飞普佩眼脑复合物的解剖：隔离视网膜组织的方法

Overview

此视频描述了如何解剖和隔离眼脑复合物从 德罗索菲拉 普帕。特色协议演示了产生高质量组织的程序，与免疫染色以及其他基因表达实验相容。

Protocol

本协议摘自迪安杰利斯和约翰逊，免疫化学、西方分析和RNA隔离的德索菲拉·普帕尔视网膜解剖   ，J.Vis. Exp.（2019年）。

1. 组织准备

1. 设置 德罗索菲拉 十字架（如格林斯潘，冷泉港实验室出版社，2004年）或培养特定的 果蝇 菌株，以获得所需的基因型的幼崽。为了确保大量幼崽巧出现，在营养丰富的食品介质或标准食品介质上建立这些重复的苍蝇培养物，并慷慨地补充酵母糊。
2. 将 德罗索菲拉 文化保持在 25 °C。 对于使用 UAS-GAL4 系统的十字架 ，GMR-GAL4 是幼虫眼盘细胞在形态遗传沟渠和整个幼虫发育过程中表达的理想驱动因素。交叉 UAS-lacZ X GMR-GAL4 是理想的控制交叉，因为它驱动非内源性和惰性β-卡拉托西酶蛋白的表达。
3. 使用用蒸馏水湿润的 6" 竹夹板尖，轻轻地将白色预便 （图 1B） 从健康养殖小瓶的侧面抬起 （图 1A），放入 1.5 mL 微中流管 （图1C）。
4. 将管子放入塑料移液器尖端盒中，以及浸泡在蒸馏水中的一小块组织，以保持室内足够的湿度，以保护幼崽不干燥（图1D）。在25°C孵育幼虫，直到解剖。
5. 使用干燥的 6" 竹夹板轻轻地将 pupae 从微型中心管中推出，然后推上黑色解剖盘。将一块新鲜的双面胶带放在解剖盘上，远离小狗。
6. 使用一对钳子，小心地将幼崽的后侧向上（即面朝上， 图1B）放在磁带上（图2A）。确保小狗很好地粘附在磁带上。
   注： pupal 外壳上的湿气会抑制对胶带的安全粘附，在这种情况下，允许 pupae 在放入双面胶带之前风干。

2. 眼脑复合物解剖

1. 使用钳子去除每个幼崽的手术库（图2C）。
2. 使用微分切剪刀切开或切开每个小狗的皮壳。拍开 pupal 外壳，露出头部、胸腔和前腹段，将 pupal 外壳的边缘固定到双面胶带（图 2C）。
   注： 没有必要完全揭示幼崽。
3. 用锋利的钳子刺穿每只幼崽的腹部，抓住动物，并将其从幼崽壳中取出（图2C）。
4. 将 pupae 放在黑色解剖盘上，远离胶带，并盖上约 400 μL 的冰冷磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH 7.4）。
5. 用钳子抓住腹部的每只幼崽，用微分切刀，使一个干净的横截面切开整个胸腔，将幼崽切成两半（图2D）。
6. 从 PBS 中取出每个尸体的后遗物，放在解剖盘的一侧（不要丢弃，请参阅步骤 3.2.1）。
7. 使用两对细钳，打开每个幼崽的胸腔和头部，以揭示眼脑情结（图2E）。为此，抓住胸腺上皮的切口，并逐渐撕裂打开胸腔，然后头部胶囊，暴露眼脑复杂和周围的脂肪组织。
8. 在不掌握组织的情况下，使用钳子引导眼脑复合物远离头部胶囊的残余物，或从撕裂的开头胶囊中挖出眼脑复合物。
   注： 眼脑复合体是哑铃形状，白色，比周围的奶油色脂肪（图2B，E）更半透明。
9. 使用钳子，小心地去除与眼脑复合物相关的大多数脂肪，而不会接触眼组织。

