تشريح مجمع العين والدماغ من Fly Pupae: طريقة لعزل أنسجة الشبكية

Overview

يصف هذا الفيديو كيفية تشريح وعزل مجمع العين والدماغ من الجراء Drosophila. ويوضح البروتوكول المميز الإجراء الذي ينتج عنه أنسجة عالية الجودة، متوافقة مع، على سبيل المثال، التثبط المناعي، فضلا عن تجارب التعبير الجيني الأخرى.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من DeAngelis و Johnson ، تشريح شبكية العين الجراء Drosophila للكيمياء المناعية ، التحليل الغربي ، وعزل الحمض النووي الريبي ،   J. Vis. Exp. (2019).

1. إعداد الأنسجة

1. إعداد الصلبان Drosophila (كما هو موضح سابقا في غرينسبان، كولد سبرينغ هاربور مختبر الصحافة ، (2004)) أو ثقافة سلالات Drosophila محددة للحصول على الخوادر من النمط الجيني المطلوب. لضمان ظهور عدد كبير من الخوادر بشكل متزامن ، قم بإنشاء هذه الثقافات الطائرة مكررة على الوسائط الغذائية الغنية بالمغذيات أو الوسائط الغذائية القياسية المكملة بسخاء مع معجون الخميرة.
2. الحفاظ على ثقافات دروسوفيلا عند 25 درجة مئوية. بالنسبة لل والصلبان التي تستخدم نظام UAS-GAL4 ، فإن GMR-GAL4 هو سائق مثالي يتم التعبير عنه في خلايا قرص العين اليرقات الخلفية للفرو المورفوجيني وطوال تطور الجرو. الصليب UAS-lacZ X GMR-GAL4 بمثابة الصليب التحكم المثالي لأنه يدفع التعبير عن البروتين غير الذاتية وغير الخاملة β-galactosidase.
3. استخدام غيض من 6 "جبيرة الخيزران التي تم الرطب مع الماء المقطر لرفع بلطف الأبيض قبل pupae (الشكل 1B) من جانب قوارير ثقافة صحية (الشكل 1A) ومكان في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل (الشكل 1C).
4. وضع الأنابيب في مربع تلميح ماصة بلاستيكية جنبا إلى جنب مع قطعة صغيرة من الأنسجة غارقة في الماء المقطر للحفاظ على الغرفة في رطوبة كافية لحماية الخوادر من الجفاف (الشكل 1D). احتضان الخوادر في 25 درجة مئوية حتى تشريح.
5. استخدام جبيرة الخيزران الجافة 6 "لدفع بلطف الخوادر من أنبوب الطرد الدقيق وعلى طبق تشريح أسود. وضع قطعة جديدة من الشريط على الوجهين على طبق تشريح بعيدا عن الخوخ.
6. باستخدام زوج من ملقط، وضع بعناية الجانب الظهري pupae حتى (أي، operculums التي تواجه، الشكل 1B) على الشريط (الشكل 2A). تأكد من أن الخوادر تلتزم بشكل جيد إلى الشريط.
   ملاحظة: الرطوبة على حالة pupal سوف تمنع الالتصاق آمنة إلى الشريط، وفي هذه الحالة، تسمح للجرو لتجف الهواء قبل وضعها على الشريط على الوجهين.

