המיפוי הקריאות הגנום ולסוף המתאים עם הקטלוג של mRNA 3' end עיבוד אתרים המזוהים ב מדגם מסוים. כאשר מספר דוגמאות מנותחות, פעולות נוספות מתבצעות כדי להתאים את הקצה 3' עיבוד אתרים שנמצאו דוגמאות בודדות ולדווח שלהם שפע מדגמים. השלבים הבאים מוצגים באיור5.
לכן, ברגע שיש כבר וסודרו דגימות, הניתוח של הרצף וכתוצאה מכך. לקרוא את הקבצים (בפורמט fastq) דרך צינור עיבוד זמין היא פשוטה. לאחר הוספת מידע אודות הדגימות לקובץ התצורה, ההוצאה להורג של הצינור תגרום שני סוגים עיקריים של קבצי פלט: 1) מיטה-קבצים עם כל 3' סוף אתרי עיבוד מזוהה בדגימות בודדים (למשל " sample1.3pSites.noIP.bed.gz"), ו- 2) מיטה-קובץ עם כל אשכולות באתר poly(A) (clusters.merged.bed) בכל הדוגמאות של המחקר. הפלט כולל גם את נקודות הציון של הגנום עבור כל פעולות הקריאה של כל דגימה בודדת (למשל "sample1. STAR_out/Aligned.sortedByCoord.out.bam") אשר מאוחר יותר ניתן להציג בדפדפן הגנום igv ב16. בדיקה ויזואלית של פרופילי קרא בדרך כלל מספק הצצה ראשונה של ההתפלגות poly(A) אתרים הגנום, השינויים המתרחשים בעת לפליטת ספציפיות שבוצעו במסגרת המחקר. לדוגמה, באיור 6 מוצג התגובה של גנים ספציפיים הדפיקה למטה של החלבון HNRNPC.
סיכומים של הפצות הגנום כולו אלה הינם גם מסופקים (טבלה 1). באופן ספציפי, קבצי פלט בספריה "ספירות/annotation_overlap" מכילים שברים של אתרים חפיפה עם תכונות המבואר ספציפיות (מהקובץ gtf סיפק כקלט; מבואר מסודרים: 3' UTR, אקסון מסוף, אקסון, אינטרון, intergenic). לבסוף, עבור כל דגימה, התוצאות של שלבי עיבוד בודדים גם נשמרים (למשל "sample1.summary.tsv"). זה כולל את המספרים של: קריאות raw כל דגימה, קריאות בעלות המבנה הצפוי בקצה 5', קריאות שנותרו לאחר כיווץ כפילויות PCR מלא, באיכות גבוהה קורא על-פי הקריטריונים שהוגדרו בשלב 9.2, קורא את המפה באופן ייחודי כדי הגנום (לאחר כיווץ אלו שנבעו רצף שגיאות, ראה שלב 9.5), מיפוי מרובה קורא (לאחר כיווץ אלו שנבעו רצף שגיאות, ראה שלב 9.5), raw (לא מקובצים באשכולות) 3' סוף עיבוד אתרים בשני צדדיו דוגמה, raw 3' עיבוד אתרים בלי מועמדים פוטנציאליים לקרקע פנימי, ייחודי 3' סוף אתרי עיבוד של כל הדגימות בלי מועמדים פנימיים לקרקע, קבוצה סופית של poly(A) אתר אשכולות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
איור 1: שלבים עיקריים של פרוטוקול א-seq2. צעדים בודדים נקובים על הצד השמאלי של האיור. הוספה RNA מקטעי מתוארים בקווים זה הופך לאדום עבור cDNA לאחר שעתוק במהופך; מתאמי הם בצבע כחול בהיר או תפוז. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
איור 2: טייס ה-PCR ופרופיל המוצר הסופי- () Aliquots מן התגובה PCR היו שנאספו מחזורים שונים ומופרדות על 2% agarose ג'לים. המספרים שמאלה מציינים גודל נוקלאוטידים הלהקות בהתאמה בסולם הדנ א. בניסוי זה נבחרו 12 מחזורים (*) עבור התגובה PCR בקנה מידה גדול. (b) דוגמה של מדגם לאחר בחירת גודל לרוץ על מנתח גודל המקטע חושפני עם גודל ממוצע של נוקלאוטידים בסביבות 280. המספרים שמאלה [פו] מציינים עוצמת האות יחסית. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
איור 3: חלוקה של עיבוד קדם רצף קריאות. הקבצים fastq עם קריאות הנוצרים על-ידי התוכנה כלי-הקשורים רצף מעובדים לזהות קריאות באיכות גבוהה זה ניתן למפות את הגנום המתאימים. האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים אל המדרגות בודדים של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
איור 4: חלוקה של רצף לקרוא עיבוד, מן השלב של מיפוי הגנום לדור של הפרט 3' סוף אתרי עיבוד. האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים iצעדים והקבוצתית של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". קובץ הפלט הראשי הנשלחת למשתמש מסומן באותיות מודגשות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
איור 5: קווי המתאר של הפעולות הננקטות כדי להפיק אשכולות של שיתוף מוסדר 3' סיום רצף אתרים- האיור מציג את המפרט קלט/פלט של צעדים בודדים בצנרת, עם קישורים אל המדרגות בודדים של הפרוטוקול המתואר בסעיף "עיבוד נתונים". קובץ הפלט הראשי מסומן באותיות מודגשות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
איור 6: תוצאות דוגמה לפרופיל של 3' לסיים את עיבוד קריאות לאורך אקסון מסוף של הגן NUP214, שמוצג בדפדפן הגנום 16 igv ב. A-seq2 קריאות הוכנו מדגימות שני תאים HEK 293, מטופלים עם שליטה-siRNA או עם siRNA HNRNPC. קריאות שתועדו אתרי poly(A) היו מוערת על-ידי הצבר ניתוח נשמרו בתבנית באם ששימש כקלט לדפדפן הגנום igv. הקצוות 3' של הפסגות לקרוא מפה 3' ה-mRNA מסתיים כי הם מבואר ב- Ensembl. הפרופילים מצביעים על שימוש מוגבר ארוך 3' UTR isoform על HNRNPC דפיקה למטה. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>סי-בקרת שכפול 1</td>
			<td>סי-בקרת שכפול 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>קוד: 29765</td>
			<td>קוד: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות raw</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות בתוקף לאחר קיצוץ וסינון</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר ייחודי מיפוי קריאות</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר הקריאות מיפוי מנחלת מרובים</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מספר בודדים 3' סוף אתרי עיבוד</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: דוגמה פלט של הצינור ניתוח. סיכומים של קורא את התקבלו ב צעדים בודדים.

