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Immunology and Infection

Usando Click Química para medir el efecto de la infección viral en el Host-Cell ARN Síntesis

Published: August 9, 2013 doi: 10.3791/50809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, Sealy Center for Vaccine Development, Center for Biodefense and Emerging Infectious Diseases, University of Texas Medical Branch

Summary

Este método describe el uso de la química clic para medir los cambios en la transcripción de la célula huésped después de la infección con el virus de la fiebre del Valle del Rift (RVFV) cepa MP-12. Los resultados se pueden visualizar a través de microscopía de fluorescencia cualitativamente o cuantitativamente obtenerse a través de citometría de flujo. Este método es adaptable para su uso con otros virus.

Abstract

Muchos virus de ARN han desarrollado la capacidad para inhibir la transcripción célula huésped como un medio para eludir las defensas celulares. Para el estudio de estos virus, por lo tanto, es importante disponer de una manera rápida y fiable de medición de la actividad transcripcional en las células infectadas. Tradicionalmente, la transcripción se ha medido ya sea por la incorporación de nucleósidos radiactivos tales como 3H-uridina seguido por la detección mediante autorradiografía o recuento de centelleo, o la incorporación de análogos halogenados tales como uridina 5-bromouridina (BRU) seguido de la detección a través de inmunotinción. El uso de isótopos radiactivos, sin embargo, requiere un equipo especializado y no es factible en una serie de entornos de laboratorio, mientras que la detección de BrU puede ser engorroso y puede sufrir de baja sensibilidad.

La química clic desarrollado recientemente, que consiste en una formación de triazol catalizada por cobre de una azida y un alquino, ahora proporciona un rápido y highly alternativa sensible a estos dos métodos. Haga clic en la química es un proceso de dos pasos en el que el ARN nacientes se etiqueta por primera incorporación de la uridina análogo 5-etiniluridina (UE), seguido por la detección de la etiqueta con una azida fluorescente. Estos azidas están disponibles como varios fluoróforos diferentes, lo que permite una amplia gama de opciones para la visualización.

Este protocolo describe un método para medir la supresión transcripcional en células infectadas con el virus de la fiebre de Rift Valley (RVFV) cepa MP-12 usando química clic. Al mismo tiempo, la expresión de proteínas víricas en estas células se determina por inmunotinción intracelular clásica. Los pasos 1 a 4 detalle un método para visualizar la represión transcripcional a través de microscopía de fluorescencia, mientras que los pasos del 5 al 8 de detalle un método para cuantificar la represión transcripcional mediante citometría de flujo. Este protocolo es fácilmente adaptable para su uso con otros virus.

Introduction

Tradicionalmente, la actividad transcripcional se ha medido mediante la incorporación de cualquiera radiactivo (3 H-uridina) 1 o halogenados (BRU) 2 nucleósidos en ARN nacientes. Estos análogos de uridina son absorbidos por las células, convertidos en uridina-trifosfato (UTP) a través de la vía de recuperación de nucleósido, y posteriormente incluidas en los ARN recientemente sintetizado. 3 H-uridina pueden ser detectados por autorradiografía, que puede llevar mucho tiempo, o de centelleo contando, que requiere un equipo especializado. Por otra parte, el uso de isótopos radiactivos puede no ser práctico en una serie de entornos de laboratorio, incluidos los laboratorios de alta contención de seguridad de la biotecnología. BrU se puede detectar a través de inmunotinción con anticuerpos anti-Bru, que pueden requerir la permeabilización áspera para garantizar el acceso del anticuerpo al núcleo o desnaturalización parcial de ARN, como la estructura secundaria del ARN podría ser un impedimento estérico para la unión de anticuerpos.