2. تشريح مجمعات العين الدماغ

1. استخدام ملقط لإزالة operculum من كل جروة (الشكل 2C).
2. استخدام مقص microdissection لشريحة أو قطع فتح حالة pupal من كل pupa. رفرف فتح حالة pupal للكشف عن الرأس والصدر، والجزء البطن الأمامي، وتأمين حواف حالة pupal إلى الشريط على الوجهين (الشكل 2C).
   ملاحظة: ليس من الضروري الكشف تماما عن الخوادر.
3. بيرس البطن من كل جروة مع ملقط حاد، لفهم الحيوان، وإزالتها من حالة pupal لها (الشكل 2C).
4. ضع الخوخ على طبق التشريح الأسود ، بعيدا عن الشريط ، وغطه بحوالي 400 ميكرولتر من محلول الفوسفات البارد الجليدي (PBS ، pH 7.4).
5. فهم كل جروة من البطن مع ملقط، ومع مقص microdissection، وجعل قطع نظيفة المقطع العرضي من خلال الصدر بأكمله، وقطع الخوخ في النصف(الشكل 2D).
6. إزالة بقايا الخلفي من كل جثة من برنامج تلفزيوني ووضعها على جانب واحد على طبق تشريح (لا تجاهل، انظر الخطوة 3.2.1).
7. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط غرامة، وفتح الصدر ورأس كل جروة للكشف عن مجمع العين الدماغ(الشكل 2E). للقيام بذلك، فهم حواف قطع ظهارة الصدر والمسيل للدموع تدريجيا لفتح الصدر ثم كبسولة الرأس، وفضح مجمع العين والدماغ والأنسجة الدهنية المحيطة بها.
8. دون استيعاب الأنسجة، استخدم ملقط لتوجيه مجمع العين والدماغ بعيدا عن بقايا كبسولة الرأس أو مغرفة مجمع العين والدماغ من كبسولة الرأس الممزقة المفتوحة.
   ملاحظة: مجمع العين الدماغ هو الدمبل على شكل، خارج الأبيض، وأكثر شفافة من الدهون الملونة كريم المحيطة (الشكل 2B، E).
9. مع ملقط، وإزالة بعناية معظم الدهون المرتبطة مجمعات العين والدماغ دون لمس أنسجة العين.

