Проектирование Silk-протеинов шелка и сплавы для биомедицинских применений

Summary

Смешивание является эффективным подходом к генерации биоматериалы с широким диапазоном свойств и комбинированных функций. По прогнозирования молекулярных взаимодействий между различными естественно протеинами шелка, новые шелк-шелк сплава белок платформы с перестраиваемой механической упругостью, электрического ответа, оптической прозрачности, химической технологичности, способности к биологическому разложению, или термической стабильности могут быть разработаны.

Abstract

Волокнистые белки отображения различных последовательностей и структур, которые были использованы для различных применений в биомедицинских областях, таких как биосенсоры, наномедицины, регенерации тканей и доставки лекарств. Проектирование материалов на основе молекулярного масштаба взаимодействий между этими белками поможет генерировать новые многофункциональные сплава белок биоматериалов с перестраиваемой свойств. Такие сплава системы также обеспечивают преимущества по сравнению с традиционными синтетическими полимерами в результате к биологическому разложению материалов, биосовместимости и tenability в организме. Эта статья используется белковые смеси дикого Tussah шелка (Antheraea pernyi) и внутреннего шелка шелковицы (Bombyx Mori) в качестве примера, чтобы обеспечить полезные протоколы по этим темам, в том числе, как предсказать белок-белковых взаимодействий расчетными методами, как производят сплав белка решения, как проверить сплава системы с помощью термического анализа, и как изготовить переменных материалы сплавав том числе оптических материалов с дифракционных решеток, электрических материалов с цепей покрытий и фармацевтических материалов для выпуска и распространения лекарственных средств. Эти методы могут дать важную информацию для разработки многофункциональных биоматериалов нового поколения на основе различных белковых сплавов.

Introduction

Природа создала стратегии для генерации перестраиваемых и многофункциональные биологические матрицы, используя ограниченное количество структурных белков. Например, эластины и коллагены всегда используются вместе в естественных условиях, чтобы обеспечить регулируемые сильные и функции, необходимые для конкретных тканей ^1,2. Ключ к этой стратегии является смешивание. Смешивание включает смешивание белков с определенных соотношениях и является технологический подход для создания простых систем материалов с перестраиваемой и разнообразных свойств ^3-5. По сравнению с синтетическими инженерных стратегий ^6,7, смешивание может также улучшить материальную однородность и способность обрабатывать материал благодаря легкости работы ^8-16. Поэтому проектирование многофункциональных биосовместимых сплавов белок материалы является новой областью медицинских исследований. Эта технология также будет предоставлять систематические знания о влиянии природных белковых матриц на клеток и тканей функций как в витро и в естественных условиях ^10,17. Оптимизируя молекулярные взаимодействия между различными белками, на основе белка сплавы могут охватывать широкий спектр физических функций, таких как термическая стабильность при разных температурах, эластичность, чтобы поддержать различные ткани, электрический чувствительность в переменных органов и оптических свойств для регенерации роговицы ткани ^{3, 18-27.} В результате этих исследований даст новый белок-материалы платформу в области биомедицинской науки и имеет непосредственное отношение к перестраиваемых ремонта тканей и лечения заболеваний и привести к дальнейшему биоразлагаемых имплантатов устройств, где их новые терапевтические и диагностические признаки можно предусмотренных ^3.

Многие природные структурные белки имеют критические физические и биоактивными свойствами, которые могут быть использованы в качестве кандидатов на биоматериала матриц. Шелка из разных видов червей, Кератины от волосков и шерсти, эластины и коллагенов разных тканей, иразличные растительные белки являются одними из наиболее распространенных структурных белков, используемых для проектирования переменных материалы на основе белков (Рисунок 1) ^18-27. В общем, эти белки могут образовывать различные молекулярные вторичные структуры (например, бета-листы для шелка или спиральный катушки для кератинами) благодаря своим уникальным повторяющихся последовательностей первичной аминокислотной ^3,28-35. Эти особенности способствуют формированию самоорганизующихся макроскопических структур с уникальными функциями в биологических интерфейсов, побудивших их полезность в качестве заветной ресурса биополимеров материалов. Здесь были использованы два типа структурных белков (белок от диких Tussah шелка и белка В от домашних шелка шелковицы в качестве примера), чтобы продемонстрировать общие протоколы производстве различных сплавов белок биоматериалов. Протоколы продемонстрировали включают часть 1: прогнозы взаимодействия белка и моделирования, часть 2: производство сплавов белок решений и участие 3: изготовление сплава белкасистемы и для оптических, электрических и фармацевтической промышленности.

Рисунок 1 Сырье различных структурных белков, которые обычно используются в нашей лаборатории для разработки на основе белков материалы, в том числе шелка из разных видов червей, Кератины от волосков и шерсти, эластины из разных тканей и различных растительных белков.

