Overview
इस वीडियो में बताया गया है कि ड्रोसोफिला पिल्ले से आंख-मस्तिष्क परिसर को कैसे विच्छेदन और अलग किया जाए । विशेष रुप से प्रदर्शित प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता वाले ऊतक, संगत, उदाहरण के लिए, इम्यूनोदाता, साथ ही, अन्य जीन अभिव्यक्ति प्रयोगों उपज प्रक्रिया को दर्शाता है ।
Protocol
यह प्रोटोकॉल डेएंजेलिस और जॉनसन का एक अंश है, इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, वेस्टर्न एनालिसिस और आरएनए आइसोलेशन, जे विस एक्सपी (2019) के लिए ड्रोसोफिला पुपल रेटिना का विच्छेदन।
1. ऊतक तैयारी
- ड्रोसोफिला क्रॉस की स्थापना (जैसा कि पहलेग्रीनस्पैन, कोल्ड स्प्रिंग हार्बर लेबोरेटरी प्रेस, (2004)) या संस्कृति विशिष्ट ड्रोसोफिला उपभेदों में वर्णित है वांछित जीनोटाइप के पिल्ले प्राप्त करने के लिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि बड़ी संख्या में पिल्ले संयोग से उभरते हैं, पोषक तत्वों से भरपूर खाद्य मीडिया या मानक खाद्य मीडिया पर डुप्लिकेट में इन फ्लाई संस्कृतियों को उदारतापूर्वक खमीर-पेस्ट के साथ पूरक स्थापित करें।
- 25 डिग्री सेल्सियस पर ड्रोसोफिला संस्कृतियों को बनाए रखें। यूएएस-GAL4 प्रणाली का उपयोग करने के लिए, जीएमआर-GAL4 एक आदर्श ड्राइवर है जो मॉर्फोजेनेटिक कुंड के पीछे और पूरे प्यूपल विकास के पीछे लार्वा आई डिस्क कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है। क्रॉस यूएएस-लैक्ज़ एक्स जीएमआर-जीए 4 एक आदर्श नियंत्रण क्रॉस के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह गैर-अंतर्जात और निष्क्रिय β-गैलेक्टोसिडेस प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाता है।
- एक 6 "बांस स्प्लिंट की नोक का उपयोग करें जो आसुत पानी से गीला किया गया है, स्वस्थ संस्कृति शीशियों(चित्रा 1ए)के किनारे से सफेद प्री-प्यूप(चित्रा 1बी)को धीरे से उठाने के लिए और 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब(चित्रा 1सी)में रखें।
- ट्यूबों को एक प्लास्टिक पिपेट टिप बॉक्स में रखें, साथ ही आसुत पानी में भिगोए गए ऊतकों के एक छोटे से टुकड़े के साथ प्यूप को पर्याप्त आर्द्रता पर बनाए रखने के लिए प्यूप को desiccation(चित्रा 1डी)से बचाने के लिए पर्याप्त आर्द्रता पर रखें। विच्छेदन तक 25 डिग्री सेल्सियस पर पिल्ला को इनक्यूबेट करें।
- एक सूखी 6 "बांस स्प्लिंट का उपयोग करें धीरे से माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब से पिल्ला बाहर धक्का और एक काले विच्छेदन पकवान पर । पिल्ले से दूर विच्छेदन पकवान पर डबल तरफा टेप का एक ताजा टुकड़ा रखना ।
- संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करना, ध्यान से पिल्ला पृष्ठीय पक्ष ऊपर जगह (यानी, ऊपर का सामना करना पड़ ऑपरकुलम, चित्रा 1बी)टेप पर(चित्रा 2ए)। सुनिश्चित करें कि पिल्ला टेप का अच्छी तरह से पालन करें।
नोट: पुपल मामले पर नमी टेप के लिए सुरक्षित आसंजन को रोकती है, जिस स्थिति में, पिल्ला को दो तरफा टेप पर रखने से पहले हवा से सूखने की अनुमति देता है।
2. नेत्र मस्तिष्क परिसरों का विच्छेदन
- प्रत्येक पिल्ला(चित्रा 2सी)के ऑपरक्यूलम को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें।
- प्रत्येक प्यूपा के पुपल केस को स्लाइस या कट करने के लिए माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करें। फ्लैप ने पुपल मामले को सिर, छाती और पूर्वकाल पेट खंड को प्रकट करने के लिए खोला, पुपल मामले के किनारों को दो तरफा टेप(चित्रा 2सी)तक सुरक्षित किया।
नोट: प्यूप को पूरी तरह से प्रकट करना आवश्यक नहीं है। - प्रत्येक पिल्ला के पेट को तेज संदंश के साथ छेदें, जानवर को समझने के लिए, और इसे अपने प्यूपल मामले(चित्रा 2सी)से हटा दें।
- पिल्ला को टेप से दूर काले विच्छेदन पकवान पर रखें, और लगभग 400 माइक्रोन के साथ बर्फ-ठंडे फॉस्फेट-बफर-सॉल्यूशन (पीबीएस, पीएच 7.4) के साथ कवर करें।
- प्रत्येक पिल्ला को बलदंश के साथ पेट से समझें, और माइक्रोडिसेक्शन कैंची के साथ, पूरे छाती के माध्यम से एक साफ क्रॉस-सेक्शनल कट बनाएं, पिल्ला को आधे(चित्रा 2डी)में काटें।