3. معالجة الأنسجة لفلورة المناعة

1. تشريح ما لا يقل عن 6-10 الخوادر كما هو موضح (الخطوات 2.1-2.9).
   ملاحظة: ثلاث إلى أربع نسخ متماثلة مستقلة من كل تشريح تميل إلى إنتاج بيانات كافية لاختبار فرضية.
2. الغسيل والتثبيت
   1. قطع غيض من طرف P20 أو P100 ماصة مع شفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتح تلميح إلى ~ 1 ملم في نصف قطرها وتليين عن طريق pipetting مزيج من برنامج تلفزيوني والدهون صعودا وهبوطا. ويمكن الحصول على هذه الدهون من بقايا الذبيحة إزالتها في الخطوة 2.6.
   2. نقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في طبق زجاجي 9 آبار، على الجليد. استخدام طرف مشحم وP20 أو P100 الإزاحة الهواء micropipette لنقل.
      ملاحظة: سوف مجمعات العين الدماغ تلتزم نصائح غير مشحم أثناء الأنابيب وتضررت أو فقدت.
   3. إزالة الدهون المتبقية المرتبطة أنسجة العين عن طريق pipetting برنامج تلفزيوني صعودا وهبوطا لدوامة بلطف مجمعات العين والدماغ. في هذا وجميع خطوات الغسيل اللاحقة، لا ماصة مباشرة مجمعات العين والدماغ صعودا وهبوطا لأن هذا سوف يضر أنسجة العين الهشة.
   4. نقل مجمعات العين والدماغ في الحد الأدنى من حجم (< 20 ميكرولتر) من برنامج تلفزيوني إلى ما لا يقل عن 250 ميكرولتر من التثبيت. مزيج عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا. حضانة لمدة 35 دقيقة، على الجليد.
      ملاحظة: يمكن استخدام نفس الطرف التشحيم المعدة في الخطوة 3.1.1 لهذا النقل.
   5. مع نفس تلميح ماصة، نقل مجمعات العين الدماغ إلى بئر تحتوي على ~ 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. مزيج عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا واحتضان لمدة 5-10 دقيقة على الجليد، لغسل. كرر خطوة الغسيل مرتين على الأقل.
      ملاحظة: يمكن الحفاظ على مجمعات العين الدماغ لعدة ساعات في غسل برنامج تلفزيوني النهائي، على الجليد، أو في 4 درجة مئوية، قبل الشروع في الخطوة 3.3.1.
3. تلطيخ الأجسام المضادة
   1. لمنع الأنسجة قبل التعرض لحلول الأجسام المضادة، نقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT. استخدام طرف مشحم وP20 أو P100 الإزاحة الهواء micropipette لنقل. احتضان لمدة 10 إلى 60 دقيقة، على الجليد.
   2. إعداد الحل الأساسي للأجسام المضادة عن طريق تمييع الأجسام المضادة المناسبة في PBT. منذ يتم احتضان مجمعات العين الدماغ في 10 ميكرولتر aliquots من محلول الأجسام المضادة، وحجم أعدت سيكون تكرارا من 10.
   3. Aliquot 10 ميكرولتر من حل الأجسام المضادة في بئر نظيفة من صينية ميكروويل 72 جيدا.
   4. قطع غيض من طرف ماصة P10 مع شفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتح تلميح إلى ~ 0.5 ملم في نصف قطرها وتليين عن طريق الأنابيب PBT صعودا وهبوطا.
   5. نقل ما لا يزيد عن 5 مجمعات العين والدماغ، في حجم < 3 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، في كل بئر 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة باستخدام الميكروبيت الإزاحة الهواء P10 والطرف مشحم.
   6. تجانس حل الأجسام المضادة عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا. لا ماصة مجمعات العين والدماغ صعودا وهبوطا لأن هذا سوف يضر الأنسجة.
   7. لتقليل تبخر محلول الأجسام المضادة، ضع قطعة صغيرة من الأنسجة المنقوعة في الماء المقطر في صينية ميكروويل وختم الدرج (على سبيل المثال، مع توفير الغطاء). حضانة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية.
   8. نقل مجمعات العين الدماغ من علبة microwell إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي 9 جيدا، لغسل. استخدم إزاحة الهواء P10 micropipette وPBT-تلميح مشحم (إعداد كما هو موضح في الخطوة 3.3.4). مزيج عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا. حضانة لمدة 5-10 دقيقة على الجليد.
   9. كرر خطوة الغسيل مرتين على الأقل. استخدام P20 أو P100 إزاحة الهواء micropipette وPBT-تزييت تلميح لنقل مجمعات العين والدماغ بين حلول الغسيل.
   10. إعداد حل الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تمييع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة الموسومة بالفلوروفورا في PBT على النحو المطلوب. 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية كافية لكل دفعة من 6-10 جرو. Aliquot حل الأجسام المضادة الثانوية في طبق تشريح الزجاج 9 جيدا.
   11. نقل مجمعات العين والدماغ إلى حل الأجسام المضادة الثانوية. استخدام P20 أو P100 إزاحة الهواء micropipette وPBT-تزييت تلميح لنقل.
   12. احتضان مجمعات العين والدماغ في حل الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة، أو 3-5 ساعة في 4 درجة مئوية. لمنع تبييض الفلوروفوريس بواسطة الضوء، قم بتغطية التحضير بورق.
       ملاحظة: قد تختلف المدة المثلى للحضانة في محلول الأجسام المضادة الثانوية وفقا للأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة.
   13. نقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي 9-جيدا، لغسل. مزيج عن طريق pipetting الحل صعودا وهبوطا. حضانة لمدة 5-10 دقيقة على الجليد. يجب تكرار خطوة الغسيل هذه مرتين على الأقل.
4. التثبيت الثانوي
   1. لتثبيت ثانوي، نقل مجمعات العين والدماغ إلى ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من التثبيت واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 35 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: التثبيت الثانوي تصلب أنسجة العين، مما يساعد على تصاعد (الخطوة 3.5).
   2. استخدام P20 أو P100 الإزاحة الهواء micropipette وPBT-تلميح مشحم لنقل مجمعات العين الدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي 9-جيدا، على الجليد، لغسل لمدة 5 دقائق.
   3. كرر خطوة الغسيل مرة واحدة على الأقل.
   4. استخدام P20 أو P100 الإزاحة الهواء micropipette وPBT-تلميح مشحم لنقل مجمعات العين الدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في طبق زجاجي 9-جيدا، على الجليد، لشطف لمدة 1-2 دقيقة. الحفاظ على الأنسجة في الحركة عن طريق الأنابيب PBS، ولكن ليس الأنسجة، صعودا وهبوطا لمنع مجمعات العين والدماغ من الاستقرار والتمسك طبق زجاجي خلال PBS-شطف.
5. تصاعد
   1. نقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتصاعدة. استخدام P20 أو P100 إزاحة الهواء micropipette وPBT-تزييت تلميح لنقل مجمعات العين والدماغ. السماح للأنسجة لتوازن في تصاعد وسائل الإعلام لمدة 1-2 ساعة.
   2. ضع قطرة 5-8 ميكرولتر من الوسائط التركيبية الطازجة على شريحة مجهر نظيفة.
   3. قطع تلميح P10 مع شفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتح تلميح إلى ~ 0.5 ملم في دائرة نصف قطرها واستخدام هذا وmicropipette الإزاحة الهواء P10 لنقل المجمعات العين الدماغ في 5-8 ميكرولتر من وسائل الإعلام المتصاعدة في قطرة من وسائل الإعلام المتصاعدة على الشريحة.
   4. استخدام اثنين من الإبر التنغستن لفصل العينين من الفصوص البصرية. دبوس مجمع العين الدماغ إلى الشريحة مع إبرة التنغستن قوي وشريحة كل عين بعيدا عن الفص البصري المرتبطة بها مع إبرة التنغستن غرامة (الشكل 2F).
   5. استخدم إبرة التنغستن الدقيقة للمناورة لكل عين على سطح شريحة المجهر مع السطح القاعدي لكل عين مجاورة للشريحة. خفض بلطف نظيفة غطاء زلة على الأنسجة وآمنة مع طلاء الأظافر.
      ملاحظة: ترتيب العيون على الشريحة بحيث تكون قريبة من بعضها البعض أو في خط سوف تسهل المجهر اللاحقة.
   6. صورة شبكية العين باستخدام المجهر الفلورسنت أو confocal.
      ملاحظة: يجب تخزين الشرائح عند درجة حرارة 4 درجات مئوية إذا لم يتم تصويرها على الفور.

