Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

Published: August 13, 2014 doi: 10.3791/50891
Automatic Translation
1,2,3, 1, 1, 1,2, 1, 1,2, 2,4
1Department of Physics and Astronomy, Rowan University, 2Department of Biomedical and Translational Sciences, Rowan University, 3Department of Biomedical Sciences, Cooper Medical School of Rowan University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Rowan University

Summary

מיזוג הוא גישה יעילה ליצירת חומרים ביולוגיים עם מגוון רחב של מאפיינים ותכונות משולבות. על ידי חיזוי האינטראקציות מולקולריות בין חלבוני משי טבעי השונים, פלטפורמות סגסוגת חלבון חדשות משי משי עם גמישות מתכונן מכאנית, תגובה חשמלית, שקיפות אופטית, processability הכימי, פריקות ביולוגית, או יציבות תרמית יכולות להיות מתוכננות.

Abstract

חלבונים סיביים להציג רצפים ומבנים שונים שהיה בשימוש עבור יישומים שונים בתחומים ביו כגון חיישנים ביולוגיים, nanomedicine, התחדשות רקמות, ואספקת סמים. עיצוב חומרים המבוססים על האינטראקציות מולקולרית בקנה המידה בין חלבונים אלה יעזרו ליצור חומרים ביולוגיים סגסוגת חלבון רב תכליתי חדשים עם תכונות מתכונן. מערכות חומר סגסוגת כאלה מספקות גם יתרונות בהשוואה לפולימרים סינטטיים מסורתיים בשל פריקות ביולוגית חומרים, התאמה הביולוגית, וtenability בגוף. מאמר זה משמש תערובות חלבון משי פראי tussah (pernyi Antheraea) ומשי תות הביתי (Bombyx mori) כדוגמא לספק פרוטוקולים שימושיים בנושאים אלה, ובכלל זה כיצד לחזות אינטראקציות בין חלבונים על ידי שיטות חישוביות, איך לייצר סגסוגת חלבון פתרונות, כיצד לאמת מערכות סגסוגת על ידי ניתוח תרמי, ואיך להמציא חומרי סגסוגת משתניםכולל חומרים אופטיים עם gratings העקיפה, חומרים חשמליים עם מעגלי ציפויים, וחומרי תרופות לשחרור תרופה ומשלוח. שיטות אלה יכולים לספק מידע חשוב לעיצוב חומרים הביולוגיים רב תכליתיים הדור הבא המבוסס על סגסוגות חלבון שונה.

Introduction

טבע יצר אסטרטגיות ליצירת מטריצות ביולוגיות מתכונן ורבות תכליתיים באמצעות מספר מוגבל של חלבונים מבניים. לדוגמא, elastins וcollagens משמשים תמיד ביחד in vivo כדי לספק את נקודות החוזק מתכווננת ופונקציות הנדרשות לרקמות ספציפיות 1,2. המפתח לאסטרטגיה זו הוא המיזוג. מיזוג כרוך חלבוני ערבוב עם יחסים ספציפיים והוא גישה טכנולוגית כדי ליצור מערכות חומר פשוטות עם מתכונן ותכונות מגוונות 3-5. בהשוואה לאסטרטגיות הנדסה סינתטיות 6,7, מיזוג יכול גם לשפר את אחידות חומר ואת היכולת לעבד את החומר בשל קלות התפעול 8-16. לכן, עיצוב חומרים רב תכליתיים, ביולוגית סגסוגת חלבון הוא אזור מתפתח של מחקר רפואי. טכנולוגיה זו תספק גם ידע שיטתי של ההשפעה של מטריצות חלבון טבעיות בפונקציות תא ורקמה הן בvitro וin vivo 10,17. על ידי אופטימיזציה של ממשקים מולקולריים בין חלבונים שונים, חומרי סגסוגת המבוסס על חלבונים יכולים להכיל מגוון של פונקציות פיזיות, כגון יציבות תרמית בטמפרטורות שונות, גמישות לתמיכה ברקמות שונות, רגישות חשמלית באיברים משתנים, ותכונות אופטיות להתחדשות רקמת קרנית 3, 18-27. התוצאה של מחקרים אלה תספק פלטפורמת חלבון חומרים חדשה בתחום של המדע ביו עם רלוונטיות ישירות לתיקונים מתכונן רקמות וטיפולים למחלות ועוד להוביל להתקני שתל מתכלים שבם ניתן חזו התכונות הטיפוליות ואבחון הרומן שלהם 3.

יש לי חלבונים מבניים טבעיים רבים מאפיינים פיזיים וביו קריטיים שיכול להיות מנוצלים כמועמדים למטריצות ביולוגי. משי ממינים שונים של תולעים, keratins משערות וחוטי צמר, elastins וcollagens מרקמות שונות, וחלבונים צמחיים שונים הם חלק מהחלבונים המבניים השכיחים ביותר המשמשים לעיצוב חומרים המבוססים על חלבונים משתנים (איור 1) 18-27. באופן כללי, חלבונים אלה יכולים ליצור מבנים שונים מולקולריים משניים (למשל, יריעות בטא למשי, או סלילים מפותלים לkeratins) בשל רצפים הייחודיים שלהם חוזר על עצמו אמינו העיקרי חומצה 3,28-35. תכונות אלה לקדם את הקמתה של מבנים מקרוסקופיים עצמיים התאספו עם פונקציות ייחודיות בממשקים ביולוגיים שגרמו השירות שלהם כמשאב יקר של חומרי biopolymer. הנה, שני סוגים של חלבונים מבניים שמשו (חלבון משי tussah פראי וחלבון B ממשי תות מבוית כדוגמא) כדי להדגים את הפרוטוקולים הכלליים של ייצור חומרים ביולוגיים סגסוגת חלבון שונים. הפרוטוקולים הראו כוללים חלק 1: תחזיות אינטראקציה חלבון וסימולציות, חלק 2: ייצור של פתרונות סגסוגת חלבון, וחלק 3: ייצור של סגסוגת חלבוןמערכות ויישומים אופטיים, חשמל, ותרופות.

איור 1
איור 1 חומרי גלם של חלבונים מבניים שונים הנמצא בשימוש נפוץ במעבדה שלנו לעיצוב חומרים המבוססים על חלבונים, כוללים בדי משי ממינים שונים של תולעים, keratins משערות וחוטי צמר, elastins מרקמות שונות, וחלבונים צמחיים שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