Protocol

1 Прогнозирование белковых взаимодействий

1. Bioinfomatics анализа белковых молекул
   1. Посетите Национальный центр биотехнологической информации сайта (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), и поиск названия белков, которые будут использоваться для изучения сплава. Примечание: В данном примере были использованы два белка: белок А, который является дикая Tussah фиброин шелка и белка В, который является внутренний шелковицы фиброин. Для белка А, аминокислотные последовательности можно найти в "фиброина [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi является китайцев (дуб) Tussah Moth). Для белка В, аминокислотные последовательности можно найти в "фиброин тяжелой цепи предшественника [Bombyx мори] NCBI эталонной последовательности: NP_001106733.1" и "фиброин легкой цепи предшественника [Bombyx мори] NCBI эталонной последовательности: NP_001037488.1" вместе (Bombyx Мори одомашненные шелкопряда из тутового дерева).
   2. Выберите и саВ.Е. аминокислотные последовательности белка А и белка В из базы данных.
   3. Посетите веб-сайт ExPASy (SIB Биоинформатика ресурсов Portal) (www.expasy.org) или использовать другое коммерческое программное обеспечение для расчета основных bioinfomatics данные белков на основе их последовательностей в том числе, но не ограничиваясь, полного заряда на молекулу, гидрофобность индекс молекула, кривая титрования молекул при различных значениях рН, и т.д. Эта информация будет использоваться в качестве базовых элементов для вычислительного моделирования белковых взаимодействий, и поможет понять, является ли эти два белка имеют сильные взаимодействия. [Примечание: Этот шаг не для точного предсказания каждую деталь взаимодействия белка, как те, которые используются в небольших пептидов или функциональных белков науки. Цель этого раздела только избежать получения белка смесь с очевидными макрофаза разделений, которые не могут быть названы "сплав" материал. Поэтому оценка может быть приблизительны но гое сплава белок система может быть проверена путем экспериментального метода, описанного в пункте 3.1 с помощью точного термического анализа].
2. Компьютерное моделирование белка системы Alloy
   Ниже описана процедура для имитации сплава системы белок. Программа моделирования написана на языке программирования C, который может использоваться на одной или многопроцессорной компьютерной системы. Решетка-весна-масса (LSM) модель была использована для имитации сплава-белки ^36-39. LSM модель дает простое описание результирующей силы на массу при подключении к источнику, и можно решить уравнение силы, чтобы понять движение для каждой массы. Простой алгоритм программы для моделирования этого сплава белок систему с использованием модели LSM задается следующим образом:
   1. Представляют собой единый белок как крупнозернистого частицы, которая имеет массу м.
   2. Используйте Hookean или нео-Hookean весну, чтобы обозначать связь ^38,39. По взаимосвязанных конечное число частиц с пружинами, одна банка маке домен суб-сплава, который представляет стабильный строительный блок сплава-белков. Для представления различных типов связей в внутрисетевого связи, использовать различные жесткости пружины / жесткость.
   3. Модель системы сплава белок в качестве материала, состоящего из тускло-сшитых суб-сплавов. Опять здесь различные жесткости использовались для представления различных связей между взаимосвязей в суб-сплавов.
   4. Смоделируйте разрыв связи и процесс реформирования на Bell Model ^40,41, через которые слабые связи позволено будет реформирована, но прочные связи не может реформировать, как только они разбиты. Когда система достаточно подчеркнул (как на внутри-suballoy и между suballoy облигаций), облигации могут быть разбиты и реформировать.
   5. С целью изучения эффектов деформации на сплава-белков, когда они подчеркнуто, применяются внешние силы к системе. Распределить эти силы в равной степени к каждой частицы при решении уравнения силы (законы Ньютона).
   6. Для моделирования взаимодействиймежду раствором (например, молекул воды) и белков, применять дополнительную силу сопротивления или силы трения в каждой частице.
   7. Решить уравнение силы для каждой частицы с действиями каждой силы (сила пружины от облигации, внешней силы, и силы трения).
   8. Рассчитать и извлечь позиции белковых частиц в виде функции времени.
   9. Рассчитать физические величины, характеризующие сплава-белки от положения частиц.
   10. Изменение жесткости облигаций в программе, чтобы понять взаимодействие между различными белками. (Средняя жесткость облигаций рассчитывается от модуля Юнга белковых материалов. Модуль Юнга различных волокнистых белковых материалов могут быть получены либо путем Всеобщей испытание на растяжение ^18, или непосредственно из предыдущих литератур ^2-4,18).

2 Производство белковых сплава Solutions

Дикий шелк Tussah (белок А) и внутренний шелковицы (белок В) выбраны в качестве примера системы сплава белка. Этот протокол первого представляет, как получить дикий Tussah шелк (белок) решение.

