Dissection du complexe oeil-cerveau de Fly Pupae: Une méthode pour isoler le tissu rétinien

Overview

Cette vidéo décrit comment disséquer et isoler le complexe œil-cerveau des pupes de Drosophila. Le protocole présenté démontre la procédure de rendement de tissus de haute qualité, compatibles avec, par exemple, l’immunostaining, ainsi que d’autres expériences d’expression génétique.

Protocol

Ce protocole est un extrait de DeAngelis and Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation,   J. Vis. Exp. (2019).

1. Préparation des tissus

1. Installez des croix de Drosophila (comme décrit précédemment dans Greenspan , Cold Spring Harbor LaboratoryPress, (2004)) ou des souches de Drosophila spécifiques à la culture pour obtenir des pupes du génotype désiré. Pour s’assurer qu’un grand nombre de pupes émergent coïncidence, établissez ces cultures volantes en double sur des supports alimentaires riches en nutriments ou des supports alimentaires standard généreusement complétés par de la pâte de levure.
2. Maintenir les cultures de Drosophila à 25 °C. Pour les croisements utilisant le système UAS-GAL4, GMR-GAL4 est un pilote idéal exprimé dans les cellules larvaires de disque oculaire postérieure au sillon morphogénétique et tout au long du développement pupal. La croix UAS-lacZ X GMR-GAL4 sert de croix de contrôle idéale car elle conduit l’expression de la protéine non endogène et inerte β-galactosidase.
3. Utilisez la pointe d’une attelle de bambou de 6 " qui a été mouillée avec de l’eau distillée pour soulever doucement la prépupe blanche (figure 1B) du côté des flacons de culture saine ( figure1A) et placer dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL ( figure1C).
4. Placez les tubes dans une boîte à pointes en plastique avec un petit morceau de tissu trempé dans de l’eau distillée pour maintenir la chambre à une humidité suffisante pour protéger les pupes de la dessiccation (Figure 1D). Incuber les nymphes à 25 °C jusqu’à la dissection.
5. Utilisez une attelle sèche en bambou de 6 " pour pousser doucement les nymphes du tube de microcentrifugeuse et sur un plat de dissecting noir. Déposer un morceau frais de ruban adhésif à double face sur le plat disséquant loin des nymphes.
6. À l’aide d’une paire de forceps, placez soigneusement le côté dorsale des pupes vers le haut (c.-à-d. les operculums orientés vers le haut, figure 1B)sur la bande (figure 2A). Assurez-vous que les pupes adhèrent bien à la bande.
   REMARQUE: L’humidité sur le boîtier pupal inhibe l’adhérence sécurisée à la bande, auquel cas, permettre aux pupes de sécher à l’air libre avant de placer sur le ruban adhésif à double face.

2. Dissection des complexes oeil-cerveau

1. Utilisez des forceps pour enlever l’operculum de chaque pupe (Figure 2C).
2. Utilisez des ciseaux de microdissection pour trancher ou ouvrir le boîtier pupal de chaque pupe. Flap ouvrir le boîtier pupal pour révéler la tête, thorax, et le segment abdominal antérieur, la sécurisation des bords de l’étui pupal à la bande à double face (Figure 2C).
   REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de révéler entièrement les pupes.
3. Percer l’abdomen de chaque pupe avec des forceps tranchants, pour saisir l’animal, et l’enlever de son cas pupal (Figure 2C).
4. Déposer les pupes sur le plat de dissection noir, loin du ruban adhésif, et couvrir d’environ 400 μL de solution tamponnée de phosphate glacé (PBS, pH 7.4).
5. Saisir chaque pupe par l’abdomen avec des forceps, et avec des ciseaux de microdissection, faire une coupe transversale propre à travers l’ensemble du thorax, couper la pupe en deux (Figure 2D).
6. Retirez le reste postérieur de chaque carcasse du PBS et mettez d’un côté sur le plat de dissecting (ne jetez pas, voir l’étape 3.2.1).
7. À l’aide de deux paires de forceps fins, ouvrez le thorax et la tête de chaque pupe pour révéler le complexe œil-cerveau (figure 2E). Pour ce faire, saisissez les bords coupés de l’épithélium du thorax et déchirez graduellement pour ouvrir le thorax, puis la capsule de tête, exposant le complexe œil-cerveau et les tissus adipeux environnants.
8. Sans saisir le tissu, utilisez des forceps pour guider le complexe œil-cerveau loin des restes de la capsule de tête ou ramasser le complexe œil-cerveau de la capsule de tête déchirée ouverte.
   REMARQUE: Le complexe oeil-cerveau est en forme d’haltère, blanc éteint, et plus translucide que la graisse de couleur crème environnante (Figure 2B,E).
9. Avec les forceps, retirez soigneusement la plupart des graisses associées aux complexes œil-cerveau sans toucher le tissu oculaire.