פרוטוקול זה מתאר שיטת ה-pre-mRNA מיפוי 3' עיבוד אתרי קצה.

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

המטרה הכללית של שיטה זו היא ללכוד ולרצף קצוות' 3 של mRNA, ובכך לאפשר מחקרי עיבוד של mRNA, ובמיוחד שסוף קצה' 3 ופוליאדניליציה, כמו גם כימות של ביטוי גנים. פרוטוקול ה-A-seq2 וחבילת ניתוח הנתונים המוצגים כאן, יכולים לסייע במתן מענה לשאלות מפתח לגבי היווצרותן ותפקודן של איזופורמים של תמלילים בסוגי תאים ורקמות שונים. היתרונות המרכזיים של שיטת A-seq2 הם שהיא מונעת ריצוף דרך רצפי poly(A) ארוכים ואינה מייצרת דימרים של אפדפטורים.לפרוצדורה זו משתמשים בתאים שהגיעו ל-80% התמסרות (confluency). הסירו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. בצעו ליזיס ישיר של התאים על הפלטה על ידי הוספת מיליליטר אחד של תמיסת ליזיס לכל באר, והשתמשו בשפכטל גומי כדי להפריד לחלוטין את חומר התאים מפני השטח של הפלטה.השתמשו בקצה פפית של 1 מיליליטר כדי להעביר את הליזאט הצמיגי מכל באר לתוך מבחנה פלסטיק של 15 מיליליטר. ערבבו את ה-DNA באמצעות מזרק של 1 מיליליטר שמחוברת אליו מחט היפודרמית בנחש (gauge) 23. בצעו מספר תנועות חזקות של הבוכנה למעלה ולמטה, עד שהליזאט לא יהיה צמיגי יותר.העבירו את הליזאט למבחנה של 1.5 מיליליטר. סבבו ב-20,000 ×g ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, כדי להסיר את השאריות. אספו את העלייה הצלולה מהליזאט.הוסיפו חרוזי מגנט oligo d(T)25 וערבבו מחדש את התערובת. הניחו את המבחנות על גלגל סיבוב למשך 10 דקות. לאחר מכן, הניחו את המבחנות על מעמד מגנטי למשך שתי דקות.הסיר את הנוזל השקוף. הוסף 0.8 milliliters של buffer A לכל מבחנה וסובב את המבחנה ב-180 מעלות פעמיים עד שלוש פעמים. הסר את buffer A מהשטיפה השנייה.הוסיפו 0.8 milliliters של buffer B לכל מבחנה והשאירו על המעמד למשך שתי דקות. כדי לאלוט את ה-mRNA הקשור מהחרו지를, הסירו את buffer B, הוסיפו 33 microliters של מים לכל מבחנה, ותלו את החרו지를 מחדש. חממו ל-75 degrees Celsius למשך חמש דקות על בלוק חימום.מיד לאחר מכן, סובבו את המבחנות למשך שנייה אחת והניחו אותן על המגנט. העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה. הוסיפו 66 µL של alkaline hydrolysis buffer לכל מבחנה, ערבבו וחממו ב-95 °C למשך בדיוק חמש דקות על בלוק חימום.קררו מיד את המבחנות על קרח. לאחר מכן, בצעו בידוד RNA באמצעות ערכה לניקוי RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהליך זה, הוסיפו לכל דגימת RNA 14 µL של תערובת מאסטר (Master Mix) של פולינוקלאוטיד קינאז.הדגירה תתבצע בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, העבירו את תגובות הקינאז לעמודי ספין (spin columns) מוכנים. סובבו את העמודים ב-735 ×g למשך שתי דקות.