Рассечение глазного мозга комплекса от Fly pupae: Метод изоляции ткани сетчатки

Overview

Это видео описывает, как вскрыть и изолировать глаз мозга комплекс из drosophila куколки. Протокол демонстрирует процедуру, присутую высококачественную ткань, совместимую, например, с иммуностимулированием, а также с другими экспериментами по экспрессии генов.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из DeAngelis и Джонсон, вскрытие Drosophila пупальной сетчатки для иммуногистохимии, западного анализа и РНК изоляции,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка тканей

1. Настройка Drosophila кресты (как описано ранее в Гринспен, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) или культуры конкретных штаммов дрозофилы, чтобы получить куколки желаемого генотипа. Для обеспечения того, чтобы большое количество куколок возникают случайно, установить эти культуры мух в дублировать на богатых питательными веществами пищевых средств массовой информации или стандартных средств массовой информации пищи щедро дополняется дрожжевой пасты.
2. Поддержание культур дрозофилы при 25 градусах Цельсия. Для крестов с использованием системы UAS-GAL4, GMR-GAL4 является идеальным драйвером, выраженным в личиночных клетках глазного диска задней к морфогенетической борозде и на протяжении всего развития куколки. Кросс UAS-lac X GMR-GAL4 служит идеальным крестом управления, поскольку он управляет выражением не эндогенного и инертного β-галактозидазы.
3. Используйте кончик 6"бамбуковой шины, которая была мокрой с дистиллированной водой, чтобы аккуратно поднять белые предварительно куколки (Рисунок 1B) со стороны здоровых флаконов культуры (Рисунок 1A) и поместить в 1,5 мл микроцентрифуг трубки (Рисунок 1C).
4. Поместите трубки в пластиковую коробку наконечник пипетки вместе с небольшим куском ткани, пропитанной дистиллированной водой для поддержания камеры при достаточной влажности, чтобы защитить куколок от высыхания(рисунок 1D). Инкубировать куколки при 25 градусов по Цельсию до вскрытия.
5. Используйте сухую 6-процентную бамбуковую шину, чтобы аккуратно вытолкнуть куколку из трубки микроцентрифуга и на черное рассекаемое блюдо. Положите свежий кусок двусторонний ленты на рассечение блюдо от куколки.
6. Используя пару типсов, аккуратно поместите спинную сторону куколок вверх (т.е. оперкулумы вверх, рисунок 1B) на ленту(рисунок 2A). Убедитесь, что куколки хорошо прилипать к ленте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Влага на куколки случае будет препятствовать безопасной адгезии к ленте, и в этом случае, позволяют куколки воздуха сухой перед размещением на двустороннюю ленту.

2. Рассечение глазных комплексов

1. Используйте типсы для удаления оперкулума каждой куколки(рисунок 2C).
2. Используйте ножницы микроперепись, чтобы нарезать или разрезать кукольный корпус каждой куколки. Flap открыть куколки случае выявить голову, грудную клетку, и передний сегмент брюшной полости, обеспечение края куколки случае двусторонняя лента (Рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно полностью раскрывать куколки.
3. Прокалывайте живот каждой куколки острыми типсами, чтобы схватить животное и удалить его из кукольного корпуса(рисунок 2C).
4. Поместите куколки на черное рассечение, вдали от ленты, и накройте около 400 МКЛ ледяного фосфата буферного раствора (PBS, pH 7.4).
5. Возьмите каждую куколку за живот с типсами, и с ножницами микродиссекции, сделать чистый поперечный разрез через всю грудную клетку, разрезая куколку пополам(рисунок 2D).
6. Удалите задний остаток каждой туши из PBS и положите в одну сторону на рассечение блюда (не отбрасывайте, см. шаг 3.2.1).
7. Используя две пары тонких типсов, откройте грудную клетку и голову каждой куколки, чтобы выявить глазной мозговой комплекс(рисунок 2E). Для этого схватьте кромки эпителия грудной клетки и постепенно рвите, чтобы открыть грудную клетку, а затем капсулу головы, обнажая глазно-мозговой комплекс и окружающую жировую ткань.
8. Не хватая ткани, используйте типсы, чтобы направлять глаз-мозговой комплекс от остатков головной капсулы или черпать глаз-мозг комплекс из разорванной открытой головной капсулы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Глаз-мозг комплекс гантели формы, небелый, и более полупрозрачным, чем окружающие кремового цвета жира(рисунок 2B,E).
9. С помощью миппов тщательно удаляйте больше всего жира, связанного с комплексами глазного мозга, не касаясь глазной ткани.