.1 חיזוי של אינטראקציות חלבון

  1. ניתוח Bioinfomatics של מולקולות חלבון
    1. בקר במרכז הלאומי לאתר מידע ביוטכנולוגיה (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), ולחפש שמות החלבון שישמשו למחקר סגסוגת. הערה: בדוגמה זו, שני חלבונים היו בשימוש: חלבון, המהווה את fibroin משי tussah הפראי, וחלבון B, המהווה את fibroin משי תות הביתי. לחלבון, ניתן למצוא רצפי חומצות אמינו ב" fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1 "(pernyi Antheraea הוא הסיני (Oak) Tussah העש). לחלבון B, ניתן למצוא רצפי חומצות אמינו ב" מבשר שרשרת כבדה fibroin [Bombyx מורי] צמח השדה הפניה רצף: NP_001106733.1 "ו" מבשר שרשרת אור fibroin [Bombyx מורי] רצף התייחסות צמח השדה: NP_001037488.1 "יחד (Bombyx mori הוא תולעת המשי המבויתת של עץ התות).
    2. בחר וsave רצף חומצות האמינו של החלבון והחלבון B מבסיס הנתונים.
    3. בקר באתר אינטרנט ExPASy (SIB ביואינפורמטיקה משאבי הפורטל) (www.expasy.org) או להשתמש בתוכנה מסחרית אחרת כדי לחשב את bioinfomatics נתונים הבסיסי של חלבונים המבוססים על הרצפים שלהם, כולל, אך לא מוגבל ל, מטען הכולל לכל מולקולה, מדד הידרופוביות של המולקולה, עקומת טיטרציה של המולקולות בערכי pH שונים, וכו 'מידע זה תשמש כאלמנטים בסיסיים לסימולציה הממוחשבת של אינטראקציות חלבון, ותעזור להבין אם יש שני חלבונים אלה אינטראקציות חזקות. [הערה: בשלב זה הוא לא בדיוק מניבוי כל פרט ופרט של האינטראקציה החלבון כמו אלה המשמשים בפפטידים קטנים או מדע חלבונים פונקציונלי. מטרת סעיף זה היא רק כדי להימנע מייצור תערובת חלבונים עם פרידות macrophase ברורות שלא יכול להיקרא חומר "סגסוגת". לכן, ההערכה יכולה להיות מקורבת אבל המערכת סגסוגת חלבון דואר יכולה להיות מאומת על ידי שיטת ניסוי המתוארת בשלב 3.1 באמצעות ניתוח תרמי מדויק].
  2. סימולציה חישובית של מערכת סגסוגת חלבון
    להלן מתואר הליך כדי לדמות את מערכת סגסוגת חלבון. תכנית סימולציה שכתוב בשפת תכנות C, שניתן להשתמש במערכת מחשב בודדת או מרובה. סריג-אביב מסת מודל (LSM) שימש כדי לדמות את סגסוגת-החלבונים 36-39. מודל LSM נותן תיאור פשוט של הכח שקול על מסה כאשר מחובר לקפיץ ואפשר לפתור את משוואת הכוח להבין את התנועה עבור כל מסה. אלגוריתם תוכנה פשוט למודל מערכת סגסוגת חלבון זה באמצעות מודל LSM ניתן באופן הבא:
    1. מייצג חלבון יחיד כחלקיקים גסים גרגר שיש לו מסה של m.
    2. השתמש Hookean או אביב הניאו Hookean לייצג אג"ח 38,39. על ידי interlinking מספר סופי של חלקיקים עם קפיצים, מ 'פחית אחתהאייק תחום משנה סגסוגת המייצג אבן בניין יציבה של סגסוגת-החלבונים. לייצג סוגים שונים של איגרות חוב בתוך ההצמדה, להשתמש שונה קבועי האביב / קשיחות.
    3. מודל מערכת סגסוגת החלבון כחומר מורכב ממשנה סגסוגות העמומה-crosslinked. שוב כאן stiffnesses שונה שימש לייצג אג"ח שונה בין בין קשרים של תת סגסוגות.
    4. מודל שבירת הקשר ותהליך רפורמה על ידי דגם בל 40,41, שדרכו קשרים חלשים מותר להיות רפורמה אך קשרים חזקים לא יכולים לתקן ברגע שהם נשברים. כאשר המערכת נמצאת בהדגישה מספיק (גם על איגרות החוב תוך suballoy ובין suballoy), יכולים להיות שבור אגרות חוב ורפורמה.
    5. על מנת ללמוד תופעות עיוות בסגסוגת-החלבונים כאשר הם הדגישו, חלים כוחות חיצוניים למערכת. הפץ את הכוחות האלה באותה מידה לכל חלקיק בעת פתרון משוואת הכוח (החוקים של ניוטון).
    6. מודל אינטראקציותבין הפתרון (כגון מולקולות מים) והחלבונים, להחיל כוח נוסף גרור או כוח חיכוך לכל חלקיק.
    7. לפתור את משוואת הכוח לכל חלקיק עם פעולותיו של כל כוח (כוח הקפיץ מהאג"ח, הכוח החיצוני, וכוח החיכוך).
    8. לחשב ולחלץ את עמדותיהם של חלקיקי החלבון כפונקציה של זמן.
    9. לחשב את הכמויות הפיזיות המאפיינות את סגסוגת-חלבונים מהעמדות של החלקיקים.
    10. שנה את קשר הנוקשות בתכנית כדי להבין את יחסי גומלין בין חלבונים שונים. (הממוצעת אג"ח הנוקשות מחושבת ממודולוס של יאנג של חומרי החלבון. ניתן להשיג מודול יאנג של חומרי חלבון סיביים שונים או על ידי יוניברסל מתיחה מבחן 18, או ישירות מספרויות קודמות 2-4,18).

.2 ייצור של פתרונות סגסוגת חלבון

משי פראי tussah (חלבון) ומשי מקומי תות (חלבון בוקר) נבחרו כאן כדוגמא למערכת סגסוגת חלבון. פרוטוקול זה מציג לראשונה כיצד להשיג פתרון משי tussah הפראי (חלבון).