- पीबीएस से प्रत्येक शव के पीछे के अवशेष को हटा दें और विच्छेदन पकवान पर एक तरफ रखें (त्यागें नहीं, चरण 3.2.1 देखें)।
- ठीक संदंश के दो जोड़े का उपयोग करना, छाती और प्रत्येक पिल्ला के सिर को खोलने के लिए आंख मस्तिष्क परिसर(चित्रा 2ई)प्रकट । ऐसा करने के लिए, छाती एपिथेलियम के कट-किनारों को समझें और धीरे-धीरे छाती और फिर सिर कैप्सूल खोलने के लिए आंसू, आंख-मस्तिष्क परिसर और आसपास के वसा ऊतकों को उजागर करें।
- ऊतक को समझे बिना, सिर कैप्सूल के अवशेषों से दूर आंख-मस्तिष्क परिसर का मार्गदर्शन करने के लिए संदंश का उपयोग करें या फटे-खुले सिर कैप्सूल से आंख-मस्तिष्क परिसर को स्कूप करें।
नोट: आंख मस्तिष्क परिसर डम्बल के आकार का, बंद सफेद, और आसपास के क्रीम रंग का वसा(चित्रा 2बी, ई)की तुलना में अधिक पारदर्शी है । - संदंश के साथ, आंखों के ऊतकों को छुए बिना आंखों के मस्तिष्क परिसरों से जुड़े अधिकांश वसा को ध्यान से हटा दें।
3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए ऊतक की प्रसंस्करण
- वर्णित (चरण 2.1-2.9) के रूप में कम से कम 6-10 पिल्ले को विच्छेदन करें।
नोट: प्रत्येक विच्छेदन के तीन से चार स्वतंत्र प्रतिकृति एक परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए पर्याप्त डेटा उपज करते हैं । - धुलाई और निर्धारण
- एक साफ रेजर ब्लेड के साथ एक P20 या P100 पिपेट टिप की नोक काटें ताकि टिप-ओपनिंग को त्रिज्या में ~ 1 मिमी तक बढ़ाया जा सके और पीबीएस और वसा के मिश्रण को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके चिकनाई की जा सके। इस वसा को चरण 2.6 में हटाए गए शव अवशेषों से प्राप्त किया जा सकता है।
- आंख के मस्तिष्क परिसरों को बर्फ पर 9-अच्छी तरह से ग्लास डिश में पीबीएस के ~ 400 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। स्थानांतरित करने के लिए चिकनाई टिप और एक P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
नोट: आंख-मस्तिष्क परिसर पाइपिंग के दौरान अलृष् णित युक्तियों का पालन करेंगे और क्षतिग्रस्त या खो जाएंगे। - आंखों के ऊतकों से जुड़े शेष वसा को पीबीएस को धीरे-धीरे आंख-मस्तिष्क परिसरों को भंवर में डालकर पीबीएस को पाइपिंग करके हटा दें। इस और बाद के सभी धोने के चरणों में, सीधे आंख-मस्तिष्क परिसरों को ऊपर और नीचे न करें क्योंकि इससे नाजुक आंखों के ऊतकों को नुकसान होगा।
- पीबीएस के न्यूनतम मात्रा (<20 μL) में आंख-मस्तिष्क परिसरों को कम से कम 250 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। बर्फ पर, 35 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
नोट: इस हस्तांतरण के लिए चरण 3.1.1 में तैयार एक ही चिकनाई टिप का उपयोग किया जा सकता है। - एक ही पिपेट टिप के साथ, आंख-मस्तिष्क परिसरों को पीबीएस के ~ 400 माइक्रोन युक्त कुएं में स्थानांतरित करें। समाधान को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं और धोने के लिए बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। कम से कम दो बार धुलाई का कदम दोहराएं।
नोट: चरण 3.3.1 पर आगे बढ़ने से पहले, अंतिम पीबीएस वॉश में, बर्फ पर, या 4 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटों तक आंख-मस्तिष्क परिसरों को बनाए रखा जा सकता है।
- एंटीबॉडी स्टेनिंग
- एंटीबॉडी समाधान के संपर्क में आने से पहले ऊतक को ब्लॉक करने के लिए, आंख-मस्तिष्क परिसरों को पीबीटी के ~ 400 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के लिए चिकनाई टिप और एक P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। बर्फ पर, 10 से 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- पीबीटी में उपयुक्त एंटीबॉडी को कमजोर करके प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। चूंकि आंख-मस्तिष्क परिसरों को एंटीबॉडी समाधान के 10 माइक्रोन एलिकोट्स में इनक्यूबेटेड किया जाता है, इसलिए तैयार की गई मात्रा 10 की प्रतिकृति होगी।
- एक 72-वेल माइक्रोवेल ट्रे के एक साफ कुएं में एंटीबॉडी समाधान के 10 μL Aliquot।