_content "> El protocolo descrito aquí utiliza el Click recientemente desarrollado clic química 3 para medir la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12. química se basa en un cobre altamente selectiva y eficiente (I) catalizada por reacción de cicloadición entre un alquino y un resto azida 4,5. En este protocolo, ARN naciente en las células infectadas se etiqueta primero a través de la incorporación de uridina análogo de la UE. En un segundo paso, que se incorpora a la UE se detecta a través de la reacción con una azida fluorescente. Las principales ventajas de este método son (1) que no requiere el uso de isótopos radiactivos y (2) que no requiere la permeabilización dura o desnaturalización del ARN. Con un peso molecular de menos de 50 Da, el acceso de la azida fluorescente no esté impedido por el insuficiente estructura secundaria permeabilización o ARN. Además, los investigadores no están limitados en su elección de anticuerpos primarios cuando la combinación de la detección de ARN con una claseinmunotinción ical para las proteínas virales.

Dos diferentes métodos se describen en este protocolo: uno para la visualización de la transcripción a través de microscopía de fluorescencia (pasos 1-4), y uno para la cuantificación de la transcripción a través de citometría de flujo (pasos 5-8). Ambos de estos métodos cosechadora etiquetado de ARN naciente con una inmunotinción intracelular de proteínas virales, lo que permite una correlación entre la actividad transcripcional y la infección viral en una base de celda por celda.

Los autores han utilizado con éxito el protocolo que se describe aquí para determinar la actividad transcripcional en las células infectadas con la cepa RVFV MP-12 6, las células infectadas con diferentes MP-12 mutantes 7,8, 9, y las células infectadas con el virus Toscana (TOSV) 10. El protocolo descrito aquí puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la tinción de inmunofluorescencia de las proteínas virales o celulares específicas.

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Protocol

Análisis de la transcripción por microscopía de fluorescencia

1. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE

  1. Lugar 12 mm cubreobjetos redondos en placa de cultivo tisular de 12 pocillos, un cubreobjetos por pocillo.

Nota: Si las células tienen problemas para la adhesión a cubreobjetos, la capa con poli-L-lisina (MW ≥ 70000) antes de colocar en los pozos. Para este objetivo, cubreobjetos de sumergir en una solución estéril de 0,1 mg / ml en H2O de poli-L-lisina durante 5 min. Enjuague cubreobjetos con H2O estéril y secar al aire durante al menos 2 horas.

  1. Para las células de semillas 293 en cubreobjetos, añadir x 10 células 4 5 en 1 ml de medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina) por pocillo. Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% CO 2 S / N.
  2. Infectar las células con MP-12 a una multiplicidad de infección (MOI) de 3. Incluya por lo menos dos pozos no infectados: uno de los dos pozos servirán como el control no infectado, y el otro serán tratados con actinomicina D (ActD) en el paso 1.5 como un control para la supresión transcripcional. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 200 ml. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2.

Nota: En vez de infectar a las células, las células también se pueden transfectar con ADN plásmido o in vitro sintetizan ARN que codifica una proteína viral específica. Para este objetivo, transfectar células con un reactivo de transfección química apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricante y continúe en el paso 1.5 a 16 h después de la transfección. Es aconsejable para optimizar las condiciones de transfección y el tiempo de incubación antes de su etiquetado ARN y la fijación.

  1. Eliminar el inóculo y se añade 1 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 15 hr.
ove_content "> Nota:. Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado de ARN y la fijación Configurar este curso de tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonadas y todos muestras pueden ser etiquetados, se fijaron, y se tiñeron en el mismo tiempo.

  1. En 15 horas después de la infección (hpi), sustituya medio de cultivo con medio que contenía 1 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora.
  2. A los 16 hpi, eliminar el medio y lavar los cubreobjetos de una vez con 1 ml de PBS (KCl 0,20 g / L, KH 2 PO 4 0,20 g / l, NaCl 8,00 g / L, Na 2 HPO 4 1,15 g / L, pH 7,4) por pocillo. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) por pocillo e incubando durante 30 min a TA.

Nota: Para preparar la solución de fijación PFA 4%, se disuelven 10 g de paraformaldehído en 150 ml de H 2 O se calienta a 60 ° C en un agitador magnético con calefacción. Añadir 500 l de NaOH 1 M y seguir removiendo hasta que la solución se aclare. Filtrar la solución de PFA a través de un papel de filtro para eliminar las partículas y añadir 62,5 ml de tampón de fosfato (77 mM NaH 2 PO 4, 287 mM de Na 2 HPO 4, pH 7,4). Añadir H2O hasta un volumen total de 250 ml. Congelar a -20 ° C en alícuotas de un solo uso.