3. Обработка тканей для иммунофлуоресценции

1. Вскрыть по крайней мере 6-10 куколок, как описано (шаги 2.1-2.9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Три-четыре независимых репликации каждого вскрытия, как правило, дают достаточные данные для проверки гипотезы.
2. Стирка и фиксация
   1. Вырезать кончик P20 или P100 пипетки кончик с чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить кончик открытия до 1 мм в радиусе и смазки путем трубопроводов смесь PBS и жира вверх и вниз. Этот жир можно получить из остатков туши удалены в шаге 2.6.
   2. Перенесите глазно-мозговые комплексы в 400 фунтов стерлингов PBS в стеклянной тарелке из 9 колодец, на льду. Используйте смазанированный наконечник и микропипет P20 или P100 для передачи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глаз-мозг комплексы будут придерживаться необузданной советы во время пипетки и быть повреждены или потеряны.
   3. Удалите оставшийся жир, связанный с тканью глаза, трубя PBS вверх и вниз, чтобы мягко закружить глаз мозга комплексов. В этом и всех последующих шагов мытья, не непосредственно пипетки глаз мозга комплексов вверх и вниз, как это повредит хрупкую ткань глаза.
   4. Передача глазно-мозговых комплексов в минимальном объеме (Lt;20 L) PBS в по крайней мере 250 Л фиксатора. Смешайте с помощью пипетки раствор вверх и вниз. Инкубировать в течение 35 минут, на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой передачи можно использовать тот же смазаный наконечник, подготовленный в шаге 3.1.1.
   5. С тем же наконечником пипетки, передача глаз-мозг комплексов в колодец, содержащий 400 фунтов стерлингов PBS. Смешайте с помощью пипетки раствор вверх и вниз и инкубировать в течение 5-10 мин на льду, мыть. Повторите шаг стирки по крайней мере дважды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глаз-мозг комплексы могут быть сохранены в течение нескольких часов в окончательном PBS мыть, на льду, или при 4 градусов по Цельсию, прежде чем приступить к шагу 3.3.1.
3. Антитела окрашивания
   1. Чтобы блокировать ткани до контакта с растворами антител, перенесите комплексы глазного мозга на 400 мл PBT. Для переноса используйте смазанированный наконечник и микропипет P20 или P100 для перемещения воздуха. Инкубировать в течение 10 до 60 минут, на льду.
   2. Подготовье первичного раствора антител путем разбавления соответствующих антител в PBT. Так как глазно-мозговые комплексы инкубируются в 10 алицитах раствора антител, подготовленный объем будет реплицироваться в 10.
   3. Aliquot 10 йл раствора антител в чистый колодец 72-ну микроуэлл лоток.
   4. Отрежьте кончик наконечника пипетки P10 чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить первоклассное отверстие до 0,5 мм в радиусе и смазать трубой PBT вверх и вниз.
   5. Передача не более 5 глазно-мозговых комплексов, в объеме йл;3 МКЛ PBS, в каждый 10 л хорошо антитела раствора с помощью микропипета смещения воздуха P10 и смазаны кончиком.
   6. Гомогенизировать раствор антитела путем пипетки раствор вверх и вниз. Не пипетки глаз мозга комплексов вверх и вниз, как это повредит ткани.
   7. Чтобы свести к минимуму испарение раствора антитела, поместите небольшой кусочек ткани, пропитанной дистиллированной водой, в поднос для микроуровня и запечатав лоток (например, с предоставленной крышкой). Инкубировать на ночь при 4 градусов по Цельсию.
   8. Перенесите глазно-мозговые комплексы из подноса микроуэлла в 400 мл PBT в 9-хорошо приготовленном стеклянном блюде для мытья. Используйте микропипетер с водоизмещением воздуха P10 и наконечник PBT-смазки (подготовьтесь, как описано в шаге 3.3.4). Смешайте с помощью пипетки раствор вверх и вниз. Инкубировать в течение 5-10 минут на льду.
   9. Повторите шаг стирки по крайней мере дважды. Используйте микропипеты смещения воздуха P20 или P100 и наконечник PBT-смазки для переноса глазных комплексов между растворами для мытья.
   10. Подготовье вторичного раствора антител путем разбавления соответствующих фторфор-тегами вторичных антител в PBT по мере необходимости. 100 МКЛ вторичного раствора антитела достаточно на партию из 6-10 куколок. Aliquot вторичного раствора антитела в 9-хорошое стекло рассечение блюдо.
   11. Перенесите глазно-мозговые комплексы во вторичный раствор антител. Для переноса используйте микропипет p20 или P100 для перемещения воздуха и наконечник PBT.
   12. Инкубировать глазно-мозговые комплексы во вторичном растворе антитела в течение 1-2 ч при комнатной температуре, или 3-5 ч при температуре 4 градусов по Цельсию. Чтобы предотвратить отбеливание фторфоров светом, накройте препарат фольгой.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная продолжительность инкубации во вторичном растворе антител может отличаться в зависимости от используемых первичных и вторичных антител.
   13. Перенесите глазно-мозговые комплексы в 400 мл PBT в стеклянном блюде из 9 колодец, чтобы вымыть. Смешайте с помощью пипетки раствор вверх и вниз. Инкубировать в течение 5-10 минут на льду. Этот шаг стирки следует повторять по крайней мере дважды.
4. Вторичная фиксация
   1. Для вторичной фиксации перенесите комплексы глаз и мозга по крайней мере на 200 МКЛ фиксации и инкубировать в течение 20 минут при комнатной температуре или 35 мин при температуре 4 градуса Цельсия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичная фиксация застеляет глазную ткань, что способствует монтажу (шаг 3.5).
   2. Используйте микропипетл для смещения воздуха P20 или P100 и наконечник PBT-смазки для переноса глазно-мозговых комплексов в 400 мл ПБТ в стеклянной тарелке 9-хорошо, на льду, для мытья в течение 5 минут.
   3. Повторите шаг стирки по крайней мере один раз.
   4. Используйте микропипетл для смещения воздуха P20 или P100 и наконечник PBT для переноса глазно-мозговых комплексов в 400 мкл PBS в стеклянном блюде из 9 колодец, на льду, для полоскания в течение 1-2 мин. Держите ткань в движении путем pipetting PBS, но не ткани, вверх и вниз для того чтобы предотвратить комплексы глаза-мозга от устанавливать и придерживаться к стеклянной тарелке во время PBS-полоскания.
5. установка
   1. Перенесите глазно-мозговые комплексы в 200 мкл монтажных средств массовой информации. Используйте микропайпет P20 или P100 для перемещения воздуха и наконечник PBT для передачи комплексов глазного мозга. Разрешить ткани эквилибрировать в монтажных средствах в течение 1-2 ч.
   2. Поместите 5-8 мкл капли свежих монтажных средств массовой информации на чистый слайд микроскопа.
   3. Вырезать P10 отзыв с чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить кончик открытия до 0,5 мм в радиусе и использовать это и P10 микропипета смещения воздуха для передачи глазного мозга комплексов в 5-8 йл монтажа средств массовой информации в падение монтажа средств массовой информации на слайде.
   4. Используйте две вольфрамовых иглы, чтобы отделить глаза от оптических долей. Прикрепите глазно-мозговой комплекс к слайду прочной вольфрамовой иглой и нарежьте каждый глаз от связанной с ним оптической доли тонкой вольфрамовой иглой(рисунок 2F).
   5. Используйте тонкую вольфрамовую иглу, чтобы маневрировать каждый глаз на поверхность слайда микроскопа с базальной поверхностью каждого глаза, прилегающего к слайду. Аккуратно опустите чистую крышку-скользить по ткани и обеспечить с лаком для ногтей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Организация глаз на слайде так, чтобы они были близко друг к другу или в линии облегчит последующую микроскопию.
   6. Изображение сетчатки с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Слайды должны храниться при 4 градусах Цельсия, если они не изображены немедленно.