- एक साफ रेजर ब्लेड के साथ एक P10 पिपेट टिप की नोक काटें ताकि टिप-ओपनिंग को त्रिज्या में ~ 0.5 मिमी तक बढ़ाया जा सके और पीबीटी को ऊपर और नीचे पाइप करके चिकनाई की जा सके।
- पीबीएस के & 3 माइक्रोल की मात्रा में, पी10 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और लुब्रिकेटेड टिप का उपयोग करके एंटीबॉडी समाधान के प्रत्येक 10 माइक्रोल वेल में 5 से अधिक आंख-मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित न करें।
- समाधान को ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एंटीबॉडी समाधान को समरूप करें। आंख-मस्तिष्क परिसरों को ऊपर और नीचे न करें क्योंकि इससे ऊतक को नुकसान होगा।
- एंटीबॉडी समाधान के वाष्पीकरण को कम करने के लिए, आसुत पानी में भिगोए गए ऊतकों का एक छोटा सा टुकड़ा माइक्रोवेल ट्रे में रखें और ट्रे को सील करें (उदाहरण के लिए, ढक्कन के साथ)। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
- आंखों के मस्तिष्क परिसरों को माइक्रोवेल ट्रे से 9-वेल ग्लास डिश में पीबीटी के ~ 400 माइक्रोन में स्थानांतरित करें, धोने के लिए। P10 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें (चरण 3.3.4 में वर्णित के रूप में तैयार करें)। समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
- कम से कम दो बार धुलाई का कदम दोहराएं। वॉश सॉल्यूशंस के बीच आंख-मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें।
- आवश्यकतानुसार पीबीटी में उपयुक्त फ्लोरोफोर-टैग वाले माध्यमिक एंटीबॉडी को कमजोर करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार करें। माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 100 माइक्रोन 6-10 प्यूप के बैच के प्रति पर्याप्त है। एक 9-वेल ग्लास विच्छेदन पकवान में माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान Aliquot।
- आंख-मस्तिष्क परिसरों को माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में स्थानांतरित करें। स्थानांतरण के लिए P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें।
- कमरे के तापमान पर 1-2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में आंख-मस्तिष्क परिसरों को इनक्यूबेट करें, या 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 घंटे। प्रकाश द्वारा फ्लोरोफोरस की ब्लीडिंग को रोकने के लिए, तैयारी को पन्नी से ढक दें।
नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान में इनक्यूबेशन की इष्टतम अवधि प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के अनुसार भिन्न हो सकती है। - आंख-मस्तिष्क परिसरों को धोने के लिए 9-अच्छी तरह से ग्लास डिश में पीबीटी के ~ 400 माइक्रोन में स्थानांतरित करें। समाधान को ऊपर और नीचे पाइप करके मिलाएं। बर्फ पर 5-10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। इस धुलाई के कदम को कम से कम दो बार दोहराया जाना चाहिए।
- माध्यमिक निर्धारण
- एक माध्यमिक निर्धारण के लिए, आंख-मस्तिष्क परिसरों को कम से कम 200 माइक्रोन फिक्सेटिव और इनक्यूबेट में स्थानांतरित करें, जो कमरे के तापमान पर 20 मिनट या 35 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर है।
नोट: माध्यमिक निर्धारण आंख के ऊतकों को कठोर करता है, जो बढ़ते (चरण 3.5) को सहायता देता है। - 5 मिनट के लिए धोने के लिए, बर्फ पर, 9-अच्छी तरह से ग्लास डिश में पीबीटी के ~ 400 माइक्रोन में आंख-मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए पी 20 या पी 100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें।
- कम से कम एक बार धुलाई का कदम दोहराएं।
- 1-2 मिनट के लिए कुल्ला करने के लिए, बर्फ पर, 9-अच्छी तरह से ग्लास डिश में पीबीएस के ~ 400 माइक्रोल में आंख-मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए पी 20 या पी 100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें। पीबीएस को पाइपिंग करके ऊतक को गति में रखें, लेकिन ऊतक नहीं, ऊपर और नीचे पीबीएस-कुल्ला के दौरान आंखों के मस्तिष्क परिसरों को बसने और ग्लास डिश का पालन करने से रोकने के लिए।