3. 免疫荧光组织处理

1. 剖析至少 6-10 pupae（步骤 2.1-2.9）。
   注： 每个解剖的三到四个独立复制品往往产生足够的数据来测试一个假设。
2. 洗涤和固定
   1. 用干净的剃须刀刀片切割 P20 或 P100 移液器尖端，通过将 PBS 和脂肪上下混合，将开头增加到半径约 1 毫米，并润滑。这种脂肪可以从步骤2.6中去除的残骸中获得。
   2. 将眼脑复合物转移到 9 井玻璃盘中，在冰上将 400μL 的 PBS 传输到 400μL 中。使用润滑尖端和 P20 或 P100 空气位移微皮素进行传输。
      注： 眼脑复合物在管道输送过程中会粘附在未润滑的提示上，并且会损坏或丢失。
   3. 通过上下管道将 PBS 吹倒，以轻轻旋转眼脑复合物，去除与眼组织相关的剩余脂肪。在此和所有后续的洗涤步骤中，不要直接将移液器眼脑上下复合，因为这将损坏脆弱的眼组织。
   4. 将 PBS 的最小体积 （+lt：20 μL） 中的眼脑复合物转移到至少 250 μL 的固定性中。通过上下管道将溶液混合。孵化35分钟，在冰上。
      注： 步骤 3.1.1 中准备的相同润滑尖端可用于此传输。
   5. 使用相同的移液器尖端，将眼脑复合物转移到含有约 400μL PBS 的井中。通过上下管道混合溶液，在冰上孵育5-10分钟，进行清洗。至少重复洗涤步骤两次。
      注： 在进行第 3.3.1 步之前，脑脑复合物可在最后的 PBS 洗涤、冰上或 4 °C 中保持数小时。
3. 抗体染色
   1. 要在接触抗体溶液之前阻止组织，将眼脑复合物转移到 PBT 的约 400 μL。使用润滑尖端和 P20 或 P100 空气位移微皮素进行传输。在冰上孵化10至60分钟。
   2. 通过稀释 PBT 中的适当抗体来准备主要抗体解决方案。由于眼脑复合物在10μL抗体溶液中孵育，所准备的体积将复制10个。
   3. 将 10 μL 的抗体溶液加入 72 井微井托盘的干净井中。
   4. 用干净的剃须刀刀片切开 P10 移液器尖端，将开头增加到半径约 0.5 毫米，并通过上下管道润滑 PBT。
   5. 使用 P10 空气位移微皮带和润滑尖端，将不超过 5 个眼脑复合物（PBS 的体积为 +lt;3 μL）转移到每个 10 μL 的抗体溶液井中。
   6. 通过上下管道化溶液，使抗体溶液均质化。不要吹笛，眼脑复合上下，因为这将损害组织。
   7. 为了尽量减少抗体溶液的蒸发，将浸泡在蒸馏水中的一小块组织放入微井托盘中，并密封托盘（例如，提供盖子）。在 4 °C 的夜间孵化。
   8. 将眼脑复合物从微井托盘转移到 9 井玻璃盘中 400μL 的 PBT 中，以进行清洗。使用 P10 空气位移微皮和 PBT 润滑尖端（如步骤 3.3.4 所述准备）。通过上下管道将溶液混合。在冰上孵化5-10分钟。
   9. 至少重复洗涤步骤两次。使用 P20 或 P100 空气位移微皮和 PBT 润滑尖端在洗涤解决方案之间传输眼脑复合物。
   10. 根据需要稀释 PBT 中适当的氟标记二级抗体，准备二次抗体溶液。每批 6-10 pupae 的 100 μL 二次抗体溶液就足够了。将二次抗体溶液加入 9 井玻璃解剖盘中。
   11. 将眼脑复合物转移到次要抗体溶液中。使用 P20 或 P100 空气位移微皮和 PBT 润滑尖端进行传输。
   12. 在室温下将眼脑复合物在二级抗体溶液中孵育 1-2 小时，或在 4 °C 时将 3-5 小时孵化。 为了防止荧光素被光漂白，用铝箔覆盖制剂。
       注： 二次抗体溶液中孵育的最佳持续时间可能因所用的初级和次抗体而异。
   13. 将眼脑复合物转移到 9 井玻璃盘中 400μL 的 PBT 中，进行洗涤。通过上下管道将溶液混合。在冰上孵化5-10分钟。此洗涤步骤应至少重复两次。
4. 二次固定
   1. 对于二次固定，将眼脑复合物转移到至少 200 μL 的固定和孵化 20 分钟室温下或 35 分钟在 4 °C。
      注： 二次固定使眼组织僵硬，有助于安装（第3.5步）。
   2. 使用 P20 或 P100 空气位移微皮和 PBT 润滑尖，将眼脑复合物转移到 9 井玻璃盘中 400μL 的 PBT 中，在冰上清洗 5 分钟。
   3. 至少重复洗涤步骤一次。
   4. 使用 P20 或 P100 空气位移微皮和 PBT 润滑尖，将眼脑复合物在冰上 9 井玻璃盘中将 400μL 的 PBS 传输到 400 μL 中，冲洗 1-2 分钟。通过上下管道管动 PBS（而不是组织）来保持组织运动，以防止眼脑复合物在 PBS 冲洗过程中稳定并粘附在玻璃盘上。
5. 安装
   1. 将眼脑复合物转移到安装介质的 200 μL 中。使用 P20 或 P100 空气位移微皮和 PBT 润滑尖端转移眼脑复合物。使组织在安装介质中等于 1-2 小时。
   2. 将 5-8 μL 滴的新鲜安装介质放在干净的显微镜幻灯片上。
   3. 用干净的剃须刀刀片切开 P10 尖端，将开头增加到半径约 0.5 毫米，并使用此和 P10 空气位移微管将安装介质 5-8 μL 中的眼脑复合物转移到幻灯片上的安装介质下降中。
   4. 使用两根钨针将眼睛与光叶分开。用坚固的钨针将眼脑复合物固定在滑梯上，然后用细钨针将每只眼睛从其相关的光学叶上切开（图2F）。
   5. 使用细钨针将每只眼睛操纵到显微镜滑动的表面，每只眼睛的基底表面与滑梯相邻。轻轻降低组织上干净的盖滑，用指甲油固定。
      注： 将眼睛放在幻灯片上，以便它们彼此靠近或排成一行，将有助于随后进行显微镜检查。
   6. 使用荧光或聚焦显微镜对视网膜进行成像。
      注： 如果不立即映像，幻灯片应存储在 4 °C。