1. Вырезать сырые диких Tussah шелковые коконы или волокна при весе 3 г.
2. Мера 3 г бутилдикарбоната натрия или карбонат натрия (Примечание: При использовании карбоната натрия, молекулярная масса белковых цепей приведет к снижению в процессе кипения ^42).
3. Заполните 2 л стеклянный стакан с дистиллированной водой (H ₂ O). Тогда, стакан поместить на горячей стадии, покрыть ее с алюминиевой фольгой, и тепла до кипения.
4. Снимите крышку из алюминиевой фольги и добавить измеренное дикарбонат натрия медленно в кипящую воду, что позволяет ему полностью раствориться. (Примечание: Роль дикарбоната натрия является "мыло" счистить растворимые белки серицин и других примесей, прикрепленные на поверхности диких волокон шелка При использовании противном.э природа белковые волокна, выберите соответствующие химические вещества в соответствии с литературой).
5. Добавить сырые белковые волокна (дикие шелковые волокна) в кипящую воду и дать закипеть на 2-3 часа (Примечание:. Время кипения имеет решающее воздействие на молекулярной массы белковых цепей ^26,43 Нужно выбрать подходящее время в соответствии в литературе, или путем выполнения контрольных экспериментах ^26,43. температура кипения также может быть отрегулирована, чтобы воздействовать на молекулярную массу белковых цепей ^26,43,44).
6. После кипячения осторожно снимите белковые волокна с помощью шпателя из раствора и сжать их, чтобы удалить лишнюю воду. (ВНИМАНИЕ: Волокна очень горячие!)
7. После этого, опустите волокна в 2 л стакан с холодной дистиллированной воды, и мыть волокон в два раза в течение 30 мин каждый, чтобы полностью удалить нечистые остатки с поверхности волокна. Высушите волокна в вытяжном шкафу в течение не менее 12 часов.
8. Растопить 45,784 г нит кальцияСкорость (Са (NO _{3) 2)} в стеклянном стакане с образованием жидкости при 65 ° С для растворения дикого шелка белковых волокон. (Примечание: При использовании других природных белковых волокон, выберите соответствующий растворитель для растворения белков Здесь вы также можете использовать 9,3 М LiSCN или LiBr решение, или 85% раствор фосфата для растворения различных шелковых волокон..)
9. Объединение волокон и растворитель в соотношении 1 г волокна в 10 мл растворителя. Разрешить волокна, чтобы растворить при 95 ° С в течение от 5 до 12 часов. (Примечание: Время растворения зависит от молекулярной массы белков ^26,43-45)
10. Использование шприцы, инъекционные дикого шелка раствора в 12 мл диализа кассеты (не более 1000 МВт как размер среза) или запечатанные диализа шланги (максимум 1000 МВт, как размер среза) и диализ против 2 л дистиллированной воды. (Примечание: впрыска является более эффективным, если поддерживать раствор при 35 ° С, в противном случае вязкость раствора белка резко возрастет при комнатной температуре). Измените дистиллированную воду часто, чтобы удалить Ca (NO _{3) 2} растворители в растворе (через 30 мин, 2 ч, 6 ч, а затем каждые 12 ч в течение 3 дней. В общей сложности, будет примерно 8 подмены воды).
11. После 3-х дней, собирают белковые растворы из диализной кассеты или трубки и поместить в 13000 оборотов в минуту рейтингу труб.
12. Центрифуга решения течение 1 ч при 3500 оборотах в минуту при температуре 4 ° С в 3 раза для удаления отложений. После каждого центрифуге, быстро вытащить супернатант в новые пробирки. Храните окончательные решения в 4 ° C холодильнике.
13. Налейте 5 мл раствора белка на полидиметилсилоксана (PDMS) подложки или другой плоской гидрофобной подложке и позволяют ему полностью высохнуть (это, как правило, занимает более 12 ч). Взвесить оставшееся твердое вещество пленки белка и рассчитать конечную концентрацию раствора посредством массовых процентах (% вес / об) = измеренный вес (в мг) ÷ 5 (в мл) ÷ 10.
14. Соберите другой выбранный природного белка волокна (в этом CASе, домашние шелковицы был использован в качестве белка В), и повторить процедуру с соответствующим "мыла" и растворением растворителем, пока конечный раствор белка воды с измеренной концентрацией не будет получено. [Примечание: Если белковые материалы в виде порошка, используют соответствующие пористые трубки или мембраны для хранения образцов в течение процесса "намыливал". Если белок уже был очищен, непосредственно перейти к шагу 2,8 до растворения порошка. Если белок уже очищены и растворяется в воде, сделать его водного раствора с нужной концентрации, а затем перейдите к шагу 2,15 ниже, чтобы сделать смесь белковых растворов.]
15. Медленно разбавленной белка решение (здесь дикого шелка раствор) в дистиллированной воде при 4 ° С с образованием 1,0 мас% белка водного раствора. Сделайте то же процесс Protein B (здесь одомашнены шелка).
16. Медленно смешать 1 мас% белка решение с Белки B растворе при 4 ° С с помощью пипетки, чтобы избежать рrotein агрегации во время смешивания. (Примечание 1: Не используйте вихревую инструмент смешивать белки, так как некоторые белки (например, шелка) образует гидрогели при вибрации ^46,47 Примечание 2:. Если возможно, используйте дополнительные устройства для контроля скорости перемешивания и смешивания размер решений Обязательно смешивать их как можно медленнее, чтобы избежать агрегации. Не быстро пипетки решение во время смешивания).
17. Конечные растворы смешивания должен иметь указанную соотношение массы или молярное отношение белка А: Белки B. Как правило, смешивают их с массовым соотношением 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90, чтобы получить Широкий спектр сплава решений. Использование чистого белка А и белка В решения в качестве контроля. Для смешивания раствора с молярным соотношением белка А: Белок B = R: (100-R). Рассчитать отношение объема смешивания (на основе одной и той же 1 мас% раствора) на: Том А: Volume B = R · (MW а): (100-R) · (МВт B).
18. Сразу бросил окончательные решения на PDMS субстратов с образованием пленок или другой ДезиGNED материалы. (Примечание: Не храните высокой концентрации сплава белок решения в течение длительного времени Другие агрегаты могут образовывать позже в связи с белок-белковых взаимодействий в воде.). При необходимости, разбавить смесь решения с свободными ионами дистиллированной водой и держать их в 4 ° C холодильник, чтобы избежать дополнительной агрегации белков в растворах.

