Dissezione del complesso occhio-cervello da Fly Pupae: un metodo per isolare il tessuto retinale

Overview

Questo video descrive come sezionare e isolare il complesso occhio-cervello dalle pupe di Drosophila. Il protocollo in primo piano dimostra la procedura che produce tessuti di alta qualità, compatibili, ad esempio, con l'immunosottenzione, così come altri esperimenti di espressione genica.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da DeAngelis e Johnson, Dissezione della Retina Pupal Drosophila per immunoistochimica, analisi occidentale e isolamento dell'RNA,   J. Vis. Exp.

1. Preparazione tissutale

1. Impostare croci drosophila (come descritto in precedenza in Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) o ceppi di Drosophila specifici per la cultura per ottenere pupe del genotipo desiderato. Per garantire che un gran numero di pupe emerga in modo coincidente, stabilisci queste colture di mosca in duplice copia su mezzi alimentari ricchi di nutrienti o supporti alimentari standard generosamente integrati con pasta di lievito.
2. Mantenere le colture di Drosophila a 25 °C. Per le croci che utilizzano il sistema UAS-GAL4, GMR-GAL4 è un driver ideale espresso in cellule larvali del disco oculare posteriori al solco morfogenetico e durante lo sviluppo pupale. La croce UAS-lacZ X GMR-GAL4 funge da croce di controllo ideale in quanto guida l'espressione della proteina β-galattosidasi non endogena e inerte.
3. Utilizzare la punta di una stecca di bambù da 6" bagnata con acqua distillata per sollevare delicatamente le pre-pupe bianche (Figura 1B) dal lato di fiale di coltura sane ( Figura1A) e posizionare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml(Figura 1C).
4. Posizionare i tubi in una scatola di punta di pipetta di plastica insieme a un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata per mantenere la camera a umidità sufficiente a proteggere le pupe dall'essiccazione(figura 1D). Incubare le pupe a 25 °C fino alla dissezione.
5. Utilizzare una stecca di bambù asciutta da 6" per spingere delicatamente le pupe fuori dal tubo di microcentrifugo e su un piatto di sezionatura nero. Posare un pezzo fresco di nastro biadito sul piatto di sezionazione lontano dalle pupe.
6. Utilizzando un paio di forcep, posizionare con cura il lato dorsale delle pupe verso l'alto (cioè opercoli rivolti verso l'alto, Figura 1B)sul nastro (Figura 2A). Assicurarsi che le pupe aderiscano bene al nastro.
   NOTA: L'umidità sulla custodia pupale inibisce l'adesione sicura al nastro, nel qual caso, consente alle pupe di asciugarsi all'aria prima di posizionarsi sul nastro a doppia aspetto.

2. Dissezione dei complessi occhio-cervello

1. Utilizzare le forcep per rimuovere l'opercolo di ogni pupa (Figura 2C).
2. Usa le forbici a microdisezione per affettare o tagliare la custodia pupale di ogni pupa. Lembo aprire la custodia pupale per rivelare la testa, il torace e il segmento addominale anteriore, fissando i bordi della custodia pupale al nastro a doppia parte (Figura 2C).
   NOTA: Non è necessario rivelare completamente le pupe.
3. Perforare l'addome di ogni pupa con forcep affilate, per afferrare l'animale e rimuoverlo dal suo caso pupale (Figura 2C).
4. Posizionare le pupe sulla piastra di dissezione nera, lontano dal nastro, e coprire con circa 400 μL di soluzione tamponata con fosfato ghiacciato (PBS, pH 7.4).
5. Afferrare ogni pupa dall'addome con le forcep e, con le forbici a microdisezione, fare un taglio trasversale pulito attraverso l'intero torace, tagliando la pupa a metà(Figura 2D).
6. Rimuovere il residuo posteriore di ogni carcassa dal PBS e mettere da parte sul piatto di sezionazione (non scartare, vedere il passaggio 3.2.1).
7. Utilizzando due paia di forcep fini, aprire il torace e la testa di ogni pupa per rivelare il complesso occhio-cervello (Figura 2E). Per fare questo, afferrare i bordi tagliati dell'epitelio del torace e strappare gradualmente per aprire il torace e quindi la capsula della testa, esponendo il complesso occhio-cervello e il tessuto adiposo circostante.
8. Senza afferrare il tessuto, utilizzare le forcelle per guidare il complesso occhio-cervello lontano dai resti della capsula della testa o raccogliere il complesso occhio-cervello dalla capsula a testa aperta strappata.
   NOTA: Il complesso occhio-cervello è a forma di manubrio, bianco troppo bianco e più traslucido rispetto al grasso color crema circostante(Figura 2B,E).
9. Con le forcep, rimuovere con cura la maggior parte del grasso associato ai complessi occhio-cervello senza toccare il tessuto oculare.