  1. חותך פקעות גלם פראיות משי tussah או סיבים במשקל של 3 גרם.
  2. למדוד 3 גרם של dicarbonate נתרן או סודיום קרבונט (הערה: אם אתם משתמשים בסודיום קרבונט, המשקל המולקולרי של שרשרות חלבון יקטין בתהליך הרתיחה 42).
  3. מלא כוס זכוכית 2 ליטר עם מים מזוקקים (H 2 O). לאחר מכן, הנח את כוס הזכוכית על במה חמה, לכסות אותו בנייר אלומיניום, וחום להרתחה.
  4. הסר את כיסוי נייר האלומיניום ולהוסיף dicarbonate נתרן נמדד באיטיות לתוך המים הרותחים, שמאפשר לו להתמוסס לחלוטין. (הערה: התפקיד של dicarbonate נתרן הוא "הסבון" לנקות את החלבונים מסיסים sericin וזיהומים אחרים מצורפים על פני השטח של סיבי משי פראיים אם באמצעות oth.אה סיבי חלבון הטבע, בחרו בחומרים כימיים המקבילה על פי הספרות).
  5. מוסיף את סיבי גלם חלבון (סיבי משי פראיים) לתוך המים הרותחים ולאפשר לרתיחה ל2-3 שעה (הערה:. יש זמן רתיחת השפעה קריטית למשקל המולקולרי של שרשרות חלבון 26,43 אחת צריך לבחור זמן מתאים על פי לספרות או על ידי ביצוע ניסויי שליטה 26,43. טמפרטורת הרתיחה יכולה גם להיות מותאמת להשפעת המשקל המולקולרי של שרשרות חלבון 26,43,44).
  6. לאחר הרתיחה, להסיר בזהירות את סיבי חלבון עם מרית מהפתרון ולסחוט אותם כדי להסיר את עודפי המים. (זהירות: הסיבים הם חמים מאוד!)
  7. בשלב הבא, לטבול את הסיבים בכוס 2 L עם מים מזוקקים קרים, ולשטוף את הסיבים פעמיים ל30 דקות כל אחד כדי להסיר לחלוטין את השאריות הטמאות ממשטח הסיבים. ייבש את הסיבים במנדף לשעה לפחות 12.
  8. ממסים 45.784 גרם של nit סידןשיעור (Ca (NO 3) 2) בכוס זכוכית כדי ליצור נוזל ב65 מעלות צלזיוס למשך המסת סיבי חלבון משי הפראי. (הערה: אם אתם משתמשים בסיבי חלבון טבעי אחרים, בחר מתאים ממס לפזר את החלבונים כאן אתה יכול גם להשתמש 9.3 M LiSCN או LiBr פתרון, או פתרון פוספט 85% להמסת סיבי משי שונים..)
  9. מערבבים את הסיבים והממס בשיעור של 1 גרם סיבים ל10 מ"ל ממס. לאפשר הסיבים לפזר ב95 מעלות צלזיוס למשך 5 עד 12 שעה. (הערה: בפעם ההמסה תלויה במשקל המולקולרי של חלבונים 26,43-45)
  10. שימוש במזרקים, מזריק את הפתרון הפראי משי ל12 מ"ל קלטות דיאליזה (מקסימום 1,000 MW כגודל חתך) או tubings דיאליזה אטום (1,000 MW המרבי כגודל חתך) וdialyze נגד 2 ליטר של מים מזוקקים. (הערה: ההזרקה היא יעילה יותר אם שמירה על הפתרון ב35 ° C, אחרת את הצמיגות של פתרון חלבון תגדל באופן דרמטי בטמפרטורת חדר). להחליף את המים מזוקקים לעתים קרובות כדי להסיר Ca (NO 3) 2 ממסים בפתרון (לאחר 30 דקות, 2 שעות, 6 שעות, ולאחר מכן כל שעה 12 במשך 3 ימים. בסך הכל, יהיו כ 8 החלפות מים).
  11. לאחר 3 ימים, לאסוף את פתרונות חלבון מקלטות הדיאליזה או צינורות ומקום ל13,000 צינורות סל"ד מדורגים.
  12. צנטריפוגה הפתרונות לשעה 1 ב3,500 סל"ד ב 4 ° C 3x כדי להסיר פיקדונות. אחרי כל סיבוב צנטריפוגות, למשוך במהירות את supernatant לתוך צינורות חדשים. אחסן את הפתרונות הסופיים במקרר 4 ° C..
  13. יוצקים 5 מ"ל של תמיסת חלבון על מצע polydimethylsiloxane (PDMS) או מצע הידרופובי שטוח אחר ולאפשר לו להתייבש לחלוטין (זה בדרך כלל לוקח שעות יותר מ 12). לשקול את סרט החלבון המוצק שנותר ולחשב את ריכוז הפתרון הסופי על ידי אחוז משקל (w /% v) = משקל נמדד (במ"ג) ÷ 5 (במ"ל) ÷ 10.
  14. לאסוף עוד סיבי חלבון טבעיים שנבחרו (בcas זהדואר, משי תות מבוית שימש כחלבון B), ולחזור על תהליך הנ"ל עם "סבון" מתאים והמסת ממס, עד פתרון המים חלבון הסופי עם ריכוז שנמדד מתקבל. [הערה: אם החומרים של החלבון נמצאים בצורת האבקה, להשתמש בצינורות נקבוביים מתאימים או קרומים להחזיק הדגימות במהלך התהליך "סבן". אם החלבון כבר מטוהר, ישירות עבור לשלב 2.8 לפזר את האבקה. אם החלבון כבר מטוהר והוא מסיס במים, להפוך את התמיסה המימית שלה עם ריכוז רצוי ראשון ולאחר מכן עבור לשלב 2.15 להלן כדי להפוך את פתרונות חלבון תערובת.]
  15. לאט לאט לדלל את חלבון פתרון (פתרון משי כאן פראי) במים מזוקקים ב 4 מעלות צלזיוס ליצירת חלבון 1.0 wt% תמיסה מימית. לעשות את אותו התהליך לחלבון B (משי כאן מבוית).
  16. לאט לאט לערבב חלבון 1% wt פתרון עם החלבון B פתרון ב 4 מעלות צלזיוס באמצעות פיפטה כדי למנוע עמ 'rotein צבירה במהלך ערבוב. (הערה 1: אל תשתמש במכשיר מערבולת לערבב חלבונים מאז חלבונים מסוימים (לדוגמא, משי) יהוו הידרוג במהלך הרטט 46,47 הערה 2:. במידת האפשר, להשתמש במכשירים נוספים כדי לשלוט בקצב הערבוב וקבלת גודל ערבוב הקפד לערבב אותם איטי ככל האפשר כדי להימנע מצבירה. אל פיפטה במהירות הפתרון במהלך ערבוב).
  17. פתרונות המיזוג הסופיים צריכים להיות יחס בין מסה שצוין או יחס טוחנת של חלבון: B. חלבון בדרך כלל, לערבב אותם עם יחס המוני של 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 להשיג קשת רחבה של פתרונות סגסוגת. השתמש בחלבון וחלבון B פתרונות טהורים כמו פקדים. לפתרון מיזוג עם יחס טוחנת של חלבון: חלבון B = R: (100-R). לחשב את יחס ערבוב הנפח (המבוסס על אותו פתרון% wt 1) על ידי: כרך: כרך ב '= R · (MW של): (100-R) · (MW של B).
  18. מייד הטיל את הפתרונות הסופיים במצעי PDMS כדי ליצור סרטים או desi האחרחומרי gned. (הערה: אין לאחסן פתרונות סגסוגת חלבון גבוה ריכוז במשך זמן רב יותר אגרגטים עלולים להיווצר מאוחר יותר בשל האינטראקציות בין חלבונים במים.). במידת הצורך, לדלל את פתרונות שהתערובת עם מים מזוקקים ללא יון ולשמור אותם במקרר 4 ° C. כדי למנוע הצטברות חלבון נוספת בפתרונות.