3 Изготовление Переменная белковых сплавы

1. Подтвердите Alloy предсказание термического анализа ^3,9,31-35
   1. Подготовьте PDMS субстраты и очистить их путем замачивания в дистиллированной воде.
   2. В ролях белка наложения решения с разных пропорциях на PDMS субстратов.
   3. Высушите решения, по крайней мере 12 часов в химической капот с потоком воздуха до пленки не образуются (Примечание: Используйте тот же объем для различных решений таким образом, чтобы толщина пленки может быть исправлено).
   4. Снимите сплава белок фильмы из PDMS субстратов и разместить их на чистой посуды.
   5. Взвесьте много Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) алюминиевые кастрюли и крышки для изучения DSC. Подходим кастрюли и крышки пар иметь равные общий вес (вес кастрюле плюс вес крышки составляет постоянный вес). Например, был использован здесь, общий вес крышкой и панорамирование 22,50 мг, и восемь наборов крышки и поддона комбинации с этой общей массы были подготовлены.
   6. Инкапсулируйте 6 мг каждый тип высушенного белка вписывается в алюминиевых ДСК кастрюли и запечатать их с их соответствующих крышек в процессе 3.1.5. Печать пустой поддон и крышка пару, которые будут использоваться с образцом в качестве эталона, так что только теплоемкость образцов сами будут записаны во время термического анализа (Примечание: DSC будет сравнить теплоемкость эталонного кастрюлю с крышкой против, что образца + кастрюлю с крышкой. Благодаря равными весами, емкость фон тепло от кастрюль и крышек, будут учитываться оставив только теплоемкость образца в кастрюле).
   7. Положите запечатанные ссылки и примеры кастрюли в ДСК, спродувают сухим азотом газового потока 50 мл / мин, и снабжен холодильной системы охлаждения. Перед началом измерений образцов, DSC инструмент первый должен быть откалиброван с сапфиром и индия для теплового потока и температуры, соответственно.
   8. Предварительно запустить ДСК при скорости нагрева 2 К / мин до 150 ° С, а затем выдержка при этой температуре в течение 15 мин для удаления оставшихся молекул воды в образцах (обычно около 3-10% от общего веса). Быстро охладить (10 К / мин) до 25 ° С.
   9. Запуск DSC снова при скорости нагрева 2 К / мин до 300 ° C, или до тех пор, пик деградации белковых смесей не появятся ^34. Запишите теплоемкости образца белка при различных температурах во время этого процесса. Охладите DSC и изменить старый образец нового образца с различным соотношением смешивания.
   10. Рассчитать и построить зависимости теплоемкости температура для каждого белка смеси образца с использованием программного обеспечения DSC ^31-35.
   11. Судить о мiscibility белковых смесей следующим способом (смотри рисунок 4 Термическая и фиг.5), и если эти два белка являются полностью смешивается, они могут быть названы "белок" сплавов. В противном случае термин "белок композит" будет подходящее название соответствии с полимерными описательных теорий ^48,49):
       1. Отдельные белки А и В должны иметь индивидуальную одного температуру стеклования, Т _г (А) и T _г (В) (см зеленого и синего кривые на рисунке 5) ^3,48;
       2. Это одна температура стеклования обычно промежуточными между двумя отдельными компонентами белка, T _G (A) и T _г (В) (рисунок 5) ^3,48;
       3. Разделение смешивается фаза смесей получается, если оба Т _г (А) и Т _г (B) появился на исходные позиции (рисунок 5), и с каждым Т _г шагомВысота в пропорции к композиции, две белки полностью не смешивается ^3,48.
       4. Полу-смешивается составного типа смесь будет иметь один очень широкий стеклянный переход, или, возможно, еще два стеклянных переходов, но каждый мигрировала ближе друг к другу относительно чистых белковых компонентов, T _G (A) и T _G (B) ( рисунок 5). В этом случае, может быть микро-гетерогенной фазе структуры, образованные между двумя белковых компонентов, и состав может изменяться от места к месту.
   12. Если (3.1.11.1) в случае показано в ДСК, и это может быть подтверждено, что белок АВ системы сплава, а затем перейти к изготовить белковые сплавы.
2. Изготовление оптических материалов на белковых сплавов
   1. Продукция (в изготовления лаборатории) или приобрести разработанный топографическую поверхность для литья. В этом конкретном примере, был использован стакан с четырьмя дифракционных картин (фиг.4Оптический).
   2. Поместите стакан с дифракционных в блюдо, и убедитесь, что с рисунком поверхности сталкивается вверх.
   3. Спрэд решение PDMS равномерно на поверхности стекла, и полностью покрыть образцы поверхности (Решение PDMS производится заливки и раствора катализатора в соотношении 9: 1 соотношении в соответствии с инструкцией пользователя ^23,44).
   4. Поместите литейной блюдо в 65 ° C сушильном шкафу в течение по крайней мере 2 ч, а на плоской поверхности. Решение ПДМС следует высушить в твердую подложку во время этого процесса.
   5. Удалить PDMS подложку из стекла. Дифракционные теперь должны быть переданы на поверхность PDMS.
   6. Выбивать формы PDMS с дифракционных использованием подходящего дырокол.
   7. Бросьте сплава белок решения на PDMS поверхностей с дифракционных и высушить их, по крайней мере 12 часов, чтобы получить пленки с дифракционных.
   8. Для получения нерастворимых сплава белок материалы, разместить весь набор дру пленки, в том числе форм PDMS в 60 ° C в вакуумной печи (25 кПа) с водой блюдо на дне камеры. Откачать воздух в духовке, и пусть водяных паров образцы отжига в течение не менее 2 часов. (Этот процесс называется регулируемой температурой отжига паров воды ^45. По сравнению с широко используемым методом метанола, он может генерировать подобное содержание бета-листа в шелковых материалов ^45). Отпустите вакуум и шелушиться нерастворимый в воде пленку с PDMS подложки с помощью щипцов. Для этого примера, используются дикие шелковые-ый шелковые сплавы.
   9. Проверьте качество дифракционных о фильмах, сравнивая их с оригинальными узорами на стекле (например, собирать SEM изображения для микромасштабных деталей; собирать образцы лазерной дифракции для общего качества картины).
3. Изготовление электрических цепей на белковых сплавах материалов