  1. Lavar una vez con 1 ml de PBS por pocillo. No se requiere tiempo de incubación para este y todos los pasos de lavado posteriores. Proceda inmediatamente al paso 2.

Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo, una pérdida de la señal de fluorescencia de RNA ya se puede observar si las células se mantienen durante 1 hora a 4 ° C . Del mismo modo, si porformando un experimento de evolución en el tiempo, asegúrese de etiqueta, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.

2. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado

  1. Permeabilizar las células mediante la adición de 1 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA.

Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 2.1 a 2.3 deben estar libre de nucleasa.

  1. Lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
  2. Retire cubreobjetos de la placa de 12 pocillos y transferencia en cámara húmeda. Cubra cada portaobjetos con 50 - 100 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 20 mM de azida fluorescente [excitación / emisión máxima: 590/617 nm], ácido ascórbico 100 mM) cada uno. Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Para el montaje de la cámara húmeda, línea de la parte inferior de un cultivo de células o placa de Petri con un diámetro de 10 cm con una película de plástico de parafina. Forre el interior del borde de la diSH con toallas de papel húmedas. Coloque el cubreobjetos sobre la película de parafina plástico.

Nota: Tenga cuidado de no dejar que los cubreobjetos se sequen durante este o cualquier otro paso en el protocolo. Lo mejor es añadir la solución de tinción a cada cubreobjetos directamente después de que se ha colocado en la cámara húmeda.

Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo.

Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que coincida con los filtros de su microscopio de fluorescencia.

  1. Retire cubreobjetos de cámara húmeda y colocar en una placa de 12 pocillos frescos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.

Nota: si no dese desea la protección de las proteínas virales, cubreobjetos se puede montar y fotografiada después de este paso (vaya al paso 3.3).

3. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales

  1. Añadir 1 ml de tampón de bloqueo (3% (w / v) de suero de albúmina (BSA) en PBS bovina) a cada pocillo y se incuba durante 30 min a TA en la oscuridad.
  2. Retire cubreobjetos de placa de 12 pocillos, de transferencia en cámara húmeda y cubra con 50 - 100 l de anticuerpo primario (anti-RVFV, una especie de regalo del Dr. RB Tesh, UTMB) diluido en tampón de bloqueo (1:500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero.

Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad.

  1. Retire cubreobjetos de cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavartres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
  2. Retire cubreobjetos de un lugar de 12 pocillos, en lugar cámara húmeda y cubierta con 50 - 100 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón de bloqueo (1: 500). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Asegúrese de seleccionar un anticuerpo secundario que puede reconocer el anticuerpo primario y coincide con los filtros de su microscopio de fluorescencia.

Nota: Si se desea, 200 ng / ml de DAPI se puede añadir a la dilución de anticuerpo secundario para visualizar los núcleos.

  1. Retire cubreobjetos de la cámara húmeda y lugar de nuevo en placa de 12 pocillos y lavar tres veces con 1 ml de PBS por pocillo.
  2. Montar cubreobjetos mediante la colocación de una gota (ca. 15 l) de Fluoromount-G en un portaobjetos de microscopio. Sumerja el portaobjetos en H 2 O, eliminar el exceso de H 2 O tocando ªlado de correo contra una toalla de papel, y el lugar de células del lado hacia abajo en la gota de Fluoromount-G. Deje secar al aire durante 5 minutos.

Nota: Si formación de imágenes en un microscopio invertido, permitir Fluoromount-G para solidificar a 4 ° CO / N o colocar el cubreobjetos en el portaobjetos de un microscopio mediante el sellado del borde con esmalte de uñas transparente.

Nota: diapositivas se pueden visualizar inmediatamente o se almacenaron a 4 ° C en la oscuridad durante un máximo de una semana.