Representative Results

图1：解剖的普佩的选择和文化。 （A） 游荡的第三只幼虫在恒星 （L3） 幼虫和幼虫沿着健康的 德罗索菲拉 文化的两侧定位。（B） 前脓液可以通过其半透明的白色来识别，因为保护性 pupal 外壳中尚未生成色素。前后和后部-腹腔轴的 pupa 以蓝色显示。潮湿的竹夹板用于从小瓶壁上拆开并采摘预花。（C） Pupae 被放置在 1.5 mL 微中流管内，这些管子的标签适当（基因型、收集日期和收集时间）和（D）在由空移液器尖端盒组装而成的加湿室内培养。湿度通过在盒子内放置一块潮湿的组织来保持。 请单击此处查看此图的更大版本。

图2：解剖猫眼。 （A） Pupae 粘附在黑色解剖盘上的双面胶带上。前坐标、后向坐标和后向坐标以蓝色表示。（B） 为了隔离眼脑复合物（此处显示单个复合物），（C）pupa 首先从其 pupal 病例中删除。显示了此过程中的重要步骤。红线指示在切除手术后撕裂和打开 pupal 案例的位置。然后用钳子从撕裂的幼崽箱中取出幼崽。（D） 暴露的 pupa 首先沿胸腔切割，用微解剖剪刀（位置指示与虚线红线）和头部上皮，然后小心地撕开（红色箭头），如（E）所示，以揭示不透明的眼脑复合物。（F） 在用适当的抗体孵育后，视网膜从眼脑复合物中切开。显示了此过程中的重要步骤。眼脑用结实的钨针（左）稳定下来，用细钨针切除视网膜（右）。对于蛋白质和RNA分析，使用细剃须刀刀片或微解剖剪刀，而不是细钨针，可以干净利落地从视叶中切开未修复的视网膜。 请单击此处查看此图的更大版本。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O