.3 ייצור של חלבון משתנה חומרי סגסוגת

  1. לאשר סגסוגת חיזוי על ידי ניתוח תרמי 3,9,31-35
    1. הכן מצעי PDMS ולנקות אותם על ידי שריה במים מזוקקים.
    2. עופרת פתרונות תערובת חלבון עם יחס ערבוב שונה על גבי מצעי PDMS.
    3. ייבש את הפתרונות לשעה לפחות 12 במנדף כימי עם זרימת אוויר עד סרטים נוצרים (הערה: השתמש באותו הנפח לפתרונות שונים, כך שהעובי של סרטים יכול להיות קבוע).
    4. הסר את סרטי סגסוגת חלבון ממצעי PDMS ומניח אותם על גבי כלים נקיים.
    5. לשקול מחבתות רבות דיפרנציאל הסריקה Calorimetry (DSC) אלומיניום ומכסים למחקר DSC. התאם את זוגות מחבת ומכסה יש משקל כולל שווה (במשקל של מחבת בתוספת משקל של מכסה שווה במשקל קבוע). לדוגמא, כאן במשקל כולל של מיכסה והמחבת 22.50 מ"ג שימש, ושמונה קבוצות של שילובי מכסה ומחבת עם משקל כולל זה הוכנו.
    6. לתמצת 6 מ"ג כל סוג של חלבון מיובש משתלב מחבתות DSC אלומיניום ולאטום אותם עם המכסים התואמים שלהם בתהליך 3.1.5. לאטום מחבת ריקה וזוג מכסה לשימוש עם המדגם כהתייחסות כך שרק קיבולת החום של דגימות עצמם יירשמו במהלך הניתוח התרמי (הערה: DSC ישווה קיבולת החום של מחבת התייחסות + מכסה לעומת ש של מדגם + מחבת + מכסה. בשל המשקל הזהה, קיבולת חום רקע מהמחבתות והמכסים תטופל ומשאיר רק את קיבולת החום של מדגם במחבת).
    7. שים אזכור אטום ומחבתות מדגם לתוך מכשיר DSC, עםטיהר את זרימת גז חנקן יבשה של 50 מ"ל / דקה, ומצויד במערכת קירור בקירור. לפני מדידות המדגם, מכשיר DSC צריך קודם להיות מכויל עם ספיר ואינדיום לזרימת חום וטמפרטורה, בהתאמה.
    8. טרום להפעיל את DSC בקצב חימום של 2 K / min 150 ° C ולאחר מכן החזק בטמפרטורה זו במשך 15 דקות כדי להסיר כל מולקולות מים שנותרו בדגימות (בדרך כלל סביב 3-10% ממשקל כולל). במהירות להתקרר (10 K / min) ל25 ° C.
    9. הפעל את DSC שוב בקצב חימום של 2 K / min 300 מעלות צלזיוס, או עד לשיא השפלה של תערובות חלבון מופיע 34. רשום את יכולות החום של מדגם החלבון בטמפרטורה שונה במהלך תהליך זה. להתקרר DSC ולשנות את המדגם הישן למדגם חדש עם יחס ערבוב שונה.
    10. לחשב ולתכנן את קיבולת החום לעומת עקומות טמפרטורה עבור כל דגימת תערובת חלבונים תוך שימוש בתוכנה DSC 31-35.
    11. שופט מ 'iscibility של תערובות חלבון בשיטה הבאה (ראה איור 4 תרמי ואיור 5) ואם שני החלבונים הם בליל באופן מלא, הם עשויים להיקרא "סגסוגות חלבון". אחרת "מורכב החלבון" הטווח יהיה שם מתאים על פי תאוריות תיאורי פולימר 48,49):
      1. החלבונים הבודדים וB צריכים להיות טמפרטורת אדם אחד מעברי זכוכית, גרם T (A) וגרם T (B) (ראה עקומות ירוק וכחול באיור 5) 3,48;
      2. טמפרטורת מעבר זכוכית יחידה זה היא בדרך כלל ביניים בין אלה של שני רכיבים בודדים חלבון, גרם T (A) וגרם T (B) (ראה איור 5) 3,48;
      3. הפרדת פאזות immiscible תערובות מתקבלת אם שני g T (A) וגרם T (B) נראים בעמדותיהם המקוריות (איור 5), ועם כל צעד גרם Tגובה באופן יחסי להרכב, שני החלבונים הם immiscible 3,48 באופן מלא.
      4. סוג תערובת מרוכבים חצי בליל של יהיה לי מעבר זכוכית רחב מאוד אחד, או ייתכן שעדיין יש שני מעברי זכוכית, אבל לכל אחד יש להעביר קרוב יותר לכל בן משפחה אחרת לרכיבים הטהורים חלבון, גרם T (A) וגרם T (ב) ( ראה איור 5). במקרה זה, ייתכן שיש מבני שלב מיקרו הטרוגנית נוצרו בין שני רכיבי החלבון, וההרכב עשוי להשתנות ממקום למקום.
    12. אם (3.1.11.1) הוא המקרה שמוצג בDSC, וזה יכול להיות אישר כי חלבון AB הוא מערכת סגסוגת, ואז להמשיך הלאה כדי להמציא חומרי סגסוגת חלבון.
  2. ייצור של חומרים אופטיים על ידי סגסוגות חלבון
    1. לייצר (במעבדה הייצור) או לרכוש משטח טופוגרפי שנועד ליציקה. בדוגמא ספציפית זו, זכוכית עם ארבעה דפוסי עקיפה שימשה (איור 4אופטי).
    2. מניחים את הכוס עם דפוסי עקיפה לתוך צלחת, ולוודא את פני השטח בדוגמת מתמודדים כלפי מעלה.
    3. מורחים פתרון PDMS באופן שווה על משטח הזכוכית, ולכסות באופן מלא את דפוסי פני השטח (פתרון PDMS נעשה על ידי שתילה ופתרון זרז ב9: יחס ערבוב 1 על פי הוראת המשתמשים 23,44).
    4. מניחים את צלחת הליהוק לתנור C ° 65 לפחות 2 שעות בזמן שעל משטח שטוח. פתרון PDMS צריך להתייבש למצע מוצק במהלך תהליך זה.
    5. הסר מצע PDMS מהזכוכית. דפוסי העקיפה כעת יש להעביר אל פני השטח PDMS.
    6. אגרוף החוצה תבניות PDMS עם דפוסי עקיפה באמצעות ניקוב חורים מתאים.
    7. זרוק פתרונות סגסוגת חלבון על משטחי PDMS עם דפוסי עקיפה, ולייבש אותם במשך שעה לפחות 12 להשיג סרטים עם דפוסי עקיפה.
    8. כדי להשיג חומרי סגסוגת חלבון לא מסיסים, למקם את כל הסט של drסרטי y, כולל תבניות PDMS לתוך תנור 60 ° C ואקום (25 kPa) עם קערת מים בתחתית התא. לשאוב את האוויר בתנור, ולתת דגימות לחשל אדי מים לפחות 2 שעות. (תהליך זה נקרא חישול אדי מים בטמפרטורה מבוקרת 45. השוואה עם שיטת מתנול בשימוש נרחב, זה יכול ליצור תוכן בטא גיליון דומה בחומרי משי 45). לשחרר את הוואקום ולקלף את הסרט מסיס מים ממצע PDMS באמצעות מלקחיים. בדוגמה זו, סגסוגות משי מבוית משי פראי משמשות.
    9. בחן את איכות דפוסי עקיפה בסרטים על ידי השוואתם עם דפוסי המקור על משטח הזכוכית (למשל, לאסוף תמונות SEM לפרטי מיקרו בקנה המידה; לאסוף דפוסי עקיפת לייזר לאיכות הדפוס הכללי).
  3. ייצור של מעגלים חשמליים על חלבון חומרי סגסוגות
    1. לפברק דפוס מעגל חשמלי על מצע זכוכית קליאה, הראשונהשקופיות זכוכית na באמצעות כמה הסרת שומנים ממסות כגון Alconox בשואב קולי למשך 5 דקות, ואחריו 5 דקות באצטון, ואחרי 5 דקות במתנול. מתנול משמש אחרון מאז שהוא מתאדה לאט יותר מאצטון כדי שניתן יהיה התפוצץ המצע ולא ייבוש ושאריות עוזבים.
    2. לפוצץ יבש שקופיות זכוכית באמצעות גז חנקן יבש אשר מופק על ידי הרתיחה פעמית מדיואר חנקן נוזלי 180 L.
    3. להציג את חומרי המצע לתוך התא בתצהיר. (הנחיות אלה הן למערכת המקרטעת אבל יכולות לשמש טכניקות בתצהיר אחרות.) אם התא נועד עם loadlock, הוואקום בחדר בתצהיר לא השפיע באופן משמעותי. לפנות loadlock ללחץ של 30 mTorr.
    4. פתח את שסתום השער בין loadlock והקאמרי בתצהיר העיקרי ולהציג את המצע לתוך התא.
    5. הפעל את גז Ar ווסת הלחץ ולשלוט בלחץ לdepositio הרצוילחץ n. לחצים גבוהים יותר לתת אטומים נמוכים יותר אנרגיה גמגמה מתכת וסרטים אחידים יותר ואילו לחצים נמוכים יותר תשואה טובה יותר הקפדה סרטים מופקדים מהר יותר. מגוון של לחצים הוא בדרך כלל בין 3 mTorr ו60 mTorr, עם 20 mTorr עובד היטב.
    6. אז מתכות מוקרנים על תריס שמגן על המצע מהציפוי באמצעות ספק RF של 100 W. נדרש מעגל כוונון לכוון את כוח RF ליעד המתכת. כוח DC יכול לשמש במקום RF למטרות מתכתיות. על מנת להסיר שכבות תחמוצת ומזהמים מהיעד, מראש גמגום במשך כמה דקות.
    7. לפתוח את התריס וגמגום המתכת על גבי המצע. השיעור בתצהיר לתצורה המתוארת הוא על 10 ננומטר לדקה. שיעור זה יהיה תלוי בעבודה מרחוק, לחץ, כוח מגנט בקתודת magnetron, עובי היעד והמתכת גמגמה. התאם את הזמן בתצהיר כדי להגיע לעובי הרצוי.
    8. להסיר את שקופית הזכוכית המצופה מקאמרי.
    9. באמצעות טווה, ספין ציפוי photoresist על פני השטח של הסרט. ניתן להשתמש בו מתנגד רב. במקרה זה, היה בשימוש photoresist החיובי.
    10. לאחר להתנגד הוא הסתובב על הסרט, לאפות רך על 90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לייבוש להתנגד.
    11. מניחים מסכת מגע עם תמונה של המכשיר בתקיפות נגד להתנגד. מקור אור UV משמש כדי לחשוף את photoresist. החשיפה היא 10 שניות אך משתנה בהתאם לעוצמתו של מקור האור ולהתנגד בשימוש.
    12. מניחים את הסרט במפתח photoresist עד התמונה המוקרנת מופיעה. שטיפות מפתח משם להתנגד שנחשף לאור UV אשר גורם שבירת אג"ח הפולימר. מייד לאחר התמונה מופיעה, לטבול את הסרט במים די כדי לעצור את המפתחים לעבוד על photoresist שלא נחשף.
    13. לפוצץ סרטים יבשים עם גז חנקן יבש.
    14. מניחים את הסרטים לתוך תנור ב 120 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ל" לאפות קשה "התמונהלהתנגד.
    15. אחרי הסרטים מגניבים, למקם אותם בפתרון תחריט עד המתכת אינה מוגנת על ידי photoresist מרימה את. לטבול במים כדי לעצור את התחריט.
    16. לשטוף עם אצטון כדי להסיר את photoresist הקשוח.
    17. לשטוף עם מתנול ומכה יבש עם חנקן יבש.
    18. ברגע שהמשקפים מצופים מוכנים, שחררת פתרונות סגסוגת חלבון שונים על גבי משטחי הזכוכית, ולייבש אותם במשך שעה לפחות 12 להשיג סרטי סגסוגת חלבון על המשקפיים. (הוא הציע לראשון לרכז את פתרונות סגסוגת עד 5% wt להשיג סרטי סגסוגת חלבון עבים.)
    19. בשל האינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי, סרטי המתכת הדקים יועברו ממשטחי הזכוכית לסגסוגת החלבון המצורף סרט משטחי 51. לקלף את סרטי סגסוגת חלבון עם דפוסי מתכת הדקים מזכוכית מצעים באמצעות מלקחיים.
    20. כדי להשיג חומרי סגסוגת חלבון לא מסיסים, למקם את הסרטים יבשים לתוך תנור 60 ° C ואקום (25 kPa) עם awצלחת ater בחלק התחתון של החדר. לשאוב את האוויר בתנור, ולתת דגימות לחשל אדי מים לפחות 2 שעות. לשחרר את הוואקום ולקלף את הסרט מסיס המים מן המצע באמצעות מלקחיים.
    21. בדוק את התכונות חשמליות של דפוסי מתכת על סרטי סגסוגת חלבון כגון התנגדות חשמלית ולהשוות אותם לדפוסי המקור על משטח הזכוכית.
  4. ייצור של חומרים פרמצבטיים בסגסוגות חלבון
    1. לפברק סרטי סגסוגת חלבון עם תרכובות תרופות, להכין ראשון מצע PDMS כמתואר בשלב 3.2. נקה את מצע PDMS נוצר על ידי מים מזוקקים.
    2. לפזר או לפזר את תרכובות תרופות לתוך תמיסה מימית. השתמש באולטרסאונד או מערבולת לערבב הומוגנית תרכובות תרופות עם המים. אם התרכובות לא מסיסה במים, לפזר את האבקה עם הפצה הומוגני במים מזוקקים ללא יון.
    3. לחשב את היחס בין המסה הרצויהתרכובות לסגסוגות חלבון על ידי: נפח של אחוז במשקל x פתרון מתחם של פתרון מתחם: נפח של אחוז במשקל x פתרון סגסוגת חלבון של פתרון מורכב (כאן פתרון סגסוגת% wt 1 היה בשימוש). בחר יחס להשיג סרט עם צפיפות מתחם רצויה בסרט סגסוגת חלבון.
    4. לאט לאט לערבב פתרון המתחם עם פתרון סגסוגת החלבון הבא את אותן ההוראות בסעיף 2 תהליך 2.16. (הערה: כדי למנוע gelation, לא ultrasonicate או מערבולת הפתרון במהלך הערבוב).
    5. יוצקים נפח מחושב של תערובת על גבי מצע PDMS ולייבש אותו לפחות 12 שעות במנדף כימי לסרט לקבל סגסוגת חלבון המכיל יחס שנועד של תרכובות תרופות.
    6. מבחינה פיזית crosslinked הסרט הבא באותה ההוראה בסעיף 3.2 תהליך 3.2.8. דוגמא לסרטי סגסוגת עם תרופות מודל מסיסים של צפיפות נמוכה (LD) או צפיפות גבוהה (HD) ניתן הייתה לראות באיור 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אינטראקציות בין חלבונים אופייניים (למשל, בין חלבון וחלבון B) יכולות להכיל תשלום תשלום אטרקציות (אלקטרוסטטי), היווצרות קשרי מימן, אינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי, כמו גם דיפול, ממס, יון נגדי, ואפקטים מטשטשים בין ספציפי תחומים של שני חלבונים (איור 2) 3. לכן, ביסודו, אנו יכולים לחזות את ההשפעות של אינטראקציות אלה על ידי סימולציות חישוביות.