3. Traitement des tissus pour l’immunofluorescence

1. Disséquer au moins 6-10 pupes décrites (étapes 2.1-2.9).
   REMARQUE: Trois à quatre répliques indépendantes de chaque dissection ont tendance à produire suffisamment de données pour tester une hypothèse.
2. Lavage et fixation
   1. Coupez la pointe d’une pointe de pipette P20 ou P100 à l’aide d’une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de la pointe à ~1 mm dans le rayon et lubrifier en pipetting un mélange de PBS et de graisse de haut en bas. Cette graisse peut être obtenue à partir des restes de carcasse enlevés dans l’étape 2.6.
   2. Transférer les complexes œil-cerveau en ~400 μL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur de la glace. Utilisez la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 à transférer.
      REMARQUE: Les complexes œil-cerveau adhéreront à des pointes non sous-ubriques pendant le pipetage et seront endommagés ou perdus.
   3. Enlevez le reste de la graisse associée au tissu oculaire en pipetting le PBS de haut en bas pour tourbillonner doucement les complexes oeil-cerveau. Dans ceci et toutes les étapes suivantes de lavage, ne pipette pas directement des complexes d’oeil-cerveau de haut en bas car ceci endommagera le tissu oculaire fragile.
   4. Transférer les complexes œil-cerveau dans un volume minimal (<20 μL) de PBS dans au moins 250 μL de fixatif. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber pendant 35 min, sur glace.
      REMARQUE: La même pointe lubrifiée préparée à l’étape 3.1.1 peut être utilisée pour ce transfert.
   5. Avec la même pointe pipette, transférer les complexes œil-cerveau dans un puits contenant ~ 400 μL de PBS. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas et incuber pendant 5-10 min sur la glace, pour laver. Répétez l’étape de lavage au moins deux fois.
      REMARQUE: Les complexes œil-cerveau peuvent être maintenus pendant plusieurs heures dans le lavage final de PBS, sur la glace, ou à 4 °C, avant de passer à l’étape 3.3.1.
3. Coloration d’anticorps
   1. Pour bloquer le tissu avant l’exposition aux solutions d’anticorps, transférez les complexes œil-cerveau à ~400 μL de PBT. Utilisez la pointe lubrifiée et une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 pour le transfert. Incuber de 10 à 60 min, sur glace.
   2. Préparez la solution d’anticorps primaire en diluant les anticorps appropriés dans le PBT. Puisque les complexes œil-cerveau sont incubés en 10 aliquots μL de solution d’anticorps, le volume préparé sera une réplique de 10.
   3. Aliquot 10 μL de solution d’anticorps dans un puits propre d’un plateau de microwell de 72 puits.
   4. Coupez la pointe d’une pointe de pipette P10 à l’aide d’une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de la pointe à ~0,5 mm dans le rayon et lubrifier en pipetting PBT de haut en bas.
   5. Ne transférez pas plus de 5 complexes œil-cerveau, dans un volume de <3 μL de PBS, dans chaque puits de 10 μL de solution d’anticorps à l’aide d’une micropipette de déplacement d’air P10 et de la pointe lubrifiée.
   6. Homogénéisez la solution d’anticorps en pipetant la solution de haut en bas. Ne pipette les complexes œil-cerveau de haut en bas que cela endommagera le tissu.
   7. Pour minimiser l’évaporation de la solution d’anticorps, placez un petit morceau de tissu trempé dans de l’eau distillée dans le bac à microwell et scellez le plateau (p. ex., avec le couvercle fourni). Incuber toute la nuit à 4 °C.
   8. Transférer les complexes œil-cerveau du plateau microwell en ~400 μL de PBT dans un plat en verre à 9 puits, pour le laver. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P10 et une pointe lubrifiée PBT (préparez-vous tel que décrit à l’étape 3.3.4). Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber de 5 à 10 min sur la glace.
   9. Répétez l’étape de lavage au moins deux fois. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée PBT pour transférer les complexes œil-cerveau entre les solutions de lavage.
   10. Préparez la solution d’anticorps secondaire en diluant les anticorps secondaires appropriés marqués au fluorophore dans le PBT au besoin. 100 μL de solution d’anticorps secondaire est suffisant par lot de 6-10 pupes. Aliquot la solution d’anticorps secondaire dans un plat de dissection en verre à 9 puits.
   11. Transférer les complexes œil-cerveau dans une solution d’anticorps secondaire. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée PBT pour le transfert.
   12. Incuber les complexes œil-cerveau dans la solution d’anticorps secondaire pendant 1-2 h à température ambiante, ou 3-5 h à 4 °C. Pour éviter le blanchiment des fluorophores par la lumière, couvrir la préparation de papier d’aluminium.
       REMARQUE: La durée optimale de l’incubation dans la solution secondaire d’anticorps peut différer selon les anticorps primaires et secondaires utilisés.
   13. Transférer les complexes œil-cerveau en ~400 μL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, pour le laver. Mélanger en pipetant la solution de haut en bas. Incuber de 5 à 10 min sur la glace. Cette étape de lavage doit être répétée au moins deux fois.
4. Fixation secondaire
   1. Pour une fixation secondaire, transférer les complexes œil-cerveau à au moins 200 μL de fixatif et incuber pendant 20 min à température ambiante ou 35 min à 4 °C.
      REMARQUE: La fixation secondaire raidit le tissu oculaire, ce qui facilite le montage (étape 3.5).
   2. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée PBT pour transférer les complexes œil-cerveau en ~400 μL de PBT dans un plat en verre de 9 puits, sur glace, pour les laver pendant 5 minutes.
   3. Répétez l’étape de lavage au moins une fois.
   4. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée PBT pour transférer les complexes œil-cerveau en ~400 μL de PBS dans un plat en verre de 9 puits, sur glace, pour rincer pendant 1-2 min. Gardez le tissu en mouvement en pipetting PBS, mais pas le tissu, de haut en bas pour empêcher les complexes œil-cerveau de s’installer et d’adhérer au plat en verre pendant le rinçage PBS.
5. montage
   1. Transférez les complexes œil-cerveau en ~200 μL de supports de montage. Utilisez une micropipette de déplacement d’air P20 ou P100 et une pointe lubrifiée PBT pour transférer les complexes œil-cerveau. Laissez le tissu s’équilibrer dans les supports de montage pendant 1-2 h.
   2. Placez une goutte de 5 à 8 μL de supports de montage frais sur une lame de microscope propre.
   3. Coupez une pointe P10 avec une lame de rasoir propre pour augmenter l’ouverture de pointe à ~0,5 mm dans le rayon et utilisez ceci et une micropipette de déplacement d’air P10 pour transférer les complexes oeil-cerveau dans 5-8 μL de supports de montage dans la chute des supports de montage sur la glissière.
   4. Utilisez deux aiguilles de tungstène pour séparer les yeux des lobes optiques. Épinglez un complexe œil-cerveau jusqu’à la toboggan avec une aiguille de tungstène robuste et tranchez chaque œil loin de son lobe optique associé à une aiguille de tungstène fine (figure 2F).
   5. Utilisez l’aiguille fine de tungstène pour manœuvrer chaque œil à la surface de la lame de microscope avec la surface basale de chaque œil adjacent à la lame. Abaissez doucement un glissement de couverture propre sur le tissu et fixez-le avec du vernis à ongles.
      REMARQUE: L’organisation des yeux sur la lame afin qu’ils soient proches les uns des autres ou dans une ligne facilitera la microscopie ultérieure.
   6. Imagez les rétines à l’aide d’une microscopie fluorescente ou confoccale.
      REMARQUE: Les diapositives doivent être stockées à 4 °C si elles ne sont pas photographiées immédiatement.