- एक माध्यमिक निर्धारण के लिए, आंख-मस्तिष्क परिसरों को कम से कम 200 माइक्रोन फिक्सेटिव और इनक्यूबेट में स्थानांतरित करें, जो कमरे के तापमान पर 20 मिनट या 35 मिनट 4 डिग्री सेल्सियस पर है।
- बढ़ता हुआ
- बढ़ते मीडिया के ~ 200 μL में आंख मस्तिष्क परिसरों हस्तांतरण। आंखों के मस्तिष्क परिसरों को स्थानांतरित करने के लिए P20 या P100 एयर विस्थापन माइक्रोपिपेट और पीबीटी-चिकनाई टिप का उपयोग करें। ऊतक को 1-2 घंटे के लिए बढ़ते मीडिया में बराबरी करने की अनुमति दें।
- एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ताजा बढ़ते मीडिया की एक 5-8 μL ड्रॉप रखें ।
- एक साफ रेजर ब्लेड के साथ एक P10 टिप कट करने के लिए टिप खोलने को बढ़ाने के लिए दायरे में ~0.5 मिमी और इस और एक P10 हवा विस्थापन माइक्रोपिपेट का उपयोग करने के लिए स्लाइड पर बढ़ते मीडिया की बूंद में बढ़ते मीडिया के 5-8 μL में आंख मस्तिष्क परिसरों हस्तांतरण ।
- आंखों को ऑप्टिक लोब्स से अलग करने के लिए दो टंगस्टन सुइयों का इस्तेमाल करें। एक मजबूत टंगस्टन सुई के साथ स्लाइड करने के लिए एक आंख मस्तिष्क परिसर पिन और एक ठीक टंगस्टन सुई(चित्रा 2एफ)के साथ अपने जुड़े ऑप्टिक पालि से दूर प्रत्येक आंख टुकड़ा ।
- स्लाइड से सटे प्रत्येक आंख की बेसल सतह के साथ माइक्रोस्कोप स्लाइड की सतह के लिए प्रत्येक आंख पैंतरेबाज़ी करने के लिए ठीक टंगस्टन सुई का प्रयोग करें। धीरे-धीरे ऊतक पर एक साफ कवर-पर्ची कम करें और नेल पॉलिश के साथ सुरक्षित करें।
नोट: स्लाइड पर आंखों की व्यवस्था ताकि वे एक दूसरे के करीब हैं या एक लाइन में बाद में माइक्रोस्कोपी की सुविधा होगी। - फ्लोरोसेंट या कन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके रेटिना की छवि।
नोट: स्लाइड 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए अगर तुरंत छवि नहीं है ।
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Representative Results
चित्रा 1: विच्छेदन के लिए प्यूप का चयन और संस्कृति। (ए)घूमते हुए थर्ड लार्वा इंस्टार (एल3) लार्वा और प्यूपे स्वस्थ ड्रोसोफिला संस्कृतियों के किनारों के साथ पता लगाते हैं । (ख)प्री-प्यूप को उनके पारदर्शी सफेद रंग से पहचाना जा सकता है क्योंकि सुरक्षात्मक प्यूपल मामले में वर्णक अभी तक उत्पन्न नहीं हुआ है । पिल्ला के पूर्वकाल-पीछे और पृष्ठीय-वेंट्रल अक्ष को नीले रंग में दिखाया गया है। शीशी की दीवारों से पूर्व-पिल्ला को उखाड़ फेंकने और लेने के लिए एक नम बांस स्प्लिंट का उपयोग किया जाता है। (ग)प्यूप को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों के अंदर रखा जाता है जिन्हें उचित रूप से लेबल किया जाता है (जीनोटाइप, संग्रह की तारीख, और संग्रह का समय) और(डी)एक खाली पिपेट-टिप बॉक्स से इकट्ठे एक आर्द्रीकृत कक्ष के अंदर सुसंस्कृत होते हैं। बॉक्स के अंदर नम ऊतक का एक टुकड़ा रखकर आर्द्रता बनाए रखी जाती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2: पुपल आंख विच्छेदन। (क)प्यूप को काले विच्छेदन वाले पकवान पर दो तरफा टेप का पालन किया जाता है । पूर्वकाल, पीछे, और पृष्ठीय निर्देशांक नीले रंग में इंगित किए जाते हैं। (ख)आंखों के मस्तिष्क परिसरों को अलग करने के लिए (यहां एक भी दिखाया गया है),(ग)पिल्ला को सबसे पहले इसके प्यूपल केस से हटा दिया जाता है । इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं। लाल रेखाओं से संकेत मिलता है कि ऑपरकुलम हटाने के बाद प्यूपल केस को कहां फाड़ना और खोलना है। इसके बाद पुपॅ को फोर्स्प के साथ फटे पुपल केस से हटा दिया जाता है। (घ)एक उजागर पिल्ला पहले माइक्रोडिसेक्शन कैंची के साथ छाती के साथ काटा जाता है (धराशायी लाल रेखा के साथ संकेत दिया स्थिति) और सिर epithelium तो ध्यान से फटे खुले (लाल तीर), के रूप में(ई)में दिखाया गया है अपारदर्शी आंख मस्तिष्क परिसर प्रकट करने के लिए । (च)उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन के बाद, रेटिना आंख मस्तिष्क परिसरों से कटा हुआ है । इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण कदम दिखाए जाते हैं। आंख-मस्तिष्क एक मजबूत टंगस्टन सुई (बाएं) और रेटिना एक ठीक टंगस्टन सुई (दाएं) के साथ हटा के साथ स्थिर है । प्रोटीन और आरएनए विश्लेषण के लिए, अनियत रेटिना को ठीक टंगस्टन सुई के बजाय एक ठीक रेजर ब्लेड या माइक्रोडिसेक्शन कैंची का उपयोग करके ऑप्टिक लोब्स से साफ रूप से काटा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bamboo splints, 6" | Ted Pella Inc | 116 | |