3. Lavorazione dei tessuti per immunofluorescenza

1. Sezionare almeno 6-10 pupe come descritto (passaggi 2.1-2.9).
   NOTA: Da tre a quattro repliche indipendenti di ogni dissezione tendono a produrre dati sufficienti per testare un'ipotesi.
2. Lavaggio e fissazione
   1. Tagliare la punta di una punta della pipetta P20 o P100 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura della punta a ~ 1 mm di raggio e lubrificare pipettando un mix di PBS e grasso su e giù. Questo grasso può essere ottenuto dai resti della carcassa rimossi nel passaggio 2.6.
   2. Trasferire i complessi occhio-cervello in ~400 μL di PBS in un piatto di vetro a 9 pozzetti, sul ghiaccio. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 per il trasferimento.
      NOTA: I complessi occhio-cervello aderirono alle punte non ibricate durante la pipettazione e saranno danneggiati o persi.
   3. Rimuovere il grasso rimanente associato al tessuto oculare pipettando il PBS su e giù per ruotare delicatamente i complessi occhio-cervello. In questo e in tutti i passaggi di lavaggio successivi, non pipettare direttamente i complessi occhio-cervello su e giù in quanto ciò danneggerà il fragile tessuto oculare.
   4. Trasferire i complessi occhio-cervello in un volume minimo (<20 μL) di PBS in almeno 250 μL di fissivo. Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 35 minuti, sul ghiaccio.
      NOTA: La stessa punta lubrificata preparata al passaggio 3.1.1 può essere utilizzata per questo trasferimento.
   5. Con la stessa punta di pipetta, trasferire i complessi occhio-cervello in un pozzo contenente ~400 μL di PBS. Mescolare pipettando la soluzione su e giù e incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio, per lavare. Ripetere il passaggio di lavaggio almeno due volte.
      NOTA: I complessi occhio-cervello possono essere mantenuti per diverse ore nel lavaggio PBS finale, sul ghiaccio o a 4 °C, prima di procedere al passaggio 3.3.1.
3. Colorazione degli anticorpi
   1. Per bloccare il tessuto prima dell'esposizione a soluzioni anticorpali, trasferire i complessi occhio-cervello a ~ 400 μL di PBT. Utilizzare la punta lubrificata e una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 per il trasferimento. Incubare per 10-60 minuti, sul ghiaccio.
   2. Preparare la soluzione di anticorpi primari diluire gli anticorpi appropriati in PBT. Poiché i complessi occhio-cervello sono incubati in 10 μL di aliquote di soluzione anticorpale, il volume preparato sarà una replica di 10.
   3. Aliquota 10 μL di soluzione anticorpale in un pozzo pulito di un vassoio microwell da 72 porri.
   4. Tagliare la punta di una punta della pipetta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura della punta a ~ 0,5 mm di raggio e lubrificare tubazione PBT su e giù.
   5. Trasferire non più di 5 complessi occhio-cervello, in un volume di <3 μL di PBS, in ogni pozzo di 10 μL di soluzione anticorpale utilizzando una micropipetta di spostamento dell'aria P10 e la punta lubrificata.
   6. Omogeneizzare la soluzione anticorpale tubazionando la soluzione su e giù. Non pipettare i complessi occhio-cervello su e giù in quanto ciò danneggerà il tessuto.
   7. Per ridurre al minimo l'evaporazione della soluzione anticorpale, posizionare un piccolo pezzo di tessuto imbevuto di acqua distillata nel vassoio del microwell e sigillare il vassoio (ad esempio, con il coperchio fornito). Incubare durante la notte a 4 °C.
   8. Trasferire i complessi occhio-cervello dal vassoio del microwell in ~ 400 μL di PBT in un piatto di vetro a 9 pozzi, da lavare. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P10 e una punta lubrificata PBT (prepararsi come descritto al passaggio 3.3.4). Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio.