שפכו את התכולה מהעמודות והניחו את המבחנות עם התגובות שנאספו על קרח. כדי לחסום את הקצוות 'פיריימ' (3') של מקטעי ה-RNA על מנת למנוע את קונקטמריזציית הם בתגובות ליגציה עוקבות, הוסיפו לכל דגימה 17.5 microliters של poly(A)polymerase Master Mix. ערבבו וסובבו במערך צנטריפוגי למשך שנייה אחת.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, הוסיפו 32.5 µL של מים לכל תגובה וטהרו את ה-RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. התחילו הליך זה על ידי הנחת התגובות במרכז ריכוז בוואקום למשך 10 דקות, כדי להפחית את הנפח ל-6 µL.לאחר מכן, הוסיפו לכל תגובה 24 µL של תערובת מאסטר (Master Mix) של RNA ligase. דגרו את התגובות על שייקר מחומם בטמפרטורה של 24 °C למשך 16 שעות, עם ערבוב לסירוגין במהירות של 1,000 RPM. למחרת, הוסיפו 17 µL של מים לכל תגובה וערבבו.טהרו את ה-RNA, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הניחו את התמיסות שחולצו (eluites) במרכז ריכוז בוואקום למשך שלוש דקות, כדי להפחית את הנפח ל-11 µL. העבירו את התגובות למבחנות PCR בנפח 200 µL לצורך תגובת השעתוק ההפוך.הוסיפו מיקרוליטר אחד של פריימר. חממו בטמפרטורה של 70 °C במכשיר PCR למשך חמש דקות, ולאחר מכן השאירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של תערובת מאסטר (Master Mix) לשעתוק הפוך לכל מבחנה וערבבו.הניחו את המבחנות במכשיר PCR. חממו ל-55 °C למשך 10 דקות ולאחר מכן ל-80 °C למשך 10 דקות נוספות. שמרו על קרח.הכינו חרוזי streptavidin, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הוסיפו את תגובת השעתוק ההפוך לתוך תמיסת החרוזים והדגרירו בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על גלגל סיבוב למשך 20 דקות. בעזרת מתקן מגנטי, שטפו את החרוזים פעמיים בבופר biotin bindingB ופעמיים בבופר TEN.שחזר את החרוצים ב-50 µL של TEN buffer. הוסף שני µL של תערובת אנזים uracil DNA glycosylase והדגר ב-37 °C למשך שעה במיקסר, תוך ערבוב לסירוגין. הוסף 50 µL של מים, 11 µL של RNase H buffer ומיקרוליטר אחד של Rnase H לכל תגובה.דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות. הניחו את המבחנות על המגנט (magnetic rack) והעבירו את הנוזל המכיל את ה-cDNA המגזוז למבחנה חדשה. טהרו את ה-cDNA המגזוז באמצעות ערכה לטיהור PCR, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.העבירו את ה-cDNA המטוהר למרכז ריכוז בוואקום למשך שמונה דקות כדי לרכז אותו לנפח של 7 µL. כדי לבצע ליגציה של מתאמי 5' לקצוות ה-5' של ה-cDNA המבודד, הוסיפו לכל דגימה 23 µL של RNA ligase Master Mix והדגירו בטמפרטורה של 24 °C למשך 20 שעות. לבסוף, הוסיפו 70 µL של מים לכל תגובה.