Representative Results

Figure 1 : Sélection et culture des pupes pour la dissection. (A) Les larves et les pupes errantes du troisième stade larvaire (L3) se trouvent le long des côtés des cultures saines de Drosophila. (B) Pré-pupes peuvent être identifiés par leur couleur blanche translucide que le pigment n’a pas encore été généré dans le cas pupal protecteur. L’axe antérieur-postérieur et dorsale-ventral de la pupe sont montrés en bleu. Une attelle en bambou humide est utilisée pour déloger et ramasser les pré-pupes des parois du flacon. (C) Les pupes sont placées à l’intérieur de tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL qui sont étiquetés de façon appropriée (génotype, date de collecte et heure de collecte) et(D)cultivés à l’intérieur d’une chambre humidifiée assemblée à partir d’une boîte à pointes de pipette vide. L’humidité est maintenue en plaçant un morceau de tissu humide à l’intérieur de la boîte. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Disséquer l’œil pupal. (A) Les pupes sont adhérentes à du ruban adhésif à double face sur un plat de dissectation noir. Les coordonnées antérieures, postérieures et dorsales sont indiquées en bleu. (B) Pour isoler les complexes œil-cerveau (un seul est montré ici), (C) la pupe est d’abord retiré de son cas pupal. Des étapes importantes de ce processus sont indiquées. Les lignes rouges indiquent où déchirer et ouvrir le boîtier pupal après l’operculum est enlevé. Les pupes sont ensuite retirées du boîtier pupal déchiré avec des forceps. (D) Une pupe exposée est d’abord coupée le long du thorax avec des ciseaux de microdissection (position indiquée avec la ligne rouge pointillée) et l’épithélium de tête puis soigneusement déchiré ouvert (flèches rouges), comme indiqué dans (E) pour révéler le complexe opaque oeil-cerveau. (F) Après incubation avec des anticorps appropriés, les rétines sont tranchées à partir de complexes œil-cerveau. Des étapes importantes de ce processus sont indiquées. Le cerveau oculaire est stabilisé par une aiguille de tungstène robuste (à gauche) et les rétines enlevées à l’aide d’une aiguille de tungstène fine (à droite). Pour les analyses de protéines et d’ARN, les rétines non ciseaux non cifiées peuvent être coupées proprement à partir de lobes optiques à l’aide d’une fine lame de rasoir ou de ciseaux de microdissection, plutôt que d’une aiguille de tungstène fine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O