4. Adquisición de Datos

  1. De imagen usando un microscopio de fluorescencia.

Nota: Asegúrese de seleccionar fluoróforos adecuados que se pueden visualizar utilizando su microscopio. Como referencia, los siguientes son los fluoróforos y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de las imágenes mostradas en esta publicación.

DAPI:
Filtro de excitación: BP 330-385
Dichromatic espejo: 400 DM
Filtro de emisiones: LP 420

Filtro de excitación: BP 460-490
Dichromatic espejo: 505 DM
Filtro de emisiones: LP 510

Fluoróforo con un máximo de excitación / emisión de 590/617:
Filtro de excitación: BP 545-580
Dichromatic espejo: 600 DM
Filtro de emisiones: LP 610

Análisis de la transcripción por citometría de flujo

5. Infectar las células con el MP-12 y la etiqueta de ARN naciente con la UE

  1. Semilla células 293 en una placa de cultivo tisular de 6 pocillos en medio de crecimiento (DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina). Incubar en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2 hasta que las células han alcanzado el 80 - 100% de confluencia.
  2. Infectar las células con MP-12 a una moi de 3. Incluir al menos dos pozos infectados: uno de los dos pozos servirá como control no infectado, el otro serán tratados con ActD en el paso5.4. Retire medio de crecimiento y se diluye el stock de virus de manera que el volumen total añadido a cada pocillo es de 400 l. Incubar durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C y 5% de CO 2.
  3. Retire inóculo y añadir 2 ml de medio de cultivo fresco por pocillo. Incubar a 37 ° C durante 12 hr.

Nota: Si la adaptación de este protocolo para el uso con otro virus, es aconsejable llevar a cabo un experimento de curso de tiempo para determinar el momento óptimo para el etiquetado y la cosecha. Establecer este supuesto tiempo de modo que los tiempos de infección están escalonados y todas las muestras pueden ser etiquetados, se recogieron, y se tiñeron en el mismo tiempo.

  1. A las 12 hpi, sustituya medio de cultivo en un medio con 0,5 mM UE. Para uno de los pozos de infección simulada, también añadir 5 g / ml de ActD. Esto servirá como el control para la supresión de la transcripción, como ActD inhibe la síntesis de ARN dependiente de ADN. Células Volver a la incubadora.
  2. A los 13 hpi, lavar las células una vez que el ingenioh PBS y la cosecha por tratamiento con tripsina de las células. Lavar las células cosechadas tres veces con PBS que contenía 1 mM de EDTA (PBS-EDTA).

Nota: Durante esta y las siguientes medidas, no centrifugar las células más rápidamente que 500 - 1000 xg para evitar la rotura celular. Centrifugar las células durante 1-2 min para sedimentar.

Nota: Si se planea una inmunotinción superficie siguiendo la reacción de click, la cosecha utilizando una goma de policía o un raspador celular desechable en su lugar.

  1. Fijar las células mediante resuspensión en 1 ml de PFA al 4% y se incuba durante 30 min a TA. Consulte el paso 1.6 para obtener instrucciones sobre cómo preparar 4% PFA.
  2. Lavar una vez con 1 ml de PBS-EDTA por pocillo. Proceda inmediatamente al paso 6.

Nota: Es importante para proceder inmediatamente con la reacción de click, como el ARN degenera si se mantiene en esta etapa durante períodos prolongados de tiempo. Del mismo modo, si se realiza una vez cexperimento ourse, asegúrese de etiquetar, fijar y teñir todas las muestras al mismo tiempo.

6. Haga clic en la reacción para detectar ARN marcado

  1. Permeabilizar las células mediante resuspensión en 0,5 ml de 0,2% de Triton X-100 en PBS. Incubar durante 10 min a TA.

Nota: Todas las soluciones utilizadas en los pasos 6.1 a 6.3 deben estar libre de nucleasa.

Nota: Si las células no hacen sedimentos correctamente durante este paso, aumentar el tiempo de centrifugación de 5 min. Comportamiento de sedimentación se mejorará una vez que las células se suspenden en tampón FACS (paso 6.4).