   1. Для изготовления электрического шаблон цепи на стеклянной подложке, первый КлиоNA предметное стекло с помощью некоторых обезжиривание растворителе, таком как Alconox в ультразвуковом очистителе в течение 5 мин, затем 5 мин в ацетоне, а затем 5 мин в метаноле. Метанол используется в прошлом, так как он испаряется медленнее, чем ацетон таким образом, может быть сдувается подложки, а не сушки и оставляя остатков.
   2. Удар стекло насухо сухой газообразный азот, который образуется на отпарного от 180 л жидкого азота Дьюара.
   3. Введение материалов подложки в камеру осаждения. (Эти руководящие принципы предназначены для распыления системы, но другие методы осаждения могут быть использованы.) Если камера разработана с loadlock, вакуум в камере осаждения не оказали существенного влияния. Эвакуировать из loadlock до давления 30 мторр.
   4. Откройте задвижку между loadlock и основной камере осаждения и ввести подложку в камеру.
   5. Включите газ Ar и регулятором давления и регулировать давление до желаемого depositioн давление. Более высокие давления дают более низкие энергетические распыленных атомов металла и более однородные пленки, а более низкое давление доходность лучше придерживаться быстрее пленках. Диапазон давлений составляет обычно от 3 до 60 мТорр мТорр, с 20 мТорр работает хорошо.
   6. Металлы затем проецируется на затвором, который защищает основание от покрытия с использованием радиочастотной мощности 100 Вт тюнинг схема требуется направить ВЧ мощности на металлической мишени. Питания постоянного тока может быть использован вместо РФ на металлических мишеней. Для того чтобы удалить слои оксида и загрязнений из мишени, предварительно распыления в течение нескольких минут.
   7. Открыть затвор и распыления металла на подложку. Скорость осаждения для конфигурации, описанной около 10 нм в минуту. Эта ставка будет зависеть от рабочего расстояния, давления, силы магнита в магнетронного катода, толщины мишени и металла распыленных. Отрегулируйте время осаждения для достижения нужной толщины.
   8. Снимите с покрытием предметное стекло отКамера.
   9. Использование счетчик, спина фоторезиста покрытие на поверхности пленки. Многие фоторезисты можно использовать. В этом случае, был использован позитивного фоторезиста.
   10. После резиста вращается на пленку, мягкая выпекать при 90 ° С в течение 5 мин, чтобы высушить резиста.
   11. Опубликуйте маску с изображением устройства прочно против сопротивляться. Источник ультрафиолетового света используется, чтобы выставить фоторезиста. Экспозиция 10 сек, но варьируется в зависимости от силы источника света и сопротивляются используется.
   12. Поместите пленку в разработчика фоторезиста, пока не появится проецируемое изображение. Смыв разработчиков от сопротивляться, что был выставлен для УФ-света, которые вызывают преломление полимерных облигаций. Сразу же после появления изображения, окуните фильм в дистиллированной водой, чтобы остановить разработчика от работы на необогреваемой фоторезиста.
   13. Blow фильмы сухие с сухим азотом.
   14. Поместите фильмы в печь при 120 ° С в течение 15 мин до "жесткого выпекать" фотосопротивляться.
   15. После фильмы остыть, поместите их в качестве травильного раствора, пока металл не защищен фоторезиста не взлетает. Dip в воде, чтобы остановить травление.
   16. Промывают ацетоном, чтобы удалить затвердевший фоторезиста.
   17. Промыть метанола и сушить сухим азотом.
   18. После того, как очки с покрытием готовы, падение различных решений сплава белок на поверхности стекла, и высушите их, по крайней мере 12 часов, чтобы получить литые белок фильмы на стеклах. (Предлагается первый сконцентрировать сплава решения 5 мас%, чтобы получить толстые литые белок фильмы.)
   19. Благодаря гидрофобных-гидрофильных взаимодействий, тонкие металлические пленки будут переведены из стеклянных поверхностей с прилагаемым сплава белка поверхности пленки ^51. Шелушиться сплава белок фильмов с тонкими металлическими узорами из стеклянных подложек с использованием щипцов.
   20. Для получения нерастворимых сплава белок материалы, разместить сухие фильмы в 60 ° C в вакуумной печи (25 кПа) с AWВодный блюдо в нижней части камеры. Откачать воздух в духовке, и пусть водяных паров образцы отжига в течение не менее 2 часов. Отпустите вакуум и шелушиться нерастворимый в воде пленку от подложки с помощью щипцов.
   21. Проверьте электрические свойства металлических узоров на легкосплавных белок фильмах, таких как электрическое сопротивление и сравнить их с оригинальными узорами на стекле.
4. Изготовление фармацевтических материалов на белковых сплавов
   1. Для изготовления сплава белок пленки с фармацевтических соединений, сначала подготовить PDMS подложку, как описано в шаге 3.2. Очистите образованный PDMS субстрат дистиллированной водой.
   2. Растворения или диспергирования фармацевтических соединений в водном растворе. С помощью ультразвука или вихрь, чтобы гомогенно смешивают фармацевтических соединений с водой. Если соединения не растворимы в воде, дисперсных порошков с однородным распределением в свободными ионами дистиллированной воды.
   3. Рассчитать требуемый массовое соотношениесоединений с белком сплавов: объем раствора соединения х весовых процентах раствора соединения: объема сплава раствор белка х весовых процентах раствора соединения (здесь 1 мас% раствора сплава был использован). Выбор коэффициента, чтобы получить пленку с желаемой плотности вещества в сплаве белок пленки.
   4. Медленно смешать раствора соединения с сплава раствора белкового следующей той же инструкции в разделе 2 процесса 2.16. (Примечание: Чтобы избежать образования геля, не ultrasonicate или вихрь решение во время смешивания).
   5. Налейте расчетный объем смеси на PDMS подложки и высушить его, по крайней мере 12 ч в химической капотом к получения сплава белка пленки, содержащей предназначенный соотношение количества фармацевтических соединений.
   6. Физически сшитый фильм следующий же инструкции в разделе 3.2 процессе 3.2.8. Примером сплава фильмов с нерастворимых модельных препаратов с низкой плотностью (LD) или высокой (HD) плотности можно было увидеть на рисунке 4