   9. Ripetere il passaggio di lavaggio almeno due volte. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 e una punta lubrificata PBT per trasferire i complessi occhio-cervello tra le soluzioni di lavaggio.
   10. Preparare la soluzione anticorpale secondaria diluire gli anticorpi secondari appropriati con tag fluoroforo in PBT, se necessario. 100 μL di soluzione anticorpale secondaria è sufficiente per lotto di 6-10 pupe. Aliquota la soluzione anticorpale secondaria in un piatto di dissezione del vetro a 9 pozzi.
   11. Trasferire i complessi occhio-cervello in una soluzione anticorpale secondaria. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 e una punta lubrificata PBT per il trasferimento.
   12. Incubare i complessi occhio-cervello in soluzione anticorpale secondaria per 1-2 h a temperatura ambiente, o 3-5 h a 4 °C. Per evitare lo sbiancamento dei fluorofori con la luce, coprire la preparazione con un foglio.
       NOTA: La durata ottimale dell'incubazione nella soluzione di anticorpi secondari può variare a seconda degli anticorpi primari e secondari utilizzati.
   13. Trasferire i complessi occhio-cervello in ~ 400 μL di PBT in un piatto di vetro da 9 pozzetto, da lavare. Mescolare pipettando la soluzione su e giù. Incubare per 5-10 minuti sul ghiaccio. Questo passaggio di lavaggio deve essere ripetuto almeno due volte.
4. Fissazione secondaria
   1. Per una fissazione secondaria, trasferire i complessi occhio-cervello ad almeno 200 μL di fissazione e incubare per 20 min a temperatura ambiente o 35 min a 4 °C.
      NOTA: La fissazione secondaria irrigidisce il tessuto oculare, che aiuta il montaggio (fase 3.5).
   2. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 e una punta lubrificata pbt per trasferire complessi occhio-cervello in ~ 400 μL di PBT in un piatto di vetro a 9 pozzetti, sul ghiaccio, da lavare per 5 minuti.
   3. Ripetere il passaggio di lavaggio almeno una volta.
   4. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 e una punta lubrificata pbt per trasferire i complessi occhio-cervello in ~ 400 μL di PBS in un piatto di vetro a 9 pozzetti, sul ghiaccio, per risciacquare per 1-2 minuti. Mantenere il tessuto in movimento pipettando PBS, ma non il tessuto, su e giù per evitare che complessi occhio-cervello si sistemino e aderiscano alla piastra di vetro durante il risciacquo PBS.
5. montante
   1. Trasferire i complessi occhio-cervello in ~200 μL di supporti di montaggio. Utilizzare una micropipetta di spostamento dell'aria P20 o P100 e una punta lubrificata pbt per trasferire i complessi occhio-cervello. Lasciare che il tessuto equilibra nei mezzi di montaggio per 1-2 ore.
   2. Posizionare una goccia di 5-8 μL di supporti di montaggio freschi su uno scivolo al microscopio pulito.
   3. Tagliare una punta P10 con una lama di rasoio pulita per aumentare l'apertura della punta a ~ 0,5 mm di raggio e utilizzare questo e una micropipetta di spostamento dell'aria P10 per trasferire i complessi occhio-cervello in 5-8 μL di supporti di montaggio nella goccia di supporto di montaggio sullo scivolo.
   4. Utilizzare due aghi di tungsteno per separare gli occhi dai lobi ottici. Inchiodare un complesso occhio-cervello allo scivolo con un robusto ago di tungsteno e tagliare ogni occhio lontano dal lobo ottico associato con un ago di tungsteno fine (Figura 2F).
   5. Utilizzare l'ago di tungsteno fine per manovrare ogni occhio sulla superficie del vetrino del microscopio con la superficie basale di ogni occhio adiacente allo scivolo. Abbassare delicatamente un coperchio pulito sul tessuto e fissare con smalto per unghie.
      NOTA: Disporre gli occhi sullo scivolo in modo che siano vicini l'uno all'altro o in una linea faciliterà la successiva microscopia.
   6. Immagini le retine usando la microscopia fluorescente o confocale.
      NOTA: Le diapositive devono essere conservate a 4 °C se non vengono immediatamente coniate.