  1. Lavar una vez con 1 ml de PBS.

Nota: No utilice EDTA en este paso, ya que esto quelar el Cu 2 + iones necesarios para la reacción de click.

  1. Resuspender las células en 200 l solución de tinción clic (Tris 100 mM pH 8,5, 1 mM de CuSO4, 200 nM azida marcado con colorante fluorescente [exclitación / máximo de emisión: 650/665 nm], ácido ascórbico 100 mM). Incubar durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Preparar la solución de tinción clic fresco inmediatamente antes de este paso. Las soluciones madre de 1,5 M de Tris pH 8,5, 100 mM de CuSO4, y ácido ascórbico 500 mM se pueden almacenar a 4 ° C. Sin embargo, descartar cualquier solución de ácido ascórbico que se ha convertido amarillo.

Nota: Si las células se agrupan durante este paso, volver a suspender pipeteando arriba y abajo varias veces.

Nota: Asegúrese de seleccionar un fluoróforo que puede ser detectada por el citómetro de flujo.

Nota: también preparar una muestra de las células infectadas que no están sometidos al procedimiento de tinción clic; éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas o incluir un adicional de infección así en el paso 5.2. Estos concélulas trol se immunostained en el paso 7.1.

  1. Lavar dos veces con tampón FACS (PBS que contenía 1 mM de EDTA y 0,5% (w / v) de BSA).

Nota: Si no se desea inmunotinción de proteínas virales, las células se pueden analizar inmediatamente (continúe en el paso 8).

7. La inmunofluorescencia para detectar la expresión de las proteínas virales

  1. Resuspender las células en 200 l de anticuerpo primario (anti-RVFV) diluidos en tampón FACS (1:10.000) y se incuban durante 1 hora a TA en la oscuridad.

Nota: Como alternativa, este paso se puede realizar de O / N a 4 ° C en la oscuridad.

Nota: También prepara una muestra de las células no infectadas que se sometieron al procedimiento de tinción clic, pero no se immunostained, éstos serán necesarios para la calibración del citómetro de flujo. Cualquier uso de la mitad de las células infectadas simuladas o incluir un bien no infectada adicional enpaso 5.2.

Nota: Cuando la adaptación de este protocolo para su uso con un virus diferente, determinar la dilución óptima para su anticuerpo primario primero.

  1. Lavar las células dos veces en tampón FACS.
  2. Resuspender las células en 200 l de anticuerpo secundario (IgG anti-ratón conjugado con colorante fluorescente [excitación / emisión máxima: 495/519 nm]) diluido en tampón FACS (1:1.000) y se incuba durante 1 hora a TA en la oscuridad.
  3. Lavar las células una vez en tampón FACS.

Nota: En este punto, las células pueden ser almacenadas O / N a 4 ° C en la oscuridad.

8. Adquisición de Datos

  1. Resuspender las células en 500 l de tampón FACS, transferencia en tubos de poliestireno de 5 ml y analizar utilizando un citómetro de flujo. Usa-12 MP células infectadas (ninguna reacción clic, sólo tinción anti-RVFV) y las células infectadas simuladas (haga clic reacción sólo) para calibrar el instrumento.

Noe: Asegúrese de seleccionar fluoróforos que pueden ser detectados por el instrumento. Como referencia, las siguientes son las líneas de láser y conjuntos de filtros utilizados para la adquisición de los datos mostrados en esta publicación.

Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 495/519:
Láser: 488 nm
Filtrar: 530/30

Fluoróforo con un espectro de excitación / emisión de 650/665:
Láser: 640 nm
Filtrar: 670/20

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Representative Results

La proteína NE de RVFV (familia Bunyaviridae, género Phlebovirus) 11 inhibe la transcripción en general célula huésped a través de dos mecanismos distintos: (i) por secuestrante de la subunidad p44 del factor de transcripción basal TFIIH 11 y (ii) mediante la promoción de la degradación proteasomal de la p62 subunidad de TFIIH 6. El MP-12 cepa de la vacuna 13 RVFV se ha utilizado para los experimentos descritos en este protocolo desde el MP-12 cepa se puede manejar en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 y se excluye de la regla de selección agente en los EE.UU., que se aplica a otros wild- escriba cepas RVFV. La proteína NE de la cepa MP-12 es completamente funcional y conserva la capacidad de suprimir la transcripción de acogida 6. El virus RMP12-C13type, que lleva una deleción que abarca el 69% del gen NSs 14, se ha incluido como un virus de control que carece de todas las funciones de NSS, incluyendo la capacidad de suprimir la transcripción de la célula huésped.