איור 2
איור 2 אינטראקציות בין חלבון והחלבון ב 'בדרך כלל, אינטראקציות אלה יכולים להיות מבוססים על תשלום תשלום אטרקציות (אלקטרוסטטי), היווצרות קשרי מימן, או אינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי בין תחומים הספציפיים של שני החלבונים האלה.

חלבון סגסוגתמערכת יכולה להיות מודל כחומר מורכב מתחומים תת סגסוגת חלבון crosslinked, שבו כל אחד ממשנה סגסוגות אלה הנחה הוא להיות יציב. האינטראקציות בין החלבונים (A, B) יכולות להיחשב כאג"ח עם stiffnesses שונה (לצורך מחקר זה, אנו רואים רק שני סוגים של קשרים חלשים או חזקים באיור 3). קשרים החלשים יכולים לייצג קשרי מימן ואגרות חוב אחרים המתוארים באיור 2. חלבון סגסוגת בכללותה נוצר דרך קשרים צולבים כפולים בין תת סגסוגות רבות שהקיפו יחד דרך שני הקשרים חזקים וחלשים. תת סגסוגות נוצרות באמצעות קשרים חזקים ובתוך תת סגסוגות אנו מאפשרים ההיווצרות של קשרים חלשים יותר. חלבון סגסוגת בכללותה נוצר דרך קשרים צולבים כפולים בין תת סגסוגות רבות שקשורות יחד בקשרים חזקים וחלשים שונים. כאשר המערכת נמצאת בהדגישה מספיק, אג"ח החלש והחזק שניהם מקרע. תחת תנאים מתאימים הקשרים החלשים מותררפורמה בקשרים שוב. עם זאת, איגרות החוב חזקות יותר יהיה קרע בלתי הפיך. קיומה של הקשרים החלשים מאפשר סגסוגת חלבון כדי לשמור על השלמות המבנית שלה תחת לחץ חיצוני 36-41. סימולציה נומרית זה עושה שימוש במודל מתמטי שפותח באמצעות גישה מלמטה למעלה, המבוססת על שיטות אלמנטים סופיות באמצעות מודל סריג-אביב 36-41.

איור 3
איור 3 סימולציה חישובית כדי להדגים את היתרון המכני של מערכת סגסוגת חלבון במהלך המתיחה. במהלך הסימולציה המתיחה, סוג של חלבון (צבע כחול) אפשר ליצור רשת אלסטי כמו מעיינות מתן סופר גמישות לחומרים, ואילו סוג אחר של חלבון (צבע ירוק) יכול לספק crosslinkers הפיזי החזק לייצוב רשת החומר. stru דינמימעברי ctural (למשל, תצורות קשר מימן ועיוותים) יכולים להיגרם בתחומים שונים לאחסון ושחרור אנרגיה או מתן תמיכה מכאנית נוספת במהלך המתיחה.

איור 3 מדגים סימולציה חישובית טיפוסית של התכונות מכאניות של מערכת סגסוגת חלבון (עם משי tussah פראי כמו חלבון ומשי תות מבוית כמו החלבון B) במהלך מתיחה. במהלך הסימולציה המתיחה, סוג של חלבון (צבע כחול) אפשר ליצור רשת אלסטי עם מעיינות מתן סופר גמישות לחומרים, ואילו סוג אחר של חלבון (צבע ירוק) יכול לשמש כחלקיקים עם crosslinkers הפיזי החזק לרשת החומר. מעברים דינמיים מבניים (למשל, קשר מימן היווצרות ועיוות) יכולים להיגרם בתחומים שונים לאחסון ושחרור אנרגיה או מתן תמיכה מכאנית נוספת במהלך המתיחה. מחקרי הסימולציה לתתsa תמונה תיאורטית כללית כדי להבין את יחסי הגומלין בין מולקולות שונות מבניות חלבון, כך שזוגות שימושיים של חלבונים יכולים להיות הרים ליצירת חומרי סגסוגת חלבון עם אינטראקציות חזקות ומאפיינים ספציפיים, כגון גמישות מכאנית יוצאת דופן.