Representative Results

Типичный белок-белковых взаимодействий (например, между белком А и белка В) может содержать заряда-заряд (электростатические) достопримечательности, образование водородных связей, гидрофобных-гидрофильных взаимодействий, а также диполь, растворитель, противоион и энтропии эффектов между удельная домены двух белков (Рисунок 2) ^3. Поэтому, в сущности, мы можем предсказать последствия этих взаимодействий по вычислительной моделирования.

Рис.2 взаимодействий между белком А и белком Б. Как правило, эти взаимодействия могут быть основаны на заряда заряда (электростатические) достопримечательностей, формирования водородных связей, или гидрофобный-гидрофильных взаимодействий между конкретными областями этих двух белков.

Белок-сплаваСистема может быть смоделирована в качестве материала, состоящего из сшитого белка суб-доменов сплава, при этом каждый из этих суб-сплавов будем считать стабильным. Взаимодействия между белками (А и В) можно рассматривать как облигации с различными жесткости (для этого исследования, мы будем рассматривать только два вида слабых или сильных связей в рисунке 3). Слабые связи может представлять водородные связи и другие облигации, описанные на рисунке 2. Белка сплав в целом формируется через двойной поперечных связей между многими суб-сплавов, что ограниченных вместе через обе сильных и слабых связей. Суб-сплавы формируются с использованием прочных связей и в суб-сплавов мы позволить формирование более слабых связей. Белок-сплава в целом формируется с помощью двойных поперечных связей между суб-многих сплавов, которые связаны друг с другом с помощью различных сильных и слабых связей. Когда система достаточно подчеркнул, как слабые и крепкие узы разрываются. Под правильных условиях слабые связи разрешаетсяреформировать связей снова. Тем не менее, сильные облигации будут разорваны необратимо. Существование слабых связей позволяет сплава-белок, чтобы сохранить свою структурную целостность при внешнем стресса ^36-41. Это численное моделирование использует математическую модель, разработанную через снизу вверх, который основан на методах конечных элементов через решетки-весенний модели ^36-41.

Рисунок 3 Математическое моделирование для демонстрации механическое преимущество системы сплава белка при растяжении. Во время растяжения моделирования, один тип белка (синего цвета) могут образовывать эластичную сети, как пружин, обеспечивающих супер-упругость для материалов, в то время как другой тип Белок (зеленый цвет) может обеспечить сильные физические сшивающие агенты для стабилизации материала сети. Динамический фасонныctural переходы (например, водородных связей образований и деформации) может быть вызван в различных областях для хранения и высвобождения энергии или предоставления дополнительной механической поддержки при растяжении.

Рисунок 3 демонстрирует типичную компьютерное моделирование механических свойств системы сплава белок (с дикой Tussah шелка как белка А и одомашненных шелка шелковицы как белка В) во время растяжения. Во время растяжения моделирования, один тип белка (синего цвета) могут образовывать эластичную сеть с пружинами, обеспечивающих супер-упругость для материалов, в то время как другой тип белка (зеленый цвет) может служить в качестве частиц с сильным механическим сшивающих агентов для материала сети. Динамические структурные переходы (например, образования водородных связей и деформационные) может быть вызван в различных областях для хранения и высвобождения энергии или предоставления дополнительной механической поддержки во время растяжения. Исследования моделирования даютса вообще теоретическая картина понимать взаимодействие между различными структурными белковых молекул, таких, что полезные пары белков может быть выбраны для формирования белка сплавы с сильных взаимодействий и специфическими свойствами, такими как чрезвычайной механической упругости.

Как правило, один раз выбираются белок А и В (здесь они дикие шелк и одомашненные шелк), решение сплава белок может быть произведено в несколько этапов (рисунок 4). Во-первых, источники белка, такие как натуральных волокон или порошков должны быть очищены или очищенный. Например, процесс рафинирования могут быть использованы, чтобы удалить растворимые белки шелка серицина покрытием на большинстве шелка фиброина волокон ^20. Во-вторых, подходящий растворитель должен быть найден, чтобы растворить нерастворимые источники белка в растворах. Например, высокая концентрация раствора LiBr является хорошим растворителем, чтобы сократить бета-листов вторичных структур в различных шелка и растворить волокна в растворах.В-третьих, метод диализа может быть использован для удаления растворителя и растворения восстановить белковых молекул в водном растворе. Дополнительная центрифугирование часто необходимо для удаления примесей и нерастворимых агрегатов в растворе. И, наконец, другим белком водные растворы могут быть смешаны вместе осторожно различных соотношениях. Таким образом, если две белковые растворы не имеют макрофазы разделение, они будут смешаны вместе с сильными взаимодействий и образуют новую систему сплава белка для различных биомедицинских применений. Для того чтобы сделать сплав белковых материалов нерастворим в организме, различные физические или химические сшивающие процедуры могут быть адаптированы. Например, было обнаружено, что при высокой температуре и под высоким давлением паров воды отжига можно было чрезвычайно поперечные различные шелка или эластин материалов ^6,52. В то время как различные кератиновые материалы могут быть сшиты их естественное дисульфидных связей в боковых цепей протеина ^53.