Figura 1 muestra imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia. En las células infectadas simuladas (figuras 1a-1d), aparecen núcleos de color rojo brillante debido a la transcripción en curso. Dado que las células sólo se han etiquetado con la UE durante 1 hora, seguido por fijación inmediata, la mayoría de los ARN permanecen en el núcleo. En contraste, cuando las células han sido tratados con ActD para inhibir farmacológicamente transcripción (Figuras 1e-1h), la fluorescencia roja de los núcleos se reduce notablemente. Esta fluorescencia se reduce de manera similar cuando las células están infectadas con MP-12 (Figuras 1 N-1q), pero no con los mutantes de deleción NSS RMP12-C13type (Figuras 1i-1M). Figura 2 también muestra imágenes obtenidas por microscopía de fluorescencia, pero aquí las células han sido transfectadas con ARNm sintetizado in vitro en lugar de la infección con el virus vivo. Cuando las células fueron transfectadas con ARNm que codifica la GFP (Figuras 2g-2i), no hay cambio en transactividad criptional comparación con las células no transfectadas (Figuras 2a-2c), como se visualizó por fluorescencia de color rojo en los núcleos, se puede detectar. Sólo transfección con ARNm que codifica el NSS de factores de virulencia RVFV (Figuras 2k-2m) se traduce en disminución de fluorescencia roja.

La Figura 3A representa los datos cuantitativos obtenidos mediante citometría de flujo. Los datos se representan como gráficos de dispersión con la señal fluorescente de la UE para la incorporación en el ARN nacientes representada en el eje y, y que para la tinción anti-RVFV traza en el eje x. La puertas cuadrante se establece de modo que la mayoría de las células infectadas simuladas se encuentra en el cuadrante superior izquierdo, la mayoría de las células tratadas ACTD se encuentra en el cuadrante inferior izquierdo, y la mayoría de las células infectadas se encuentra en la mitad derecha de la trama . Cuando las células fueron infectadas con MP-12, 81,5% del total de células, o 93% de células positivas anti-RVFV, demostraron una reducción de la actividad transcripcional. En contraste, cuanlas células fueron infectadas con el n RMP12-C13type, 91,6% del total de células, o 97% de células positivas anti-RVFV, mostraron que la actividad transcripcional, que era comparable a la de las células infectadas simuladas. Figura 3B representa los mismos datos que la Figura 3A en la forma de un histograma de fluorescencia de ARN etiquetado con la incorporación de la UE.

Figura 1
Figura 1. Microscopía de fluorescencia de las células infectadas con MP-12 y RMP12-C13type. Células 293 fueron simulacro infectadas o infectadas con cualquiera de MP-12 o la supresión NE del mutante RMP-12-C13type. Entre 15 y 16 hpi, las células se marcaron con 1 mM UE. Como control para la supresión de la transcripción, las células infectadas simuladas fueron tratados con 5 mg / ml de ActD simultáneamente con el tratamiento de la UE. Los núcleos son visualizados a través de la tinción con DAPI (azul), la expresión de las proteínas virales es visualizaron por tinción con anticuerpos anti-RVFV (verde), y el ARN es visualizard mediante la detección de la UE incorporó con azida marcado con colorante fluorescente (excitación / emisión máxima: 590/617 nm) (rojo).