| Black dissecting dish | Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize. |
||
| Blade holder | Fine Science Tools | 10053 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Double-sided tape | 3M | 665 | |
| Drosophila& food media, nutrient-rich | 7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20 | ||
| Drosophila& food media, standard | Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html) |
||
| Fixative solution | 4% formadehyde in PBS, pH 7.4. | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | Forceps should be sharpened frequently. |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| Glass 9-well dishes | Corning | 7220-85 | Also known as 9-well dishes |
| Glass coverslips (22 x 22 mm) | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm) | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| Glass petri dish | Corning | 3160-100BO | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microcentrigure tubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Microdissection scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microwell trays (72 x 10 µL wells) | Nunc | 438733 | |
| Mounting media | 0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS | ||
| N-propylgallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) | Sigma-Aldrich | P5368 | Prepare according to manufacturer's instructions |
| PBT | 0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4 | ||
| Pin holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Primary antibody: goat anti-GAPDH | Imgenex | IMG-3073 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1 | Cell signaling | 9578S | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | Developmental Studies Hybridoma Bank | DCAD2 | For immunofluorescence. Used at 1:20 |
| Primary antibody: rat anti-DEcad | DOI: 10.1006/dbio.1994.1287 | DCAD1 | Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100. |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10050 | Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder. |
| Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 712-545-153 | For immunofluorescence. Used at 1:200 |
| Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-165-144 | For immunofluorescence. Used at 1:100 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L) | Cell Signaling Technology | 7077 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 305-035-003 | For Western blotting. Used at 1:3000 |
| Stereo dissecting microscope (M60 or M80) | Leica Microsystems | or similar microscope | |
| Sylgard (black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Sylgard (transparent) | Dow Corning | SYLG184 | Color black with finely ground charcol powder |
| Tissue: Kimwipes | KIMTECH | 34120 | |
| TritonX | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tungsten needle, fine | Fine Science Tools | 10130-10 | Insert into pin holder |
| Tungsten needle, sturdy | Fine Science Tools | 10130-20 | Insert into pin holder |
| Yeast paste | (local supermarket) | Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O |