После того, как рлегкосплавные решения rotein производятся и проверяются, они могут быть сформированы в широком диапазоне биоматериалов с перестраиваемой свойств, в том числе материальных матриц для тепловых, механических, оптических, электрических, химических, или биомедицинских применений (рисунок 4). В этой статье, три новые приложения для этих материалов, чтобы продемонстрировать уникальное преимущество белковых сплава биоматериалов были выбраны (рисунок 4). Через современных методов микро-производственных, различные модели поверхности могут быть сформированы на микро или нано-масштабах на легкосплавных белок материалов (рисунок 4 оптических приложений). Например, если оптический дифракционная картина формируется на поверхности пленки, этот фильм может использоваться в качестве средства массовой информации для передачи лазерные лучи в разной оптической картины ^22,23. Если материал сплава белок возникла в ферментном растворе, профиль деградации пленок могут быть поняты при сравнении в режиме реального времени дифракционные картины от пленкис оригинальным узором (вместо туда и обратно мытья и изучения деградированных фильмы в воздухе). Еще одной новой техника для покрытия отличаются микромасштабных схем и беспроводных резонаторов от сплава белок материалов (рис 4 электрические приложение). Благодаря этой технике, микро-токи поврежденных тканей или органов в естественных условиях можно контролировать, с беспроводные сигналы передаются непосредственно к врачам ^24,51. И материал механической прочности и biodurability в организме можно легко контролировать путем смешивания соотношений и специфических белковых компонентов материалов. Наконец, различные препараты, растворимые или нерастворимые рака может быть непосредственно включена в сплаве белковые материалы (фиг.4 химические приложения). Лекарства от рака, часто очень токсичны, и могут повредить не только раковые клетки, но и нормальную иммунную систему человека. Таким образом, контроль регион и дозу доставки лекарств рака в день в организме является одним из тон наиболее важные темы в фармацевтической науки. Через включения лекарства в сплава белковых материалов, можно имплантировать материал только в ткани или органы, рака, а также контролировать скорость высвобождения лекарственного средства от рака в день от сплава белок сети путем управления белковые компоненты и пропорции смешивания. Так как матрица белок полностью биологически из сплава белок материалы будут автоматически удалены ферментов организма после периода наркотиков выпускать. Остатки белка сплавов являются чисто аминокислоты, которые могут всасываться организмом для дальнейшего производства других необходимых белков в естественных условиях. Пациенты, которые получают вулканизированные с помощью регулируемого высвобождения лекарства от рака из имплантированных сплава белковые материалы будут окончательно восстановлены без добавок в организме, и оба природного белка сплава матрицы и лекарства от рака, будет эффективно поглощается в организме в течение этого процесса отверждения.

Рисунок 4 Общие шаги для получения белкового материала сплава, в том числе очистки или очистки источников белкового материала, растворение нерастворимых белковых материалов в растворах, dianalysizing для удаления растворителя растворять из водного белкового раствора, центрифугированием и смешивание вместе с различными коэффициентами, и физические или химические сшивающие процедуры. Решение сплава белок может впоследствии быть сформированы в широком диапазоне биоматериалов с перестраиваемой свойств, в том числе материальных матриц для тепловых, механических, оптических, электрических, химических или биомедицинских применений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию из этой фигуры.

Здесь мы показали критически процедуры, как для изготовления электрических материалы по защв сплавах с деталей в рисунке 5. тонких металлических пленок, таких как электрических цепей могут быть созданы с использованием различных методов осаждения в том числе испарения, импульсного лазерного осаждения, или распыления. Распыление был выбран для данного исследования, поскольку он предоставляет значительную гибкость для энергии распыленных видов посредством корректировки распыления газового давления и мощности, подводимой к катоду, а также осаждения единообразия посредством регулирования давления газа и размера катода. Осаждение распыления могут быть использованы для прогнозирования металлической пленки на стеклянную подложку (фиг.5А). В этом случае цепи пленки Ag осаждались в высокой вакуумной камере с базовой давлении примерно 1 × 10 ^-7 торр. Ar распыления газа была введена в камеру при давлении 20 мторр и Ag осаждали с помощью ВЧ-генератора на 100 Вт в течение 20 мин с 2-дюймовым плоской магнетронного катода, который 8 см от поверхности подложки. Приборы четкостиматизируются использованием общих методов фотолитографии в фильмах на стекле с последующей влажной химического травления (см подробную процедуру на рисунке 5а). Устройства также могут быть определены путем осаждения через физический маски непосредственно на белковых пленок. Температура в помещении электрическое сопротивление электрических схем на белковых пленок измеряли с использованием как двухполюсные и четыре терминала техники. Преимущество четыре терминала подхода является устранение контактного сопротивления от измерения, но мы видим, что сопротивление контакта не имеет существенного значения, так измерение двухполюсника достаточно. Эти два терминала измерений использует хорошего качества мультиметр, установленный на шкале Ом в контакт с пленкой на обоих концах металлической проволоки (схематично показанной на фигуре 5b). В этом измерении, мультиметр служит как источник тока и вольтметр, и измеренное сопротивление напряжение делится на ток. Удельное сопротивление рассчитывается с использованиемρ = РА / л, где R представляет собой сопротивление, является площадь поперечного сечения проволоки и L представляет собой расстояние между зондами. Для создано здесь, Р было измерено, 23,5 Ω, используя наклон вольтамперной кривой в фиг.5В (R = ΔVoltage / ΔCurrent), л 4,45 х 10 ^-2 м, и было установлено, что 6,685 х 10 ^-10 м ^2. Используя эти цифры, сопротивление 3,6 х 10 ^-7 Ω · м был найден по фильмам, примерно 20x больше, чем для металла объемной серебра (1,6 х 10 ^-8 Ω · м). Более высокое сопротивление измеряли в пленках по сравнению с основной массы типично за счет того сложного пути тока и неспособности носителей заряда, чтобы избежать дефектов. Нагрев металла с тепловой пушки увеличил сопротивление свидетельствует об увеличении скорости рассеяния электронов на фононах, характерных для металлической проводимости.