מבוצע PCR פיילוט כדי לקבוע את מספר מחזורי ה-PCR האופטימלי להגעה להגברה של הספרייה, בתוך השלב האקספוננציאלי. העבירו בפיפטה את הרכיבים הבאים לשפרורת PCR בנפח 200 microliter: 25 microliters של תערובת DNA polymerase, 20 microliters של תגובת ליגציה, two microliters של מים, 1.5 microliter של פריימר PCR קדימה ו-1.5 microliter של פריימר PCR אינדקס אחורה. הפעילו את מכשיר המחזור (cycler) עם התוכנית הבאה: שלוש דקות ב-95 degrees Celsius, ואחריהן 20 מחזורים של 20 שניות ב-98 degrees Celsius, 20 שניות ב-67 degrees Celsius ו-30 שניות ב-72 degrees Celsius.אספו מנות של 7 µL ישירות מהסייקלר, לאחר המחזורים המצוינים. הפרידו את התוצרים על ג'ל אגרוז 2% והדמינו את נדירות תוצרי ה-PCR. קבעו את מספר המחזורים בתחילת ההגברה האקספוננציאלית (במקרה זה, 12 מחזורים), והשתמשו במספר מחזורים זה עבור תגובת PCR בקנה מידה גדול.הפרידו את התוצרים מתגובת ה-PCR בקנה מידה גדול על ג'ל אגרוז 2% וגזרו את פלחי הג'ל המכילים תוצרי DNA של 200 עד 350 נוקלאוטידים. לאחר מכן, חלצו את ה-DNA מפלחי הג'ל באמצעות ערכת בידוד ג'ל (gel extraction kit), כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בסרטון זה יוצגו רק השלבים החישובים החשובים ביותר.פרטים נוספים זמינים בפרוטוקול הכתוב. התחילו בשבט (cloning) של מאגר ה-Git ובמעבר לספרייה שנוצרה acabado. צרו סביבה המכילה את התוכנה והפעילו סביבה זו.הורידו את רצף הגנום של האורגניזם ממנו הופקו נתוני A-seq2. פתחו את קובץ התצורה והגדירו את פרמטרי הקלט, כפי שצוין בפרוטוקול הכתוב. התחילו את הניתוח.התגובה של גן ספציפי, NUP214, להשתקת החלבון HNRNPC, נבחנה על ידי ניתוח קריאות a-seq2 משני דגימות של תאי HEK-293, שטופלו ב-RNA מפריע קטן (siRNA) של ביקורת או ב-siRNA של HNRNPC. הקריאות שתיעדו אתרי poly(A) שאונוטציה על ידי צינור הניתוח נשמרו בפורמט BAM, ששימש כקלט לדפדפן הגנום IGD. הקצוות של ה-prime three של שיאי הקריאות מופו לקצוות prime three של mMRNA המאannotated ב-ensemble.הפרופילים מעידים על שימוש מוגבר באיזופורמה הארוכה של ה-UTR' 3 בעקבות knockdown של HNRNCR. לאחר השליטה בשיטה, פרוטוקול ה-A-seq דורש שמונה שעות של עבודה מעשית או כיומיים עד שלושה ימים, ללא احتساب הזמן עבור תרבית התאים והליגציות למשך הלילה. בעת ביצוע הפרוטוקול, חשוב לתכנן תחילה סט ראשוני התואם לפלטפורמת הרצף המשמשת במעבדתכם.לאחר השגת הקצוות של ה-3' של ה-mRNA, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון קישור צולב (cross linking) ושיקוע חיסוני (immunoprecipitation), כדי לזהות רגולטורים של עיבוד קצוות 3' של pre-mRNA. שיטת A-seq2 סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום עיבוד ה-RNA לחקור את הרגולציה וההשלכות של פוליאדנילציה אלטרנטיבית בסוגי תאים בודדים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים ספריות של קצוות 3' של mRNA, מנתחים את נתוני הריצוף, מזהים אתרי poly(A) חדשים ומכמתים את השימוש בהם.אנו מקווים ש-A-seq2 יקל על עבודתכם בחקר הבקרה של עיבוד mRNA ויוביל לתובנות חדשות רבות.