La figura 2
Figura 2. Microscopía de fluorescencia de las células transfectadas con ARN sintetizado in vitro, ya sea para GFP o MP-12 NSS. 293 células fueron transfectadas mock, o transfectadas con ARN sintetizado in vitro que codifica para cualquiera de GFP o MP-12 NSS. Entre 15 y 16 horas después de la transfección, las células fueron marcadas con 1 mM UE. Como control para la supresión de la transcripción, las células transfectadas de forma simulada fueron tratados con 5 mg / ml de ActD simultáneamente con el tratamiento de la UE. La expresión de GFP es visualizaron por tinción con un anticuerpo anti-GFP (GI), la expresión de NSS es visualizaron por tinción con anticuerpos anti-RVFV (AF, km) seguido de IgG anti-ratón conjugado con tinte fluorescente (excitación / emisión maximum: 495/519 nm) (verde), y el ARN es visualizaron mediante la detección de la UE incorporado con azida marcado con colorante fluorescente (excitación / emisión máxima: 590/617 nm) (rojo).

Figura 3
Figura 3. (A) Análisis citométrico de flujo de células infectadas con MP-12 o RMP12-C13type. Las células fueron simulacro infectadas, o infectados, ya sea con MP-12 o RMP12-C13type. Entre 12 y 13 hpi, las células se marcaron con 0,5 mM UE. Como control para la supresión de la transcripción, las células transfectadas de forma simulada fueron tratados con 5 mg / ml de ActD simultáneamente con el tratamiento de la UE. La expresión de las proteínas virales es visualizaron por tinción con anticuerpos anti-RVFV seguido de un anticuerpo secundario marcado con colorante fluorescente (excitación / emisión máxima: 495/519 nm) (anti-RVFV) y el ARN es visualizaron mediante la detección de la UE incorporado con azida marcado con colorante fluorescente (excitación / emisión máxima: 650/665 nm) (RNA). El datA se representa como un gráfico de dispersión. (B) Representación de los mismos datos se muestra en A como un histograma. La intensidad de fluorescencia para la incorporación de la UE se traza en el eje x, los recuentos de células se representan en el eje y. Haga clic aquí para ver la figura más grande .

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Discussion

El protocolo proporcionado describe un método para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped a través de la incorporación de uridina análogo de la UE en el ARN nacientes. Este método tiene varias ventajas sobre los métodos anteriores: es rápido, sensible, y no se basa en el uso de isótopos radiactivos. Además, el método puede ser adaptado para producir los datos cualitativos a través de microscopía de fluorescencia o de datos cuantitativos a través de citometría de flujo utilizando esencialmente los mismos reactivos. Cuando se combina con la tinción de inmunofluorescencia para antígenos virales, este método también permite al investigador para diferenciar infectado a partir de células no infectadas.

Es importante tener en cuenta que este método también etiqueta ARN virales recién sintetizadas a la misma velocidad, ya que las etiquetas de transcripciones de acogida, un inconveniente que se comparte con otros métodos que dependen de la 3 H-uridina o BrU incorporación. Al menos en el caso de RVFV MP-12 infección, sin embargo, hemos encontrado que el amount de transcripciones de acogida, con mucho, mayor que la cantidad de transcritos virales, y por lo tanto la influencia de ARN viral en el ARN total medidos por este ensayo es insignificante. Al adaptar este protocolo para su uso con otro virus, los investigadores podrán identificar transcripción viral a través de su localización, a través del tratamiento de las células infectadas con ActD, oa través de hibridación in situ fluorescente (FISH) 15. Si el virus se replica en el citoplasma, tales como MP-12, a continuación, el ARN viral se pueden distinguir fácilmente a partir de ARN celular, que todavía está contenida principalmente en el núcleo después de 1 h de etiquetado. Las células infectadas también pueden ser tratados con ActD para suprimir la transcripción de la célula huésped, dejando la síntesis de RNA viral no afectado. Funciones ACTD por la unión a ADN de doble cadena 16 y por lo tanto sólo inhibe la transcripción dependiente de ADN, pero no tiene efecto sobre virales ARN polimerasas dependientes de ARN.