Рисунок 5 (А) Порядок сделать электрических цепей на легкосплавных белок фильмов (здесь серебряных цепей на диких Tussah шелка и шелка шелковицы наложения пленок в качестве примера): (а) без покрытия стекло микроскопа; (Б) Серебряный плазмы во время осаждения распылением от цели диаметром 2 фута; (С) Silver покрытием предметное стекло; (Г) серебра покрытием образец провел к вертушке, используя вакуумный патрон перед добавлением фоторезиста; (Е) Серебро слайд покрыта фоторезистом был введен в печь для мягких-печь при 120 ° С; (Е) Expose к УФ-излучению, чтобы разрушить полимерные связи в фоторезиста; (Г) разработать фоторезиста; (Ч) Жесткий-печь резиста, чтобы подготовиться к травлению в кислоте; (I) протравить в кислоте, а затем остановить травление путем промывки на водяной бане; (К) Высушите слайд; (K) белок, отлитого сплава раствора на предметное стекло; (Л) Передача серебряные узоры на высушенное белковую пленку. (B) -7 Ω · м, примерно 20x больше, чем для объемной серебристого металла. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6 Тепловая модель анализа используется для проверки смешиваемость смешанной системе белка. Если белок А и В имеют отдельные одиночные температуры стеклования, Т _г (А) и T _G (B), соответственно (зеленый и синий кривые), полностью смешивается Сплав системы белок будет показывать только один стеклянный переход, отличный от T _г с А и В (красная кривая). В противном случае, белокс не смешиваются смеси с обеих Т _г (А) и Т _г (B) (черная линия), или полу-смешивающихся композитов с двух сдвинутых стеклянные переходы (оранжевый кривая).

Discussion

Один из наиболее важных процедур в производстве системы белка "сплава" является проверка смешиваемость смешанных белков. В противном случае, это только не смешивается смесь белок или белковый сложная система без стабильных и перестраиваемых свойств. Экспериментальный метод термического анализа могут быть использованы для этой цели, и подтверждают их свойства сплава. Белок-белковые взаимодействия можно рассматривать в соответствии с Флори Хаггинс в решетчатой ​​модели ^48, как взаимодействия между "растворителя" (преобладающего белкового компонента) и "вещества" (несовершеннолетний белковый компонент). На основании этой модели, изменение свободной энергии при смешивании между "растворителем" и "растворенного вещества" управляет смешиваемость смеси ^48. Вообще, существует три различных степеней Совместимость: (а) полностью смешивается (форма однофазный материал макроскопически), (б) метастабильной (форма полу-смешивающиеся фазы в материале), и (в) не смешивается (остаются оригинальные две фазы с индивидуальной белка А и В областях) ^3,48. Соответственно, стеклования поведение системы двух белков может продемонстрировать эти различия и в идеале можно выразить с помощью модели фазовой диаграммы (рисунок 6). Например, если белок А и В имеют свои индивидуальные одиночные температуры стеклования, Т _G (A) и T _г (В), соответственно (Рисунок 6 зеленых и синих кривые), полностью смешивается Сплав системы белок должен показать только один стеклянный переход при нагреве. Этот сингл стеклования обычно промежуточным между Т _г с А и В (рисунок 6). В противном случае, эти белки могут образовывать несмешиваемой смесью причем как Т _г (А) и Т _г (B) появляются на исходные позиции (рисунок 6). Белки могут также образовывать частично смешиваемых с водой систему, указанную две смещенные стекла Tranпереходы (Рисунок 6). Практический пример полностью смешивается белка "сплава" системы (форма одного стеклования) можно найти в ДСК сканирования образцов смесевых шелк-tropoelastin на рисунке 4 (тепловая приложение) ^9. С уменьшением содержанием шелка, температура стеклования (T _г) из смесей постепенно увеличивается от 178 ° C (чистого шелка) до 190 ° C (чистый tropoelastin) ^9, пока последовательно поддерживать однородную одного стеклования для всех типов смешивает. Согласно модели Флори Хаггинс, это означает, что все шелка-tropoelastin смеси различных пропорциях устойчивы и полностью смешивается белковые сплавы без любых макрофаза разделений.

В заключение, новые поколения сплава белок материалов может быть произведено и изготовлены в различных медицинских устройств (например, фильмы, швы, винты, пластины, микро-иглы, гели), с программным управлением и тунцаBLE оптические, электрические, химические, тепловые и механические свойства. Через контроля смешивания компонентов и коэффициенты, различные биофизические свойства сплава белок материалов, таких как эластичность, прочность, шероховатость поверхности, поверхностного заряда, biodurability и химической активности, можно манипулировать, что в конечном итоге повлиять на функции тканей, а также местная сотовая поведения, связанные с этими материалами. Кроме того, в связи с характером программируемого жизни белков ', в естественных условиях становится жизнеспособным платформа для этих сплавов. Такие преимущества могут обеспечить новые возможности для имплантируемых медицинских устройств в будущем, где после ремонта хирургическое извлечение можно избежать. Эти легкосплавные белок биоматериалы также предложить новый путь для производства медицинских устройств с перестраиваемой частотой биологических функций и свойств, и с соответствием соответствие тканей и других нужд. В данной статье приводится общий обзор протокола для как для изготовления этих устройств ипойдет на пользу и ученых и клинических врачей в нескольких биомедицинских областях.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC)	TA Instruments, New Castle, DE, USA	N/A	You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System	T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA	N/A	With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven	VWR International, Bridgeport, NJ, USA	N/A	You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.