Representative Results

Рисунок 1: Отбор и культура куколок для вскрытия. (A) Блуждающие третий личинки instar (L3) личинки и куколки найти по бокам здоровых культур дрозофилы. (B)Pre-pupae можно определить их полупрозрачным белым цветом по мере того как пигмент имеет пока быть порожденным в защитном случае pupal. Передняя-задняя и спинко-вентралальная ось куколки показаны синим цветом. Влажная бамбуковая шина используется, чтобы выбить и выбрать предварительно куколки из стенок флакона. (C) Pupae помещаются внутри 1,5 мл микроцентрифуг трубки, которые помечены надлежащим образом (генотип, дата сбора, и время сбора) и (D) культурируются внутри увлажненной камеры собраны из пустой пипетки-наконечник коробки. Влажность поддерживается путем размещения кусок влажной ткани внутри коробки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Рассекая пупок. (A)Pupae придерживаются двусторонний ленты на черном рассечении блюдо. Передние, задние и спинные координаты обозначены синим цветом. (B) Чтобы изолировать глаз мозга комплексов (один показано здесь), (C) куколка впервые удаляется из его куколки случае. Показаны важные шаги в этом процессе. Красные линии указывают, где рвать и открывать кукольный корпус после удаления оперкулума. Куколки затем удаляются из разорванного кукольного корпуса с хлипами. (D) Открытый куколка сначала вырезать вдоль грудной клетки с ножницами микродиссекции (положение указано с пунктирной красной линии) и головной эпителий затем тщательно разорвал открытым (красные стрелки), как показано в (E), чтобы выявить непрозрачный глаз мозга комплекса. (F)После инкубации с соответствующими антителами, сетчатки нарезаются из глаз-мозговых комплексов. Показаны важные шаги в этом процессе. Глаз-мозг стабилизируется с прочной иглой вольфрама (слева) и сетчатки удалены тонкой иглой вольфрама (справа). Для анализа белка и РНК, нефиксированные сетчатки могут быть чисто вырезаны из оптических долей с помощью тонкого лезвия бритвы или ножницы микропересмешки, а не тонкой вольфрамовой иглы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O