Representative Results

Figura 1: Selezione e coltura delle pupe per la dissezione. (A) Le larve e le pupe vaganti della terza larva (L3) si collocano lungo i lati di sane colture di Drosophila. (B) Le pre-pupe possono essere identificate dal loro colore bianco traslucido in quanto il pigmento deve ancora essere generato nel caso delle pupe protettive. L'asse anteriore-posteriore e dorsale-ventrale della pupa è mostrato in blu. Una stecca di bambù umida viene utilizzata per spodestarsi e raccogliere pre-pupe dalle pareti del flaconcino. (C) Le pupe sono collocate all'interno di tubi a microcentrifugo da 1,5 ml etichettati in modo appropriato (genotipo, data di raccolta e ora di raccolta) e(D)coltivati all'interno di una camera umidificata assemblata da una scatola vuota di punta di pipetta. L'umidità viene mantenuta posizionando un pezzo di tessuto umido all'interno della scatola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sezionare l'occhio pupale. (A) Le pupe sono aderenti a nastro a doppia aspetto su un piatto di sezionatura nero. Le coordinate anteriore, posteriore e dorsale sono indicate in blu. (B) Per isolare i complessi occhio-cervello (uno solo è mostrato qui), (C) la pupa viene prima rimossa dal suo caso pupale. Vengono mostrati passaggi importanti in questo processo. Le linee rosse indicano dove strappare e aprire la custodia pupale dopo che l'opercolo è stato rimosso. Le pupe vengono quindi rimosse dalla custodia pupale strappata con le forcep. (D) Una pupa esposta viene prima tagliata lungo il torace con forbici a microdisezione (posizione indicata con linea rossa tratteggiata) e l'epitelio della testa viene poi accuratamente strappato (frecce rosse), come mostrato nella(E)per rivelare il complesso opaco occhio-cervello. (F) Dopo l'incubazione con anticorpi appropriati, le retine vengono tagliate da complessi oculari-cerebrali. Vengono mostrati passaggi importanti in questo processo. Il cervello oculare è stabilizzato con un robusto ago di tungsteno (a sinistra) e le retine rimosse con un ago di tungsteno fine (a destra). Per le analisi di proteine e RNA, le retine non fissate possono essere tagliate in modo pulito dai lobi ottici usando una lama di rasoio fine o forbici a microdissezione, piuttosto che un ago di tungsteno fine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bamboo splints, 6"	Ted Pella Inc	116
Black dissecting dish			Glass petri dish filled to rim with SYLG170 or SYLG184 (colored black with finely ground charcoal powder). Leave at room temperature for 24-48 h to polymerize.
Blade holder	Fine Science Tools	10053
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Double-sided tape	3M	665
Drosophila& food media, nutrient-rich			7.5% sucrose, 15% glucose, 2.5% agar, 20% brewers yeast, 5% peptone, 0.125% MgSO4.7H2O, 0.125% CaCl2.2H20
Drosophila& food media, standard			Bloomington Drosophila Stock center cornmeal recipe. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Fixative solution			4% formadehyde in PBS, pH 7.4.
Forceps	Fine Science Tools	91150-20	Forceps should be sharpened frequently.
Formaldehyde	Thermo Scientific	28908
Glass 9-well dishes	Corning	7220-85	Also known as 9-well dishes
Glass coverslips (22 x 22 mm)	Fisher Scientific	12-542-B
Glass microscope slides (25 x 75 x 1 mm)	Fisher Scientific	12-550-413
Glass petri dish	Corning	3160-100BO
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Microcentrigure tubes	Axygen	MCT-175-C
Microdissection scissors	Fine Science Tools	15000-03
Microwell trays (72 x 10 µL wells)	Nunc	438733
Mounting media			0.5% N-propylgallate and 80% glycerol in PBS
N-propylgallate	Sigma-Aldrich	P3130
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Sigma-Aldrich	P5368	Prepare according to manufacturer's instructions
PBT			0.15% TritonX and 0.5% bovine serum albumin in PBS, pH 7.4
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Primary antibody: goat anti-GAPDH	Imgenex	IMG-3073	For Western blotting. Used at 1:3000
Primary antibody: rabbit anti-cleaved Dcp-1	Cell signaling	9578S	For immunofluorescence. Used at 1:100
Primary antibody: rat anti-DEcad	Developmental Studies Hybridoma Bank	DCAD2	For immunofluorescence. Used at 1:20
Primary antibody: rat anti-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	DCAD1	Gift from Tadashi Uemura. Used at 1:100.
Scalpel blades	Fine Science Tools	10050	Break off small piece of scapel blade and secure in blade holder.
Secondary antibody: 488-conjugated donkey anti-rat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	712-545-153	For immunofluorescence. Used at 1:200
Secondary antibody: cy3-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-165-144	For immunofluorescence. Used at 1:100
Secondary antibody: HRP-conjugated goat anti-rat IgG (H+L)	Cell Signaling Technology	7077	For Western blotting. Used at 1:3000
Secondary antibody: HRP-conjugated rabbit anti-goat IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	305-035-003	For Western blotting. Used at 1:3000
Stereo dissecting microscope (M60 or M80)	Leica Microsystems		or similar microscope
Sylgard (black)	Dow Corning	SYLG170
Sylgard (transparent)	Dow Corning	SYLG184	Color black with finely ground charcol powder
Tissue: Kimwipes	KIMTECH	34120
TritonX	Sigma-Aldrich	T8787
Tungsten needle, fine	Fine Science Tools	10130-10	Insert into pin holder
Tungsten needle, sturdy	Fine Science Tools	10130-20	Insert into pin holder
Yeast paste	(local supermarket)		Approximately 2 tablespoons Fleischmann's ActiveDry Yeast (or similar) dissolved in ~20 mL distilled H2O