באופן כללי, ברגע שהחלבון וB נבחרים (הנה הם משי פראי ומשי מבוית), פתרון סגסוגת חלבון יכול להיות מיוצר במספר שלבים (איור 4). ראשית, יש לנקות את מקורות החלבון כמו סיבים או אבקות טבעיים או מטוהרים. לדוגמא, תהליך degumming יכול לשמש כדי להסיר את המשי המסיס sericin חלבונים מצופים על רוב סיבי fibroin משי 20. שנית, ממס מתאים צריך להיות מצא לפזר את מקורות חלבון מסיסים לפתרונות. לדוגמא, פתרון LiBr ריכוז גבוה הוא ממס טוב לחתוך מבנים משניים בטא גיליון משי שונה ולפזר את הסיבים לפתרונות.שלישית, שיטת דיאליזה יכולה לשמש כדי להסיר את המסת הממס ולשחזר את מולקולות החלבון בתמיסה מימית. צנטריפוגה נוספות היא לעתים קרובות יש צורך להסיר את הזיהומים ואגרגטים שלא נמסו בפתרון. לבסוף, ניתן לערבב תמיסות מימיות חלבון שונה יחד בעדינות ביחסים שונים. לכן, אם אין לי פתרונות שני חלבון הפרדת macrophase, הם יהיו מעורבבים יחד עם אינטראקציות חזקות וליצור מערכת סגסוגת חלבון חדשה עבור יישומים ביו שונים. כדי להפוך את חומרי סגסוגת חלבון מסיסים בגוף, ניתן להתאים טיפולים שונים פיזיים או כימיים crosslinking. לדוגמא, נמצא כי בטמפרטורה גבוהה וחישול אדי מים בלחץ גבוה יכולים חומרי משי או אלסטין שונים crosslink מאוד 6,52. בעוד שניתן crosslinked חומרי קרטין שונים על ידי קשרי דיסולפיד הטבעי שלהם ברשתות בצד החלבון 53.

ברגע עמ 'פתרונות סגסוגת rotein מיוצרים ומאומת, הם יכולים להיווצר במגוון רחב של חומרים ביולוגיים עם תכונות מתכונן, כוללים מטריצות חומר עבור יישומים תרמיים, מכאניים, אופטיים, חשמליים, כימי, או ביו (איור 4). במאמר זה, שלושה יישומים חדשים לחומרים האלה כדי להוכיח את היתרון הייחודי של חומרים ביולוגיים סגסוגת חלבון שנבחר (איור 4). באמצעות טכניקות מיקרו ייצור מודרניות, יכולים להיות שנוצרו דפוסי פני השטח שונים במייקרו או ננו קשקשים על חומרי סגסוגת חלבון (איור 4 יישום אופטי). לדוגמא, אם תבנית התאבכות אופטית מיוצרת על פני השטח סרט, הסרט הזה יכול לשמש כאמצעי תקשורת להעברת קרן לייזר לתוך תבנית אופטית שונה 22,23. אם חומר סגסוגת החלבון יצא בפתרון אנזים, פרופיל השפלה של הסרטים יכול להיות מובן על ידי השוואת דפוסי עקיפה בזמן אמת מהסרטעם הדפוס המקורי (במקום קדימה ואחורה לשטיפה ובוחן את הסרטים מושפלים באוויר). טכניקה נוספת המתעוררות היא למעגלי מיקרו בקנה מידת מעיל שונה ותהודה אלחוטית בחומרי סגסוגת חלבון (איור 4 יישום חשמלי). באמצעות טכניקה זו, מיקרו זרמים של רקמות או איברים שנפגעו בגוף חי יכולים להיות במעקב, עם אותות אלחוטיים מועברים ישירות לרופאים 24,51. ויכולים להיות נשלטו על קשיחות החומר המכנית וbiodurability בגוף בקלות על ידי יחסי ערבוב ורכיבי חלבון ספציפיים של החומרים. לבסוף, תרופות לסרטן מסיס או לא מסיס שונות יכולות להיות משולבות ישירות לתוך חומרי סגסוגת חלבון (יישום 4 כימי איור). תרופות לסרטן הן לעתים קרובות מאוד רעילות, ותפגענה לא רק תאי הסרטן, אלא גם את מערכת החיסון האנושית הנורמלית. לכן, שליטה על האזור והמנה של משלוח סמים הסרטן ליום בגוף היא אחד tהוא נושאים החשובים ביותר במדע תרופות. באמצעות שילוב תרופות לסרטן לחומרי סגסוגת חלבון, אנחנו יכולים להשתיל את החומר רק לרקמות סרטן או לאיברים, ולשלוט בקצב השחרור של התרופה לסרטן ליום מרשת סגסוגת חלבון על ידי שליטה על מרכיבי החלבון וערבוב יחסים. מאז מטריצת החלבון הוא מתכלה לחלוטין, חומרי סגסוגת החלבון יוסרו באופן אוטומטי על ידי אנזימים בגוף לאחר תקופת הסמים שחרור. השאריות של חומרי סגסוגת חלבון הן אך ורק חומצות אמינו, אשר יכול להיספג על ידי הגוף באופן טבעי כדי לייצר עוד חלבונים חיוניים אחרים בגוף חי. חולים שלהירפא על ידי שחרור מבוקר של תרופות לסרטן מחומרי סגסוגת חלבון מושתלים יהיו סוף סוף התאוששו ללא תוספים בגוף, ושניהם מטריצות סגסוגת חלבון טבעי ותרופות לסרטן ייקלטו ביעילות בגוף במהלך תהליך ריפוי זה.

איור 4 צעדים כלליים כדי לייצר חומר סגסוגת חלבון, כולל ניקוי או לטיהור מקורות חומר חלבון, המסת חומרי חלבון מסיסים לפתרונות, dianalysizing להסיר את המסת הממס מתמיסה מימית חלבון, צנטריפוגה וערבוב יחד עם יחסים שונים, ו פיזיים או כימי טיפולי crosslinking. פתרון סגסוגת החלבון לאחר מכן יכול להיווצר למגוון רחב של חומרים ביולוגיים עם תכונות מתכונן, כוללים מטריצות חומר לתרמית, מכאני, אופטי, חשמלי, כימי, או יישומים ביו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.

כאן, הפגנו נהלים הקריטיים של איך להמציא חומרי חשמל על הגנה של מחזורבסגסוגות עם פרטים באיור 5. סרטים מתכתיים דקים כגון מעגלים חשמליים ניתן ליצור באמצעות מספר טכניקות שונות בתצהיר כוללים אידוי, בתצהיר לייזר פעם, או המקרטעת. המקרטעת נבחרה למחקר הנוכחי שכן הוא מציע גמישות משמעותית עבור האנרגיה של המין גמגם באמצעות ההתאמה של לחץ המקרטעת גז וחשמל פנה לקתודה, כמו גם האחידות בתצהיר באמצעות התאמה של לחץ הגז וגודל קתודה. גמגום בתצהיר יכול לשמש כדי להקרין סרט מתכתי על מצע זכוכית (איור 5 א). במקרה זה, סרטים במעגל Ag הופקדו בתא ואקום גבוה עם לחץ בסיס של כ 1 x 10 -7 Torr. הגז המקרטעת Ar הוצג לתא בלחץ של 20 mTorr וAg הופקד באמצעות גנרטור RF ב100 W עבור 20 דקות מקתודת magnetron מישוריים 2 אינץ שהיא 8 סנטימטר מפני שטח המצע. התקנים הם defאינו עומד לשימוש בטכניקות photolithographic נפוצות בסרטים על זכוכית ואחריו תחריט כימי רטוב (ראה נוהל מפורט באיור 5 א). יכולים גם להיות מוגדרים התקנים לפי תצהיר דרך מסכה פיזית ישירות על גבי סרטי החלבון. ההתנגדות החשמלית בטמפרטורת החדר של המעגלים חשמליים בסרטי החלבון נמדדה באמצעות שני טכניקות שני מסוף וארבעה מסוף. היתרון של גישת ארבעה מסוף הוא לחסל את התנגדות קשר מהמדידה אך אנו מוצאים כי התנגדות המגע היא לא משמעותית כל כך מדידת שני מסוף מספיק. שתי מדידות המסוף משתמשת מודד באיכות טובה להגדיר על הקשר בקנה מידה עשיית אוהם עם הסרט בשני קצותיו של חוט המתכת (באופן סכמטי שמוצגים באיור 5 ב). במדידה זו, מודד משמש הן כמקור זרם ומד מתח וההתנגדות הנמדדת הוא המתח מחולק בנוכחי. ההתנגדות מחושבת באמצעותρ = RA / ליטר, כאשר R הוא ההתנגדות, הוא שטח החתך של התיל וl הוא המרחק בין בדיקות. לנוצר כאן, R נמדד להיות 23.5 Ω באמצעות השיפוע של עקומת המתח הנוכחית באיור 5 ב (R = ΔVoltage / ΔCurrent), l הוא 4.45 x 10 -2 מ ', ונמצא כי 6.685 x 10 -10 מ '2. שימוש במספרים אלה, התנגדות של 3.6 x 10 -7 Ω · מ 'נמצאה לסרטים, כ 20x גדול יותר מזה לתפוצה רחבה מתכת כסף (· מ' 1.6 x 10 -8 Ω). התנגדות גבוהה יותר שנמדדה בסרטים בהשוואה לתפוצה רחבה היא טיפוסית בשל הנתיב הנוכחי כבר מוגבל וחוסר היכולת של נושאי מטען כדי למנוע פגמים. חימום המתכת עם אקדח חום מוגבר התנגדותה המצביע על עלייה בשיעור של פיזור אלקטרונים על ידי פונונים אופייניים להולכה מתכתית.