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מתארים שיטה להכנת שני יחיד לקרוא לזווג Illumina סוף mRNA-Seq ספריות לניתוח רצפי גנים הביטוי מבוסס על הגברה T7-RNA ליניארי. פרוטוקול זה דורש רק 10 ננוגרם של רנ"א הכל החל ומייצר ספריות עקבי מאוד המייצגים תמלילי כולו.

יחיד קרא מותאמים mRNA-Seq סוף Illumina ספריות מ -10 ננוגרם RNA סך הכל

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

מתוארת מערכת משולבת לריצוף ממוקד של הדור הבא של דגימות אונקולוגיות. מערכת חוצת פלטפורמות זו מותאמת לביופסיות גידול באיכות נמוכה ובכמות נמוכה, מתאימה לתשומות DNA נמוכות, כוללת בקרות מרובות וריאנטים מאופיינות היטב, וכוללת מתקשר וריאנט חדש המבוסס על אמצעי בקרת איכות כמותיים טרום-אנליטיים.

אינטגרציה של Wet ותהליכי ספסל יבשים מבצעת אופטימיזציה ממוקד רצף הדור הבא של איכות נמוכה וביופסיות גידול נמוכה כמות

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

הדור הבא רצפי (הגדרות) הוא כלי רב עוצמה עבור אפיון גנומית זה מוגבל על ידי שיעור שגיאה גבוהה של פלטפורמת (~0.5–2.0%). אנו מתארים את השיטות שלנו של רצף שגיאות המאפשרים לנו במחלקותיכם שיעור שגיאה המיתרים, לזהות מוטציות ב- variant אלל שברים כמו שנדיר למצוא 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

הזיהוי של האינטראקציות פיזי בין גנים לבין אלמנטים התקינה הוא מאתגר אבל כבר בהנחייתם של כרומוזום קונפורמציה ללכידת שיטות. שינוי זה בפרוטוקול 4C-seq מפחית את הסיכון של ה-PCR הטיה על-ידי צמצום יתר הגברה של תבניות ה-PCR ומגדיל את mappability את הקריאות על-ידי שילוב צעד תקציר של אנזים הגבלה תוספת.

זיהוי תפוקה גבוהה של ג'ין רצפים תקינה באמצעות רצף הדור הבא של כרומוזום מעגלי קונפורמציה ללכוד (4C-seq)

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

מאמר זה מציג פרוטוקול לביצוע פרופיל טרנסקריפטומי מרחבי מקיף של RNA מארח, ויראלי, פטרייתי ומיקרוביום מקטעי רקמה משובצים בפרפין קבוע פורמלין באמצעות Stereo-seq, המאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של טרנסקריפטומים מגוונים תוך שמירה על ארכיטקטורת רקמות.

פרופיל מרחבי מקיף של טרנסקריפטומים אגנוסטיים למינים באמצעות סטריאו-רצף

בניה של ספריה fosmid עם הדנ"א הגנומי הסביבה מבודדים רצף העומק האנכי של פיורד hypoxic עונתיות מתואר. הספרייה שיבוט המתקבל הוא הרים את 384 גם צלחות בארכיון עבור סידור במורד וסינון תפקודית על ידי יישום של מערכת המושבה אוטומטיות קטיף.

הכנס גדול הסביבה הגנום ספריית הפקה

למדו את פרוטוקול A-seq2 למיפוי אתרי עיבוד 3' של pre-mRNA באמצעות ריצוף קצות mRNA. שיטה זו מאפשרת חקר עיבוד RNA וכימות ביטוי גנים במחקר מולקולרי.

3' סיום רצף ספריית הכנה עם א-seq2

גלה סרטונים נוספים