Al realizar este protocolo, es fundamental para evitarcontaminación con nucleasas entre la permeabilización y la reacción de marcaje clic, como la UE ARN marcado sigue siendo sensible a la degradación por RNasas 3. Además, los investigadores deben proceder inmediatamente a la reacción de marcaje clic, como tiempos de incubación prolongados entre la fijación y haga clic en el etiquetado de reacción, incluso a 4 ° C, conduce a la degradación de ARN y en última instancia resultar en una pérdida de la señal de fluorescencia de ARN. Esto es de especial interés cuando se realizan experimentos de tiempo-por supuesto, los investigadores deben diseñar sus experimentos de manera que todas las células pueden ser etiquetados, se fijaron, y se tiñeron en el mismo tiempo. Afortunadamente, la señal de fluorescencia de ARN se mantiene estable después de la reacción de marcaje clic, por lo que el protocolo puede ser fácilmente se detuvo después de este paso.

Por último, los investigadores tienen que tener en cuenta que el efecto citopático (CPE) causada por muchos virus que afecta negativamente a la síntesis de ARN celular, incluso en ausencia de cualquier represión transcripcional específico. Lopor lo tanto, es importante para medir la actividad transcripcional en un tiempo después de la infección cuando las células siguen siendo viables. Si un virus mutante está disponible, que carece de la capacidad de suprimir la transcripción, tales como RMP-12-C13type (Figuras 1 y 3), esto puede ser una gran herramienta para determinar el momento óptimo para la medición de la transcripción.

Cuando la planificación de un gran número de experimentos, los investigadores podrían considerar etiquetado directo de su anticuerpo primario con un fluorocromo 17, eliminando así la necesidad de un anticuerpo secundario y la reducción del tiempo requerido para la detección de antígenos virales.

En resumen, este protocolo proporciona una manera rápida y fiable para medir el efecto de la infección viral en la transcripción de la célula huésped. Puede ser fácilmente adaptado para el uso con diferentes virus y tiene el potencial de ser modificado para incluir la inmunotinción para proteínas virales o celulares específicas.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Agradecemos RB Tesh para proporcionar el ratón policlonal anti-RVFV antisuero y M. Griffin del UTMB Citometría de Flujo Core Facility para ayudar con la citometría de flujo. Esta labor fue apoyada por 5 U54 AI057156 a través del Centro de Excelencia de la Región Occidental, NIH subvención R01 AI08764301, y la financiación del Centro Sealy para el Desarrollo de Vacunas de UTMB.BK fue apoyado por el James W. McLaughlin Fondo de Becas en UTMB.OL fue apoyado por R. Hilleman Early-Stage Premio Investigador Carrera Maurice.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-ethynyl-uridine Berry Associates PY 7563 dissolve in DMSO for 100 mM stock
12-mm round coverslips Fisherbrand 12-545-82
5 ml polystyrene tubes BD Biosciences 352058
Actinomycin D (ActD) Sigma 9415 dissolve in DMSO for 10 mM stock
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG Invitrogen A-11029
Bovine Serum Albumin (BSA) Santa Cruz sc-2323
CuSO4 Sigma C-8027 dissolve in H2O for 100 mM stock
DAPI Sigma D-9542 dissolve in H2O for 5 mg/ml stock
DMEM Invitrogen 11965092
FBS Invitrogen 16000044
fluorescent azide (Alexa Fluor 594-coupled) Invitrogen A10270
fluorescent azide (Alexa Fluor 657-coupled) Invitrogen A10277
Fluoromount-G Southern Biotech 0100-01
L-ascorbic acid Sigma A-5960 dissolve in H2O for 500 mM
paper filter VWRbrand 28333-087
paraformaldehyde Sigma 158127
Penicillin-Streptomycin Invitrogen 15140122
poly-L-lysine (MW ≥ 70000) Sigma P1274
Triton X-100 Sigma T-8787
Trizma base Sigma T-1503 dissolve in H2O for 1.5 M stock, pH 8.5
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200056
Fluorescence Microscope e.g. Olympus IX71
Flow Cytometer e.g. BD Biosciences LSRII Fortessa

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References

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