FO .5 () נוהל איור לעשות מעגלים חשמליים על סרטי סגסוגת חלבון (כאן מעגלי כסף על משי tussah פראי וסרטי משי תות תערובת כדוגמא): (א) שקופית מיקרוסקופ ללא ציפוי; פלזמה כסף במהלך גמגום בתצהיר מיעד קוטר 2 מטר (ב); שקופיות זכוכית כסף מצופה (ג); מדגם כסף מצופה שנערך לטווה באמצעות צ'אק הוואקום לפני הוספת photoresist (ד); שקופית כסף מצופה בphotoresist (ה) הוכנסה לתנור לרך אופה בחום של 120 ° C; (ו) לחשוף לקרינת UV כדי לשבור את איגרות חוב הפולימר בphotoresist; (ז) לפתח photoresist; (H) קשיח לאפות להתנגד להתכונן לתחריט בחומצה; (I) Etch בחומצה, ואז להפסיק לחרוט על ידי שטיפה באמבט מים; (י) ייבש את השקופית; פתרון סגסוגת חלבון יצוק לשקופית (k); (יב) תבניות העברת כסף לסרט החלבון המיובש. (B) -7 Ω · מ ', כ 20x גדול יותר מזה לתפוצה רחבה מתכת כסף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
.6 מודל ניתוח תרמי איור משמש לאימות miscibility של מערכת חלבון מעורבב. אם החלבון וB יש לי טמפרטורות אדם יחידה מעבר זכוכית, גרם T (A) וגרם T (B), בהתאמה (עקומות ירוק וכחול), בליל באופן מלא מערכת סגסוגת חלבון תציג רק אחד זכוכית מעבר שונה משל g T של A ו B (עקומה אדומה). אחרת, החלבוןים הם תערובות immiscible עם שני g T (A) וגרם T (B) (עקומה שחורה), או חומרים מרוכבים למחצה בליל עם שתי נעו מעברי זכוכית (עקומה כתומה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אחד מההליכים הקריטיים ביותר בייצור מערכת "סגסוגת" חלבון הוא לוודא miscibility של החלבונים מעורבבים. אחרת, זה מערכת רק immiscible תערובת חלבונים או חלבון מרוכב ללא נכסים יציבים ומתכוננים. שיטת ניתוח תרמית ניסיוני יכולה לשמש למטרה זו וכדי לאשר תכונות הסגסוגת שבם. ניתן לצפות באינטראקציות בין חלבונים על פי המודל של פלורי-האגינס סריג 48 כאינטראקציות בין (מרכיב החלבון העיקרי) "ממס" ו" המומס "(מרכיב חלבון הקטין). על פי מודל זה, השינוי באנרגיה החופשי במהלך ערבוב בין "הממס" ו" מומס "מסדיר את miscibility של התערובת 48. באופן כללי, יש שלוש דרגות שונות של miscibility: (א) (חומר צורה חד שלב macroscopically) בליל במלואו, (ב) (שלבי צורה חצי בליל בחומר) metastable, ו(ג) immiscible (יישאר שני שלבים מקוריים עם חלבון בודד וB תחומים) 3,48. במקביל, התנהגויות מעבר זכוכית של מערכת שני חלבונים יכולים להדגים הבדלים אלה ואופן אידיאלי יכולות לבוא לידי ביטוי תוך שימוש במודל תרשים שלב (איור 6). לדוגמא, אם החלבון וB יש לי הטמפרטורות אדם אחד מעבר זכוכית, גרם T (A) וגרם T (B), בהתאמה (הירוקה 6 איור ועקומות כחולות), מערכת סגסוגת חלבון בליל באופן מלא צריכה להראות רק זכוכית מעבר אחד במהלך החימום. מעבר זכוכית יחיד זה הוא בדרך כלל ביניים בין T g של של A ו B (איור 6). אחרת, החלבונים יכולים ליצור תערובת immiscible לפי שני g T () ו g T (B) יופיע בעמדות המקוריות שלהם (איור 6). החלבונים יכולים גם ליצור מערכת חצי בליל שצוינה על ידי שתי עבר tran זכוכיתsitions (איור 6). ניתן למצוא דוגמא מעשית של חלבון מערכת בליל באופן מלא "סגסוגת" (אחד זכוכית מעבר צורה) בסריקות DSC של דגימות תערובת משי tropoelastin באיור 4 (יישום תרמי) 9. עם הירידה של תוכן משי, טמפרטורות מעבר זכוכית (ז T) של התערובות גדלו בהדרגה מ178 ° C (משי טהור) 190 ° C (tropoelastin הטהור) 9, עדיין באופן עקבי לשמור על מעבר זכוכית אחת אחיד לכל הסוג של תערובות. על פי המודל של פלורי-האגינס, זה מצביע על כך שכל תערובות משי tropoelastin של יחסי ערבוב שונים הן יציבים ונמצאות באופן מלא סגסוגות חלבון בליל ללא כל הפרדות macrophase.