Representative Results

الشكل 1: اختيار وثقافة الخوادر للتشريح. (أ)تجول اليرقات الثالثة instar (L3) اليرقات والجراء تحديد موقع على طول الجانبين من الثقافات Drosophila صحية. (ب)يمكن التعرف على ما قبل pupae من خلال لونها الأبيض شفافة كما الصباغ لم يتم إنشاؤها في حالة pupal واقية. يظهر المحور الأمامي الخلفي والظهري البطني للجروة باللون الأزرق. يتم استخدام جبيرة الخيزران رطبة لطرد واختيار ما قبل الخوادر من جدران القارورة. (ج)يتم وضع Pupae داخل أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 مل التي وصفت بشكل مناسب (النمط الجيني، وتاريخ جمع، ووقت جمع) و (D) مثقف داخل غرفة مرطب تجميعها من مربع تلميح ماصة فارغة. يتم الحفاظ على الرطوبة عن طريق وضع قطعة من الأنسجة الرطبة داخل منطقة الجزاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تشريح العين الجراء. (أ)يتم الالتزام Pupae إلى الشريط على الوجهين على طبق تشريح أسود. يشار إلى الإحداثيات الأمامية والخلفية والدورية باللون الأزرق. (ب)لعزل مجمعات العين والدماغ (واحد يظهر هنا)،(ج)تتم إزالة الخوادر أولا من حالة pupal لها. يتم عرض الخطوات الهامة في هذه العملية. تشير الخطوط الحمراء إلى مكان تمزيق وفتح علبة الجرو بعد إزالة operculum. ثم تتم إزالة الخوادر من حالة الجرو الممزقة مع ملقط. (د)يتم قطع أول جروة مكشوفة على طول الصدر مع مقص microdissection (الموقف المشار إليه بخط أحمر متقطع) وظهارة الرأس ثم تمزق بعناية مفتوحة (السهام الحمراء)، كما هو مبين في (E) للكشف عن مجمع العين الدماغ مبهمة. (F) بعد الحضانة مع الأجسام المضادة المناسبة، شرائح شبكية العين من مجمعات العين والدماغ. يتم عرض الخطوات الهامة في هذه العملية. استقرت العين الدماغ مع إبرة التنغستن قوي (اليسار) وشبكية العين إزالتها مع إبرة التنغستن غرامة (يمين). بالنسبة لتحليلات البروتين والحمض النووي الريبي، يمكن قطع شبكية العين غير المثبتة بشكل نظيف من الفصوص البصرية باستخدام شفرة حلاقة دقيقة أو مقص تقسيم دقيق، بدلا من إبرة التنغستن الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O