לסיכום, דורות חדשים של חומרי סגסוגת חלבון יכולים להיות מיוצרים ומפוברקים להתקנים שונים רפואיים (כגון, סרטים, תפרים, ברגים, צלחות, מיקרו מחטים, ג'לים), עם מבוקר וטונהble אופטי, חשמלי, כימי, תרמית, ותכונות מכאניות. באמצעות שליטה על רכיבי ערבוב ויחסים, תכונות שונות biophysical של חומרי סגסוגת חלבון, כמו גמישות, כוח, חספוס פני השטח, תשלום פני השטח, biodurability ופעילות כימית, ניתן להשפיע, שסופו של דבר יכול להשפיע על תפקודי הרקמה כמו גם סלולארי המקומי התנהגויות הקשורות לחומרים אלה. בנוסף, בשל האופי של החיים הניתנים לתכנות של החלבונים, in vivo הופך פלטפורמה מעשית לחומרי סגסוגת אלה. יתרונות כאלה יכולים לספק אפשרויות חדשות למכשירים רפואיים מושתלים בעתיד שבו ניתן להימנע מיחזרו כירורגית הודעה תיקון. חומרים ביולוגי סגסוגת חלבון אלה גם היו מציעים מסלול חדש לייצור מכשירים רפואיים עם פונקציות ביולוגיות מתכונן ומאפיינים, ועם היענות רקמה וצרכי ​​נלווים תואם. מאמר זה מספק סקירת פרוטוקול כללית לכיצד לפברק התקנים אלה וירוויח שני המדענים ורופאים קליניים בתחומים ביו מרובים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מודים אוניברסיטת רואן לתמיכה של מחקר זה. XH גם בזכות ד"ר דוד ל 'קפלן באוניברסיטת טאפטס ורקמות NIH P41 הנדסת מרכז משאבים (TERC) לאימונים טכניים קודמים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC) TA Instruments, New Castle, DE, USA
 N/A You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System  T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA N/A With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven VWR International, Bridgeport, NJ, USA N/A You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rosenbloom, J., et al. Extracellular matrix 4: The elastic fiber. FASEB J. 7, 1208-1218 (1993).
  2. Traub, W., et al. On the molecular structure of collagen. Nature. 221, 914-917 (1969).
  3. Hu, X., et al. Protein-Based Composite Materials. Materials Today. 15, 208-215 (2012).
  4. Hardy, J. G., Scheibel, T. R. Composite materials based on silk proteins. Progress in Polymer Science. 35, 1093-1115 (2010).
  5. Kidoaki, S., et al. Mesoscopic spatial designs of nano- and microfiber meshes for tissue-engineering matrix and scaffold based on newly devised multilayering and mixing electrospinning techniques. Biomaterials. 26, 37-46 (2005).
  6. Teng, W. B., et al. Recombinant silk-elastin like protein polymer displays elasticity comparable to elastin. Biomacromolecules. 10, 3028-3036 (2009).
  7. Foo, C. W. P., Kaplan, D. L. Genetic engineering of fibrous proteins, spider dragline, silk and collagen. Adv Drug Delivery Rev. 54, 1131-1143 (2002).
  8. Hu, X., et al. Charge-Tunable Autoclaved Silk-Tropoelastin Protein Alloys That Control Neuron Cell Responses. Adv. Funct. Mater. 23, 3875-3884 (2013).
  9. Hu, X., et al. Biomaterials derived from silk-tropoelastin protein systems. Biomaterials. 31, 8121-8131 (2010).
  10. Hu, X., et al. The influence of elasticity and surface roughness on myogenic and osteogenic-differentiation of cells on silk-elastin biomaterials. Biomaterials. 32, 8979-8989 (2011).
  11. Hu, X., et al. Biomaterials from ultrasonication-induced silk fibroin-hyaluronic acid hydrogels. Biomacromolecules. 11, 3178-3188 (2010).
  12. Gil, E. S., et al. Swelling behavior and morphological evolution of mixed gelatin/silk fibroin hydrogels. Biomacromolecules. 6, 3079-3087 (2005).
  13. Lu, Q., et al. Green process to prepare silk fibroin/gelatin biomaterial scaffolds. Macromol. Biosci. 10, 289-298 (2010).
  14. Lu, S., et al. Insoluble and flexible silk films containing glycerol. Biomacromolecules. 11, 143-150 (2010).
  15. Mandal, B. B., et al. Silk fibroin/polyacrylamide semi-interpenetrating network hydrogels for controlled drug release. Biomaterials. 30, 2826-2836 (2009).
  16. Yeo, I. S., et al. Collagen-based biomimetic nanofibrous scaffolds, preparation and characterization of collagen/silk fibroin bicomponent nanofibrous structures. Biomacromolecules. 9, 1106-1116 (2008).
  17. Holst, J., et al. Substrate elasticity provides mechanical signals for the expansion of hemopoietic stem and progenitor cells. Nat. Biotechnol. 28, 1123-1128 (2010).
  18. Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New Opportunities for an Ancient Material. Science. 329, 528-531 (2010).
  19. Qin, G., et al. Mechanism of resilin elasticity. Nature Communications. 3, 1003 (2012).
  20. Rockwood, D. N., et al. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat. Protocols. 6, 1612-1631 (2011).
  21. Wise, S. G., et al. Engineered tropoelastin and elastin-based biomaterials. Adv Protein Chem Struct Biol. 78, 1-24 (2009).
  22. Amsden, J. J., et al. Rapid nanoimprinting of silk fibroin films for biophotonic applications. Adv. Mater. 22, 1746-1749 (2010).
  23. Lawrence, B. D., et al. Silk film biomaterials for cornea tissue engineering. Biomaterials. 30, 1299-1308 (2009).
  24. Kim, D. H., et al. Dissolvable films of silk fibroin for ultrathin conformal bio-integrated electronics. Nat. Mater. 9, 511-517 (2010).
  25. Zhang, J., et al. Stabilization of vaccines and antibiotics in silk and eliminating the cold chain. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 11981-11986 (2012).
  26. Pritchard, E. M., et al. Effect of silk protein processing on drug delivery from silk films. Macromolecular Bioscience. 13, 311-320 (2013).
  27. Lammel, A. S., et al. Controlling silk fibroin particle features for drug delivery. Biomaterials. 31, 4583-4591 (2010).
  28. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101, 11007-11028 (1997).
  29. Shao, Z., Vollrath, F. Materials: Surprising strength of silkworm silk. Nature. 418, 741-741 (2002).
  30. Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424, 1057-1061 (2003).
  31. Hu, X., et al. Determining Beta-Sheet Crystallinity in Fibrous Proteins by Thermal Analysis and Infrared Spectroscopy. Macromolecules. 39, 6161-6170 (2006).
  32. Hu, X., et al. Dynamic Protein-Water Relationships during β-Sheet Formation. Macromolecules. 41, 3939-3948 (2008).
  33. Hu, X., et al. Microphase separation controlled beta-sheet crystallization kinetics in fibrous proteins. Macromolecules. 42, 2079-2087 (2009).
  34. Cebe, P., et al. Beating the Heat - Fast Scanning Melts Beta Sheet Crystals. Scientific Reports. 3, 1130 (2013).
  35. Pyda, M., et al. Heat Capacity of Silk Fibroin Based on the Vibrational Motion of Poly(amino acid)s in the Presence and Absence of Water. Macromolecules. 41, 4786-4793 (2008).
  36. Buxton, G. A., et al. A lattice spring model of heterogeneous materials with plasticity. Model. Simul. Mater. Sci. Eng. 9, 485-497 (2001).
  37. Buxton, G. A., Balazs, A. C. Modeling the dynamic fracture of polymer blends processed under shear. Phys. Rev. B. 69, 054101 (2004).
  38. Kolmakov, G. V., et al. Harnessing labile bonds between nanogel particles to create self-healing materials. ACS Nano. 3, 885-892 (2009).
  39. Duki, S. F., et al. Modeling the nanoscratching of self-healing materials. J. Chem. Phys. 134, 084901 (2011).
  40. Bell, G. I. Models for the specific adhesion of cells to cells. Science. 200, 618-627 (1978).
  41. Bell, G. I., et al. Cell adhesion. Competition between nonspecific repulsion and specific bonding. Biophys. J. 45, 1051-1064 (1984).
  42. Wang, Q., et al. Effect of various dissolution systems on the molecular weight of regenerated silk fibroin. Biomacromolecules. 14, 285-289 (2013).
  43. Wray, L. S., et al. Effect of processing on silk-based biomaterials: reproducibility and biocompatibility. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 99, 89-101 (2011).
  44. Lawrence, B. D., et al. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646 (2012).
  45. Hu, X., et al. Regulation of Silk Material Structure by Temperature-Controlled Water Vapor Annealing. Biomacromolecules. 12, 1686-1696 (2011).
  46. Yucel, T., et al. Vortex-induced injectable silk fibroin hydrogels. Biophys J. 97, 2044-2050 (2009).
  47. Yucel, T., et al. Non-equilibrium silk fibroin adhesives. J Struct Biol. 170, 406-412 (2010).
  48. Flory, P. J. Principles of polymer chemistry. , Cornell University Press. Ithaca, N.Y.. (1953).
  49. Chen, H., et al. Thermal properties and phase transitions in blends of Nylon-6 with silk fibroin. J Therm Anal Calorim. 93, 201-206 (2008).
  50. Scabarozi, T. H., et al. Epitaxial growth and electrical-transport properties of Ti7Si2C5 thin films synthesized by reactive sputter deposition. Scripta Materialia. 65, 811-814 (2011).
  51. Tao, H., et al. Silk materials-a road to sustainable high technology. Adv Mater. 24, 2824-2837 (2012).
  52. Annabi, N., et al. Cross-linked open-pore elastic hydrogels based on tropoelastin, elastin and high pressure CO2. Biomaterials. 31, 1655-1665 (2010).
  53. Moll, R., et al. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol. 129, 705-733 (2008).

Tags

תערובות הנדסה ביוטכנולוגיה גיליון 90 סגסוגות חלבון חומרים ביולוגיים ביו משי סימולציה חישובית מכשירים אלקטרוניים מושתלים
עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hu, X., Duki, S., Forys, J.,… More

Hu, X., Duki, S., Forys, J., Hettinger, J., Buchicchio, J., Dobbins, T., Yang, C. Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (90), e50891, doi:10.3791/50891 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter