Designing Silke-silkeprotein legering materialer til biomedicinske anvendelser

Summary

Blending er en effektiv metode til at generere biomaterialer med en bred vifte af egenskaber og kombinerede funktioner. Ved at forudsige de molekylære vekselvirkninger mellem forskellige naturlige silkeproteiner kan nye silke-silke protein legering platforme med indstillelig mekanisk elasticitet, elektriske reaktion, optisk transparens, kemisk bearbejdelighed bionedbrydelighed eller termisk stabilitet udformes.

Abstract

Fibrøse proteiner vist forskellige sekvenser og strukturer, der er blevet anvendt til forskellige anvendelser i biomedicinske områder såsom biosensorer, nanomedicin, vævsregenerering og drug delivery. Design materialer baseret på molekylær skala interaktioner mellem disse proteiner vil hjælpe generere nye multifunktionelle protein legering biomaterialer med justerbare egenskaber. Sådanne legeret materiale systemer også give fordele i forhold til traditionelle syntetiske polymerer på grund af materialer bionedbrydelighed, bioforligelighed og tenability i kroppen. Denne artikel anvendes protein blandinger af vilde tussahsilke (Antheraea pernyi) og indenlandske morbær silke (Bombyx mori) som et eksempel for at give nyttige protokoller vedrørende disse emner, herunder hvordan at forudsige protein-protein interaktioner ved beregningsmetoder, hvordan man producerer proteiner legering løsninger, hvordan man kan kontrollere legeret systemer ved termisk analyse, og hvordan man kan fremstille variable legering materialerherunder optiske materialer med diffraktionsgitre, elektriske materialer med kredsløb belægninger, og farmaceutiske materialer til narkotika frigivelse og levering. Disse metoder kan give vigtige oplysninger til at designe den næste generation multifunktionelle biomaterialer baseret på forskellige protein legeringer.

Introduction

Naturen har skabt strategier til at generere afstemmelige og multifunktionelle biologiske matricer ved hjælp af et begrænset antal af strukturelle proteiner. For eksempel er elastiner og collagener altid anvendes sammen in vivo til at give de justerbare styrker og funktioner, der kræves til specifikke væv ^1,2. Nøglen til denne strategi er at blande. Blanding involverer blanding proteiner med specifikke forhold og er en teknologisk metode til at generere simple materielle systemer med justerbar og varieret egenskaber ^3-5. Sammenlignet med syntetiske engineering strategier ^6,7, kan blanding også forbedre materiale ensartethed og evnen til at behandle materialet på grund af den nemme betjening ^8-16. Derfor designe multifunktionelle, biokompatible protein legering materialer er et nyt område for medicinsk forskning. Denne teknologi vil også give systematisk viden om virkningerne af naturlige protein matricer på celler og væv fungerer både i vitro-og in vivo ^10,17. Ved at optimere molekylære grænseflader mellem forskellige proteiner, kan protein-baserede legering materialer omfatter en række fysiske funktioner, såsom termisk stabilitet ved forskellige temperaturer, elasticitet til at understøtte forskellige væv, elektrisk følsomhed i variable organer og optiske egenskaber for hornhindevæv regenerering ^{3, 18-27.} Resultatet af disse undersøgelser vil give et nyt protein-materialer platform inden for biomedicinsk videnskab med direkte relevans for afstemmelige væv reparationer og sygdomsbehandlinger samt yderligere føre til bionedbrydelige implantatanordninger hvor deres nye terapeutiske og diagnostiske funktioner kan forestillede sig ^3.

Mange naturlige strukturelle proteiner har kritiske fysiske og bioaktive egenskaber, der kan udnyttes som kandidater til de biomaterielle matricer. Silks fra forskellige ormen arter keratiner fra hår og uld, elastins og kollagener fra forskellige væv, ogforskellige vegetabilske proteiner er nogle af de mest almindelige strukturelle proteiner, der anvendes til at designe variable protein-baserede materialer (figur 1) ^18-27. I almindelighed kan disse proteiner danner forskellige molekylære sekundære strukturer (fx beta-sheets til silke, eller coiled spoler til keratiner) på grund af deres unikke gentagne primære aminosyresekvenser ^3,28-35. Disse funktioner fremme dannelsen af ​​selvsamlede makroskopiske strukturer med unikke funktioner på biologiske grænseflader der beder deres anvendelighed som en skattet ressource biopolymermaterialer. Her blev to typer af strukturelle proteiner der anvendes (protein A fra vild tussahsilke og protein B fra tamme morbær silke som et eksempel) at påvise de generelle protokoller fra produktion af forskellige protein-legering biomaterialer. Protokollerne demonstreret omfatter del 1: protein-interaktion forudsigelser og simuleringer, del 2: produktion af protein legering løsninger og del 3: fabrikation af protein legeringsystemer og for optiske, elektriske og farmaceutiske anvendelser.

Figur 1. Råvarer af forskellige strukturelle proteiner, der almindeligvis anvendes i vores laboratorium for at designe protein-baserede materialer, herunder silke fra forskellige ormen arter keratiner fra hår og uld, elastins fra forskellige væv, og forskellige vegetabilske proteiner.

Protocol

1. Forudsigelse af proteininteraktioner

1. Bioinfomatics Analyse af proteinmolekyler
   1. Besøg National Center for Biotechnology Information hjemmeside (www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), og søge i protein navne, der vil blive anvendt til legeringen undersøgelsen. Bemærk: I dette eksempel blev to proteiner anvendt: protein A, som er den vilde tussahsilke fibroin og protein B, som er den indenlandske brombær silkefibroin. For protein A, kan aminosyresekvenseme læses i "fibroin [Antheraea pernyi] GenBank: AAC32606.1" (Antheraea pernyi er den kinesiske (Oak) Tussah Moth). Til proteinekspression B kan aminosyresekvenser kan findes i "fibroin tung kæde precursor [Bombyx mori] NCBI referencesekvens: NP_001106733.1" og "fibroin let kæde precursor [Bombyx mori] NCBI referencesekvens: NP_001037488.1" sammen (Bombyx mori er den tamme avlen af morbærtræ).
   2. Vælg og sahar aminosyresekvenserne af protein A og protein B fra databasen.
   3. Besøg ExPASy hjemmeside (SIB Bioinformatik Resource Portal) (www.expasy.org) eller bruge andre kommercielle software til at beregne de grundlæggende bioinfomatics data for proteiner baseret på deres sekvenser, herunder, men ikke begrænset til, samlede afgift pr molekyle, hydrofobicitet indeks molekylet, titreringskurve af molekylerne ved forskellige pH-værdier, etc. Denne information vil blive brugt som grundlæggende elementer for den beregningsmæssige simulering af protein interaktioner, og det vil hjælpe til at forstå, om disse to proteiner har stærke interaktioner. [Note: Dette trin er ikke netop forudsige alle detaljer af protein-interaktion ligesom dem, der anvendes i små peptider eller funktionelle proteiner videnskab. Formålet med dette afsnit er blot for at undgå at producere et protein blanding med indlysende macrophase separationer, som ikke kan kaldes en "legering" materiale. Derfor ville skønnet være omtrentlig, men the-protein legering system kan verificeres af en eksperimentel metode, der er beskrevet i trin 3.1 ved hjælp af præcise termisk analyse].
2. Computersimuleringer af protein Alloy-system
   Nedenfor er der beskrevet en fremgangsmåde til at simulere proteinet legeringssystem. En simulation program er skrevet i C programmeringssprog, der kan bruges på en enkelt eller multiprocessor computer system. Et gitter-fjeder-masse (LSM) model blev brugt til at simulere legeret proteinerne ^36-39. LSM-modellen giver en simpel beskrivelse af netto kraft på en masse, når der er knyttet til en fjeder, og man kan løse kraft ligning til at forstå forslaget til hver masse. Et simpelt program algoritme til at modellere dette protein legering systemet ved hjælp af LSM modellen er givet som følger:
   1. Repræsentere en enkelt protein som en grovkornet partikel, der har en masse på m.
   2. Brug en Hookean eller en neo-Hookean forår til at repræsentere en obligation ^38,39. Ved at knytte et endeligt antal partikler med fjedre, kan man mAKE en sub-legering domæne, som repræsenterer en stabil byggesten af ​​legeret proteiner. At repræsentere forskellige typer af obligationer i intra-binding, bruger forskellige fjederkonstanterne / stivhed.
   3. Model proteinet legering systemet som et materiale bestående af sløvt tværbundne sub-legeringer. Igen her forskellige stivheder blev brugt til at repræsentere forskellige bindinger mellem samspillet af sub-legeringer.
   4. Model obligationsmarkedet bryde og reformation proces ved en Bell model ^40,41, hvorigennem svage bindinger er tilladt at reformeret, men stærke bånd kan ikke reformere, når de er brudt. Når systemet er tilstrækkeligt understreget (både på de intra-suballoy og inter-suballoy obligationer), kan bindinger brydes og reformeres.
   5. For at undersøge deformation virkning på alu-proteiner, når de er stressede anvende eksterne kræfter til systemet. Fordel disse kræfter ligeligt til hver partikel, når de løser den kraft ligning (Newtons love).
   6. For at modellere interaktionermellem opløsningen (såsom vandmolekyler), og de proteiner, anvende en yderligere trækkraft eller friktionskraft til hver partikel.
   7. Løs kraft ligning for hver partikel med handlinger hver styrke (fjederkraften fra obligationen, den ydre kraft, og friktionskraften).
   8. Beregn og udtrække positionerne af protein partikler som en funktion af tiden.
   9. Beregn de fysiske mængder, som karakteriserer legering-proteiner fra positionerne af partiklerne.
   10. Skift obligationen stivhed i programmet til at forstå samspillet mellem forskellige proteiner. (Den gennemsnitlige obligationsrente stivhed beregnes ud fra Youngs modul af proteinstoffer. Youngs modul af forskellige fibrøst protein materialer kan fås enten ved Universal stræktestmetoden ^18, eller direkte fra tidligere litteratur ^2-4,18).

2. Produktion af protein Alloy Solutions

Vilde tussahsilke (protein A) og indenlandsk morbær silke (protein B) vælges her som et eksempel af protein legering system. Denne protokol først præsenterer, hvordan man opnår den vilde tussahsilke (protein A) opløsning.

1. Skær rå vilde tussahsilke kokoner eller fibre ved en vægt på 3 g.
2. Mål 3 g natrium dicarbonat eller natriumcarbonat (Bemærk: Hvis der anvendes natriumcarbonat, vil molekylvægten af proteinkæder reducere under kogeprocessen ^42).
3. Fyld en 2 liters bægerglas med destilleret vand _(H2O). Derefter placere bægerglas på en varm fase dække det med aluminiumsfolie, og der opvarmes til kogepunktet.
4. Fjern aluminiumsfolie låg og tilsæt målte natrium dicarbonate langsomt i det kogende vand, så det opløses fuldstændigt. (Bemærk: rolle natrium dicarbonate er "sæbe" at rense ud opløselige sericin proteiner og andre urenheder, der er knyttet på overfladen af ​​vild silke fibre Hvis du bruger andr.ER natur proteinfibre, skal du vælge tilsvarende kemiske midler ifølge litteraturen).
5. Tilsæt de rå proteinfibre (vild silke fibre) i det kogende vand og lad det koge i 2-3 timer (Bemærk:. Kogepunktet tid har afgørende indflydelse på molekylvægten af proteinkæder ^26,43 Man bør vælge en passende tid i henhold litteraturen eller ved at udføre kontrolforsøg ^26,43. kogepunktet også kan tilpasses til at påvirke molekylvægt proteinkæderne ^26,43,44).
6. Efter kogning, fjern forsigtigt proteinfibre med en spatel fra opløsningen og presse dem til at fjerne overskydende vand. (ADVARSEL: Fibrene er meget varmt!)
7. Dernæst nedsænke fibrene i en 2 L bæger med koldt destilleret vand, og vask fibrene to gange i 30 minutter hver til helt at fjerne de urene rester fra fiberens overflade. Tør fibrene i et stinkskab i mindst 12 timer.
8. Smelt 45,784 g calcium nitsats (Ca _{(NO3) 2)} i et bægerglas til dannelse af en væske ved 65 ° C til opløsning af de vilde silke proteinfibre. (Bemærk: Hvis du bruger andre naturlige proteinfibre, skal du vælge en tilsvarende opløsningsmiddel til at opløse proteinerne Her kan du også bruge 9,3 M LiSCN eller LiBr løsning, eller en 85% fosfat løsning til at opløse forskellige silke fibre..)
9. Kombiner fibrene og opløsningsmidlet i et forhold på 1 g fibre i 10 ml opløsningsmiddel. Fibrene skal opløses ved 95 ° C i 5 til 12 timer. (Bemærk: opløse afhænger af molekylvægten af proteiner ^26,43-45)
10. Ved hjælp af sprøjter, injicere vild silke opløsning i 12 ml dialyse-kassetter (højst 1.000 MW cutoff størrelse) eller forseglede dialyse slanger (højst 1.000 MW cutoff størrelse) og dialyseres mod 2 liter destilleret vand. (Bemærk: injektion er mere effektiv, hvis temperaturen af ​​opløsningen ved 35 ° C, ellers viskositet proteinopløsning stige dramatisk ved stuetemperatur). Skift destilleret vand ofte for at fjerne Ca (NO _{3) 2} opløsningsmidler i opløsningen (efter 30 min, 2 timer, 6 timer, og derefter hver 12 timer i 3 dage. I alt vil der være cirka 8 vandskift).
11. Efter 3 dage, indsamle protein løsninger fra dialyse kassetter eller slanger og anbringes i 13.000 rpm vurderet rør.
12. Centrifuger løsninger til 1 time ved 3.500 rpm ved 4 ° C 3x at fjerne aflejringer. Efter hver centrifuge køre, trække hurtigt supernatanten til nye rør. Opbevar de endelige opløsninger i et 4 ° C køleskab.
13. Hæld 5 ml af protein opløsning på en polydimethylsiloxan (PDMS) substrat eller anden flad hydrofobt substrat og lad det tørre helt (dette normalt tager mere end 12 timer). Det resterende faststof proteinfilm vejes, og beregner den endelige opløsningskoncentration vægt procent (w / v%) = målte vægt (i mg) ÷ 5 (i ml) ÷ 10.
14. Saml en anden valgt naturligt protein fiber (i denne case blev domesticeret mulberry silke anvendes som protein B) og gentage ovenstående fremgangsmåde med et passende "sæbe" og opløse opløsningsmiddel, indtil det endelige protein vandopløsning med målte koncentration opnås. [Bemærk: Hvis protein materialer er i pulverform, anvende passende porøse rør eller membraner til at holde prøverne i løbet af "soaping" proces. Hvis proteinet allerede er blevet oprenset, gå direkte til trin 2.8 til at opløse pulveret. Hvis proteinet allerede er blevet renset og er vandopløseligt, gøre sin vandig opløsning med en ønsket koncentration først og derefter gå til trin 2.15 nedenfor for at gøre blend protein løsninger.]
15. Langsomt fortynde protein En opløsning (her vild silke opløsning) i destilleret vand ved 4 ° C til dannelse af en 1,0 vægt% protein A vandig opløsning. Gør det samme proces for Protein B (her tamme silke).
16. Langsomt blande 1 vægt% protein A-opløsning med protein B-opløsning ved 4 ° C ved hjælp af en pipette til at undgå protein aggregering under blanding. (Note 1: Brug ikke en vortex instrument til at blande proteinerne, da nogle proteiner (f.eks, silke), vil danne hydrogeler under vibration ^46,47 Note 2:. Hvis det er muligt, bruge ekstra anordninger til kontrol af blanding sats og blande størrelse gør Sørg for at blande dem så langsomt som muligt for at undgå sammenlægning. ikke hurtigt pipette løsningen under blanding).
17. De endelige iblanding opløsninger bør have en bestemt masseforhold eller et molforhold af protein A: Protein B. Typisk bland dem med masseforhold 90:10, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90 til opnåelse af et bredt spektrum af legeret løsninger. Brug rene protein A og protein B-løsninger som kontroller. For en blanding opløsning med et molforhold af protein A: Protein B = R: (100 R). Beregn blanding volumen-forholdet (baseret på en samme 1 vægt% opløsning) af: Volumen A: Volume B = R · (MW A): (100-R) · (MW B).
18. Umiddelbart kaste de endelige løsninger på PDMS substrater til dannelse af film eller andre designed materialer. (Bemærk: Må ikke opbevares høje koncentrationer protein legering løsninger til en lang tid Flere aggregater kan dannes senere på grund af protein-protein interaktioner i vand.). Hvis det er nødvendigt, fortyndes blend løsninger med ion-frit destilleret vand og holde dem i en 4 ° C køleskab for at undgå yderligere proteinaggregering i løsninger.

3. Fabrikation af Variabel Protein legering materialer

1. Bekræft Alloy Forudsigelse af termisk analyse ^3,9,31-35
   1. Forbered PDMS substrater og rense dem ved opblødning i destilleret vand.
   2. Cast protein blend løsninger med forskellige blandingsforhold på PDMS substrater.
   3. Tør løsninger i mindst 12 timer i en kemisk hætte med luftstrøm, indtil film dannes (Bemærk: Brug den samme mængde forskellige løsninger, således at tykkelsen af ​​film kan være fast).
   4. Fjern protein legering film fra PDMS substrater og placere dem på ren retter.
   5. Mange differentialscanningskalometri (DSC) aluminium pander og låg til DSC undersøgelse afvejes. Match gryden og låg par at have en lige totale vægt (vægten af ​​panden plus vægten af ​​låget svarer til en konstant vægt). For eksempel blev her en samlet vægt på låg og panorere 22,50 mg anvendt, og otte sæt af låg og pan kombinationer med denne samlede vægt blev fremstillet.
   6. Indkapsle 6 mg hver type tørret protein passer i aluminium DSC pander og forsegle dem med deres matchede låg i processen 3.1.5. Seal en tom gryde og låg par, der skal bruges med prøven som reference, så kun varmekapacitet af prøver sig selv vil blive registreret under den termiske analyse (Bemærk: DSC vil sammenligne varmekapacitet henvisning gryde + låg vs at prøve + gryde + låg. På grund af de samme vægt, vil baggrunden varmekapacitet fra pander og låg tages højde for så kun varmekapacitet prøve i gryden).
   7. Put forseglede referencer og prøve pander ind i en DSC-instrument medrenset tør nitrogengasstrøm på 50 ml / min, og er udstyret med en nedkølet kølesystem. Før prøven målingerne bør DSC instrument først kalibreres med safir og indium for varmestrøm og temperatur, hhv.
   8. Pre-run DSC ved en opvarmningshastighed på 2 K / min til 150 ° C og derefter holde ved denne temperatur i 15 minutter for at fjerne eventuelle resterende vandmolekyler i prøverne (typisk omkring 3-10% af den samlede vægt). Hurtigt køle (10 K / min) til 25 ° C.
   9. Kør DSC igen ved en opvarmningshastighed på 2 K / min til 300 ° C, eller indtil nedbrydningen toppen af blandinger protein vises ^34. Optag varmekapaciteter af proteinet prøven ved forskellige temperaturer i løbet af denne proces. Afkøl DSC og ændre den gamle prøve til en ny prøve med en anden blandingsforhold.
   10. Beregn og plot varmekapacitet vs Temperaturkurver for hvert protein blanding prøve ved hjælp af DSC-software ^31-35.
   11. Bedømme miscibility blandinger protein ved følgende metode (se figur 4 Termisk og figur 5), og hvis de to proteiner er fuldt blandbare, kan de kaldes "protein legeringer". Ellers udtrykket "protein komposit" ville være en egnet navn ifølge polymer beskrivende teorier ^48,49):
       1. De individuelle proteiner A og B skal have individuel enkelt glasovergange temperatur _Tg (A) og _Tg (B) (se de grønne og blå kurver i figur 5) ^3,48;
       2. Denne enkelt glasovergangstemperatur normalt mellemliggende mellem de af de to individuelle proteinkomponenter, _Tg (A) og _Tg (B) (se figur 5) ^3,48;
       3. Blandbar faseseparation blandinger opnås, hvis både _Tg (A) og _Tg (B) viste sig ved deres oprindelige positioner (figur 5), og med hver _Tg trinhøjde i forhold til sammensætningen af de to proteiner er fuldt blandbart ^3,48.
       4. Delvis blandbare sammensatte blanding type vil have en meget bred glasovergangen eller stadig kan have to glasovergange, men hver har migreret tættere på hinanden i forhold til de rene protein komponenter, _Tg (A) og _Tg (B) ( se figur 5). I dette tilfælde kan der være mikro-heterogene fase, der er dannet mellem de to protein-komponenter, og sammensætningen kan variere fra sted til sted.
   12. Hvis (3.1.11.1) er tilfældet vist i DSC, og det kan bekræftes, at proteinet AB er en legering system, så gå videre til fabrikere protein legering materialer.
2. Fabrikation af optiske materialer ved protein Legeringer
   1. Frugt og grøntsager (i fabrikation laboratorium) eller købe en konstrueret topografisk overflade til støbning. I dette specifikke eksempel blev et glas med fire diffraktionsmønstre anvendes (figur 4Optisk).
   2. Placer glasset med diffraktionsmønstre i en skål, og sørg for, at mønstret overflade står opad.
   3. Spred PDMS løsning jævnt på glassets overflade, og fuldt ud dække overfladen mønstre (PDMS Opløsningen fremstilles ved pottemuld og katalysator løsning i en 9: 1 blandingsforhold afhængig af brugerens instruktion ^23,44).
   4. Placer støbning fadet i en 65 ° C varm ovn i mindst 2 timer, mens på en flad overflade. PDMS opløsning skal tørre i et fast substrat under denne proces.
   5. Fjern PDMS underlag fra glasset. Diffraktionsmønstrene skal nu overføres til PDMS overflade.
   6. Punch ud PDMS forme med diffraktion mønstre ved hjælp af et passende hul punch.
   7. Drop protein legering løsninger på PDMS overflader med diffraktionsmønstre, og tør dem i mindst 12 timer for at opnå film med diffraktionsmønstre.
   8. For at opnå uopløselige protein legerede materialer, placere hele sæt af dry film, herunder PDMS forme i en 60 ° C vakuumovn (25 kPa) med en vandskål på bunden af ​​kammeret. Pump luft i ovnen, og lad vandet dampe Anneal prøver for mindst 2 timer. (Denne proces kaldes temperaturstyret vanddamp annealing ^45. Sammenligning med den udbredte methanol metode, kan det generere lignende indhold beta-ark i silke materialer ^45). Slip vakuum og skrælle den vanduopløselige film fra PDMS underlaget med pincet. I dette eksempel er vild silke domesticerede silke legeringer anvendes.
   9. Teste kvaliteten af diffraktionsmønstre på film ved at sammenligne dem med de originale mønstre på glasset (fx indsamle SEM billeder til mikro-skala detaljer, indsamle laser diffraktionsmønstre for det generelle mønster kvalitet).
3. Fabrikation af elektriske kredsløb på protein Alloys Materialer
   1. At fremstille et elektrisk kredsløb mønster på glas substrat, første cleana objektglas ved hjælp af nogle affedtning opløsningsmiddel, såsom Alconox i en ultralydsrenser i 5 minutter, efterfulgt af 5 min i acetone, efterfulgt af 5 minutter i methanol. Den methanol anvendes sidst, da det fordamper langsommere end acetone kan så blive blæst væk fra underlaget snarere end tørring og forlader rester.
   2. Blow objektglasset tør med tør nitrogen gas, som er genereret af kog-off fra en 180 L flydende kvælstof dewar.
   3. Indføre substratmaterialerne ind aflejringskammeret. (Disse retningslinjer er for en spruttende system, men andre deposition teknikker kunne anvendes.) Hvis kammeret er designet med en loadlock, er vakuum i aflejringskammeret ikke væsentligt påvirket. Evakuere loadlock til et tryk på 30 mTorr.
   4. Åbn skydeventilen mellem loadlock og vigtigste aflejringskammeret og indføre substratet ind i kammeret.
   5. Tænd argongas og trykregulatoren og styre trykket til den ønskede deposition pres. Højere tryk giver lavere energipriser forstøvet metal atomer og mere ensartede film, mens lavere tryk giver bedre vedhængende hurtigere film med afsat. Rækken af ​​tryk er generelt mellem 3 mTorr og 60 mTorr, med 20 mTorr fungerer godt.
   6. Metaller derefter projiceret på en lukker, der beskytter underlaget fra coating ved hjælp af en RF-effekt på 100 W. En tuning kredsløb er nødvendig for at lede RF-effekt til målet metal. DC kan anvendes i stedet for RF for metalliske mål. For at fjerne oxidlag og forurenende stoffer fra målet, før sputter i flere minutter.
   7. Åbn lukkeren og sputter metal på underlaget. Depositionen sats for beskrevne konfiguration er omkring 10 nm pr min. Denne sats vil afhænge af arbejdet afstand, tryk, magnet styrke i magnetron katode, mål tykkelse og metallet spruttede. Juster deposition tid til at opnå den ønskede tykkelse.
   8. Fjern det coatede objektglas frakammer.
   9. Ved hjælp af en spinner, spinde en fotoresistbelægning på overfladen af ​​filmen. Mange resists kan anvendes. I dette tilfælde blev positiv fotoresist anvendes.
   10. Efter modstå spindes på filmen, blød bages ved 90 ° C i 5 minutter for at tørre modstå.
   11. Placer en kontaktperson maske med et billede af enheden fast mod modstå. En UV-lyskilde til at eksponere fotoresisten. Eksponeringen er 10 sek, men varierer afhængigt af styrken af ​​lyskilden og resisten anvendes.
   12. Placer filmen i fotoresist udvikleren indtil det projicerede billede vises. Udvikleren skyller væk modstå, der blev udsat for UV-lys, som forårsager bruddet på polymer obligationer. Umiddelbart efter billedet vises, dyppe filmen i DI vand for at stoppe udvikleren fra arbejdet med eksponerede fotoresist.
   13. Blow filmene tørre med tør nitrogen gas.
   14. Placer film i en ovn ved 120 ° C i 15 min til "hård bage" billedetmodstå.
   15. Efter filmene afkøles, læg dem i en radering løsning indtil metallet ikke er beskyttet af fotoresisten løfter slukket. Dyp i vand for at stoppe ætsning.
   16. Skyl med acetone for at fjerne det hærdede fotoresist.
   17. Skyl med methanol og blæs tør med tør nitrogen.
   18. Når de overtrukne briller er klar, drop forskellige protein legering løsninger på de glasflader, og tør dem i mindst 12 timer for at få protein legering film på glassene. (Det anbefales at først koncentrere legering løsninger til 5 vægt% for at opnå tykke protein legering film.)
   19. På grund af de hydrofobe-hydrofile interaktioner, vil de tynde metalfilm overføres fra glasoverflader til vedlagte protein legering film overflader ^51. Skrælle protein legering film med de tynde metal mønstre fra glassubstraterne med en pincet.
   20. For at opnå uopløselige protein legering materialer, skal du placere de tørre film i en 60 ° C vakuumovn (25 kPa) med awater skål i bunden af ​​kammeret. Pump luft i ovnen, og lad vandet dampe Anneal prøver for mindst 2 timer. Slip vakuum og skrælle den vanduopløselige film fra underlaget med en pincet.
   21. Test de elektriske egenskaber for metal mønstre på protein legering film som elektrisk modstand og sammenligne dem med de originale mønstre på glasset.
4. Fabrikation af farmaceutiske materialer ved protein Legeringer
   1. At fabrikere et protein legering film med farmaceutiske forbindelser, først forberede en PDMS substrat som beskrevet i trin 3.2. Rens det dannede PDMS substrat med destilleret vand.
   2. Opløs eller sprede farmaceutiske forbindelser i en vandig opløsning. Brug ultralyd eller vortex homogent blande farmaceutiske forbindelser med vandet. Hvis forbindelserne ikke er vandopløselige, dispergere pulverne med en homogen fordeling i ion-frit destilleret vand.
   3. Beregn ønskede masseforholdaf forbindelser til proteinet legeringer efter volumen af ​​forbindelsen løsning x vægtprocent af forbindelsen opløsning: volumen af ​​protein legering løsning x vægtprocent af forbindelsen opløsning (her 1 vægt% legering opløsning blev anvendt). Vælg et forhold for at opnå en film med den ønskede forbindelse tæthed i proteinet legering filmen.
   4. Langsomt blande forbindelsesopløsningen med proteinet legering løsning efter de samme instruktioner i afsnit 2 proces 2.16. (Bemærk: For at undgå gelering ikke ultralydsbehandles eller vortexes løsning under blandingen).
   5. Hæld en beregnet mængde af blandingen på PDMS substrat og tør det mindst 12 timer i en kemisk hætte til en få protein legering film indeholdende en konstrueret forhold af farmaceutiske forbindelser.
   6. Fysisk tværbundet filmen efter samme instruktion i afsnit 3.2 proces 3.2.8. Et eksempel på legeret film med uopløselige model lægemidler med en lav densitet (LD) eller høj (HD) densitet kan ses i figur 4

Representative Results

Typisk protein-protein interaktioner (f.eks mellem protein A og protein B) kan indeholde charge-charge (elektrostatisk) seværdigheder, hydrogenbinding dannelse, hydrofobe-hydrofile interaktioner, samt dipol, opløsningsmiddel, modion, og entropiske virkninger mellem den specifikke domæner af de to proteiner (figur 2) ^3. Derfor fundamentalt, kan vi forudsige virkningerne af disse interaktioner med beregningsmæssige simuleringer.

Figur 2. Interaktioner mellem protein A og protein B. Typisk kan disse interaktioner være baseret på charge-opladning (elektrostatiske) attraktioner, hydrogenbinding dannelse, eller hydrofob-hydrofile vekselvirkninger mellem de specifikke domæner af disse to proteiner.

Proteinet-legeringSystemet kan modelleres som et materiale bestående af tværbundet protein sub-legeret domæner, hvor hver af disse sub-legeringer antages at være stabil. Samspillet mellem proteinerne (A og B) kan betragtes som obligationer med forskellige stivheder (til denne undersøgelse, mener vi kun to typer af svage eller stærke bindinger i figur 3). De svage bindinger kunne repræsentere hydrogenbindinger og andre obligationer, der er beskrevet i figur 2. Protein-legering som helhed dannes gennem dobbelt tværbindinger mellem mange sub-legeringer, afgrænset sammen gennem både stærke og svage obligationer. Den sub-legeringer dannes ved hjælp af stærke bånd og inden for sub-legeringer vi tillader dannelsen af ​​svagere obligationer. Proteinet-legering som helhed dannes gennem dobbelt tværbindinger mellem mange sub-legeringer, der er bundet sammen gennem forskellige stærke og svage obligationer. Når systemet er tilstrækkeligt stresset, er både den svage og den stærke bindinger sprængt. Under rette betingelser de svage bindinger er tilladt atreformere bindinger igen. Dog vil de stærkere bindinger brydes irreversibelt. Eksistensen af de svage bindinger tillader legeret protein for at bevare sin strukturelle integritet under ekstern stress ^36-41. Denne numeriske simulering anvender en matematisk model udviklet gennem en bottom-up-tilgang, der er baseret på finite element metoder gennem gitter-forår model ^36-41.

Figur 3. Computational simulering at demonstrere den mekaniske fordel af et protein legering systemet under strækning. Under strækning simulation, kan en type af protein (blå farve) danner en elastisk netværk som fjedre leverer super elasticitet for materialerne, mens en anden type protein (grøn farve) kan give stærke fysiske tværbindere til stabilisering af materialet nettet. Dynamisk structural overgange (f.eks hydrogenbinding formationer og deformationer) kan fremkaldes i forskellige domæner til opbevaring og frigive energi eller yde yderligere mekanisk støtte under strækningen.

Figur 3 viser en typisk beregningsmæssige simulering af de mekaniske egenskaber af et protein legeringssystem (med vild tussahsilke som protein A og tamme mulberry silke som protein B) under strækning. Under strækning simulation, kan en type af protein (blå farve) danner en elastisk net med fjedre leverer super elasticitet for materialerne, mens en anden type protein (grøn farve) kan tjene som partikler med stærke fysiske tværbindere for materialet netværket. Dynamiske strukturelle overgange (f.eks, dannelse og deformation hydrogenbinding) kan induceres i forskellige domæner til opbevaring og frigive energi eller yde yderligere mekanisk støtte under stræk. Simuleringsundersøgelserne giverSA generel teoretisk billede for at forstå samspillet mellem forskellige strukturelle protein molekyler, således at nyttige par af proteiner kan plukkes til at generere protein legering materialer med stærke vekselvirkninger og specifikke egenskaber, såsom ekstraordinær mekanisk elasticitet.

Generelt når protein A og B er valgt (her er de vilde silke og tamme silke), et protein legering løsning kan produceres i flere trin (Figur 4). For det første bør proteinkilder som naturlige fibre eller pulvere rengøres eller renses. For eksempel kunne en degummeringsproces bruges til at fjerne den opløselige silke Sericin proteiner belagt på de fleste silkefibroin fibre ^20. For det andet skal der findes til at opløse de uopløselige proteinkilder til løsninger et egnet opløsningsmiddel. For eksempel høj koncentration LiBr løsning er et godt opløsningsmiddel for at skære beta-sheet sekundære strukturer i forskellige silke og opløses fibrene til løsninger.For det tredje kan en dialyse fremgangsmåde anvendes til at fjerne det opløsende opløsningsmiddel og genvinde proteinmolekyler i en vandig opløsning. Yderligere centrifugering er ofte nødvendigt at fjerne urenheder og uopløste aggregater i opløsningen. Endelig kan forskellige protein vandige opløsninger blandes sammen forsigtigt med forskellige forhold. Derfor, hvis de to protein løsninger ikke har macrophase adskillelse, vil de blive blandet sammen med stærke vekselvirkninger og danne nyt protein legering system til forskellige biomedicinske anvendelser. For at gøre protein legerede materialer uopløselige i kroppen, kan forskellige fysiske eller kemiske tværbindingsbehandlinger tilpasses. For eksempel er det fundet, at høj temperatur og højt tryk vanddamp udglødning kunne utroligt tværbindinger forskellige silke eller elastin materialer ^6,52. Mens forskellige keratin materialer kan tværbindes ved deres naturlige disulfidbindinger i proteinet sidekæder ^53.

Når protein legering løsninger produceres og verificeres, kan de formes til en bred vifte af biomaterialer med justerbare egenskaber, herunder materielle matricer til termiske, mekaniske, optiske, elektriske, kemiske eller biomedicinske anvendelser (Figur 4). I denne artikel, at tre nye anvendelser for disse materialer demonstrere den unikke fordel af protein legering biomaterialer er blevet valgt (Figur 4). Gennem moderne mikro-fremstillingsteknik, kan forskellige overflade mønstre genereres på mikro eller nano-skalaer på protein legering materialer (Figur 4 optisk ansøgning). For eksempel, hvis en optisk diffraktionsmønster er produceret på filmens overflade, kan denne film, der anvendes som et medie til at overføre laserstråler i forskellige optisk mønster ^22,23. Hvis proteinet legeret materiale blev opstod i en enzymopløsning, kan nedbrydningen profil filmene forstås ved at sammenligne de realtid diffraktionsmønstre fra filmenmed det oprindelige mønster (i stedet for frem og tilbage vask og behandlingen af ​​de nedbrudte filmene i luften). En anden ny teknik er at belægge forskellige mikro-skala kredsløb og trådløse resonatorer på proteinet legering materialer (Figur 4 el-ansøgning). Gennem denne teknik, kan mikro-strømninger beskadigede væv eller organer in vivo skal overvåges, med trådløse signaler overføres direkte til lægerne ^24,51. Og materialet mekanisk sejhed og biodurability i kroppen kan let kontrolleres ved at blande nøgletal og specifikt protein komponenter af materialerne. Endelig kan forskellige opløselige eller uopløselige kræftlægemidler direkte indarbejdet i protein-legering materialer (Figur 4 kemisk ansøgning). Kræft medicin er ofte meget giftige, og vil skade ikke kun kræftcellerne, men også den normale menneskelige immunsystem. Derfor styrer regionen og dosis af cancer drug delivery per dag i kroppen er et than de vigtigste emner i den farmaceutiske videnskab. Gennem inkorporering kræftlægemidler til protein legering materialer, kan vi implantere materialet kun i kræft væv eller organer, og kontrollere frigivelseshastigheden af ​​kræft lægemiddel per dag fra protein legering netværk ved at kontrollere proteinkomponenterne og blandingsforhold. Da proteinet matrix er fuldstændigt biologisk nedbrydelige, vil protein legerede materialer fjernes automatisk af kroppens enzymer, efter at lægemidlet frigiver periode. Resterne af protein legerede materialer er rent aminosyrer, som kan absorberes af kroppen naturligt yderligere fremstille andre essentielle proteiner in vivo. Patienter, der bliver helbredt ved kontrolleret frigivelse af kræftlægemidler fra implanterede protein legering materialer vil endelig nyttiggøres uden tilsætningsstoffer i kroppen, og begge naturligt protein legering matricer og kræft medicin vil blive effektivt optages i kroppen i løbet af denne hærdeprocessen.

Figur 4. Generelle skridt til at producere et protein legering materiale, herunder rengøring eller rensning af protein væsentlige kilder, opløse de uopløselige protein materialer i løsninger, dianalysizing at fjerne det opløsende opløsningsmiddel fra et protein vandig opløsning, centrifugering og blande sammen med forskellige forhold, og fysiske eller kemiske tværbindingsbehandlinger. Proteinet legering løsning kan efterfølgende formes til en bred vifte af biomaterialer med justerbare egenskaber, herunder materielle matricer til termisk, mekanisk, optisk, elektriske, kemiske eller biomedicinske anvendelser. Klik her for at se en større version af dette tal.

Her viste vi de kritiske procedurer for, hvordan at fabrikere elektriske materialer på protei legeringer med detaljer i figur 5. Tynde metalliske film såsom elektriske kredsløb kan skabes ved hjælp af flere forskellige deposition teknikker, herunder fordampning, pulserende laser deposition, eller sputtering. Forstøvning blev udvalgt til den aktuelle undersøgelse, da det giver en betydelig fleksibilitet for energien af ​​de forstøvede arter gennem justering af sputtering gastryk og effekt, der tilføres katoden samt aflejring ensartethed gennem justering af gastrykket og katoden størrelse. Sputterbelægning kan anvendes til at projicere en metallisk film på et glassubstrat (figur 5A). I dette tilfælde blev Ag kredsløb film deponeres i et højt vakuum kammer med en base tryk på omkring 1 x 10 ^-7 torr. Ar sputtering gas blev indført i kammeret ved et tryk på 20 mTorr og Ag blev aflejret ved hjælp af en RF-generator 100 W i 20 minutter fra en 2-tommers planmagnetron katode, der er 8 cm fra substratoverfladen. Enheder er defined anvendelse af almindelige fotolitografiske teknikker i filmene på glas efterfulgt af våd kemisk ætsning (se detaljeret procedure i figur 5A). Enheder kan også defineres ved aflejring gennem en fysisk maske direkte på protein film. Rumtemperaturen elektriske resistivitet i de elektriske kredsløb på protein film blev målt ved hjælp af både to-terminale og fire-terminale teknikker. Fordelen ved fire-terminale fremgangsmåde er at eliminere kontakt modstand fra målingen, men vi finder, at kontaktmodstanden ikke er væsentlig, så et to-terminal måling er tilstrækkelig. De to terminale målinger anvender en god kvalitet multimeter indstillet på ohm skala får kontakt med filmen ved begge ender af metaltråden (skematisk vist i figur 5B). I denne måling multimeter fungerer både som en strømkilde og et voltmeter og den målte modstand er den spænding divideret med strømmen. Modstanden beregnes ved hjælp afρ = RA / l, hvor R er modstanden, A er tværsnitsarealet af tråden og l er afstanden mellem prober. For oprettet her, blev R målt til at være 23,5 Ω ved hjælp af hældningen af spændings-strøm-kurven i figur 5B (R = ΔVoltage / ΔCurrent), L er 4,45 x 10 ^-2 m og A blev fundet at være 6,685 x 10 ^-10 m ^2. Ved hjælp af disse tal blev en resistivitet på 3,6 x 10 ^-7 Ω · m fundet til filmene ca. 20x større end for størstedelen sølv metal (1,6 x 10 ^-8 Ω · m). En højere resistivitet målt i film i forhold til hovedparten er typisk på grund af den allerede begrænset strømvej og den manglende evne af ladningsbærere for at undgå defekter. Opvarmning af metal med en varmepistol øget sin modstand indikerer en stigning i antallet af elektron spredning af fononer karakteristiske for metallisk ledning.

Figur 5. (A) Procedure for at gøre elektriske kredsløb på protein legering film (her sølv kredsløb på vild tussahsilke og morbær silke blanding film som et eksempel): (a) Ubelagt objektglas; (B) Sølv plasma under sputterbelægning fra et mål i diameter 2 mund; (C) Sølv belagt objektglas; (D) Sølv belagt prøve afholdt til spinneren ved hjælp af vakuum borepatron, før du tilføjer fotoresisten; (E) Sølv objektglas overtrukket med fotoresist blev sat i ovnen til blød-bage ved 120 ° C; (F) udsættes for UV-stråling til at bryde de polymere obligationer i fotoresisten; (G) at udvikle fotoresisten; (H) Hard-bage den modstå at forberede sig til ætsning i syre; (I) Etch i syren, og derefter standse ætsningen ved skylning i et vandbad; (J) Tør dias; (K) Cast protein legering løsning på dias; (L) Overførsel sølv mønstre til den tørrede protein filmen. (B) -7 Ω · m, ca 20x større end for bulk-sølv metal. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6. Termisk analyse model, der anvendes til at kontrollere blandbarhed blandet protein system. Hvis protein A og B har individuelle enkelt glasovergangstemperaturer og T _g (A) og T _g (B), henholdsvis (grønne og blå kurver), et fuldt blandbar protein-legering Systemet viser kun ét glas overgang forskellig fra _Tg S for A og B (rød kurve). Ellers proteinets er blandbare blandinger med både _Tg (A) og _Tg (B) (sorte kurve) eller delvis blandbare kompositmaterialer med to flyttet glasovergange (orange kurve).

Discussion

En af de mest kritiske procedurer producere "legering" protein er at kontrollere blandbarheden af ​​de blandede proteiner. Ellers er det kun en ikke-blandbar proteinblanding eller protein sammensat system uden stabile og afstemmelige egenskaber. En eksperimentel termisk analyse metode kan bruges til dette formål og til at bekræfte deres legering egenskaber. Protein-protein-interaktioner kan ses ifølge Flory-Huggins s gitter model ⁴⁸ vekselvirkninger mellem "opløsningsmiddel" (den dominerende proteinkomponent) og "opløste" (den mindre proteinkomponent). Baseret på denne model, fri ændring energi under blanding mellem "opløsningsmiddel" og "opløste" regulerer blandbarheden af blandingen ^48. Generelt er der tre forskellige grader af blandbarhed: (a) fuldt blandbar (formular én-fase materiale makroskopisk), (b), metastabile (formular semi-blandbare faser i materialet), og (c) ikke-blandbare (forbliver oprindelige to-faser med individuel protein A og B-domæner) ^3,48. Tilsvarende kan glasovergangstemperaturen adfærd af et to-protein-systemet kan påvise disse forskelle og ideelt udtrykkes ved anvendelse af et fasediagram model (figur 6). For eksempel, hvis protein A og B har deres individuelle single glasovergangstemperaturer, _Tg (A) og _Tg (B) (figur 6 grønne og blå kurver), bør et fuldt blandbar protein legering systemet kun viser én glas overgang under opvarmningen. Denne enkelt glasovergangstemperatur normalt mellemprodukt mellem _Tg s af A og B (figur 6). Ellers kan proteinerne danner en ikke-blandbar blanding, hvorved både _Tg (A) og _Tg (B) vises i deres oprindelige positioner (figur 6). Proteinerne kan også danne en semi-blandbar system, som to forskudt glas transitioner (figur 6). Et praktisk eksempel på fuldt blandbar protein "legering"-system (formular et glas overgang) kan findes i DSC-scanninger af silke-tropoelastin blanding prøver i figur 4 (termisk ansøgning) ^9. Med faldet i silke indhold Glasovergangstemperaturerne (T _g) i blandinger steg gradvist fra 178 ° C (ren silke) til 190 ° C (ren tropoelastin) ^9, men konsekvent holde en homogen enkelt glas overgang for alle typer af blander. Ifølge Flory-Huggins model, indikerer dette, at alle silke-tropoelastin blandinger af forskellige blandingsforhold er stabile og er fuldt blandbare protein legeringer uden nogen macrophase separationer.

Som konklusion kan nye generationer af protein legering materialer produceres og fremstilles i forskellige medicinsk udstyr (f.eks, film, suturer, skruer, plader, mikro-nåle, geler), med kontrollerede og tunble optiske, elektriske, kemiske, termiske og mekaniske egenskaber. Gennem styre blandingen komponenter og nøgletal, forskellige biofysiske egenskaber af protein legering materialer, såsom elasticitet, styrke, overfladeruhed, overflade ladning, biodurability og kemiske aktivitet, kan manipuleres, hvilket i sidste ende kan påvirke væv funktioner samt den lokale cellulære adfærd forbundet med disse materialer. Derudover, på grund af arten af proteiners programmerbar levetid in vivo bliver en levedygtig platform for disse legerede materialer. Sådanne fordele kunne give nye muligheder for implantabelt medicinsk udstyr i fremtiden, hvor stillingen reparation kirurgisk hentning kan undgås. Disse protein-legering biomaterialer vil også tilbyde en ny vej til at producere medicinsk udstyr med justerbare biologiske funktioner og egenskaber, og med matchende væv overholdelse og relaterede behov. Denne artikel giver en generel protokol anmeldelse af, hvordan at fremstille disse enheder, ogville gavne både forskere og kliniske læger i flere biomedicinske områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Q100 Differential Scanning Calorimeters (DSC)	TA Instruments, New Castle, DE, USA	N/A	You can use any type of DSC with a software to calculate the heat capacity.
SS30T Vacuum Sputtering System	T-M Vacuum Products, Inc., Cinnaminson, NJ, USA	N/A	With custom built parts; you can use any type of sputtering system to coat.
VWR 1415M Vacuum Oven	VWR International, Bridgeport, NJ, USA	N/A	You can use any type of vacuum oven to physically crosslink the samples.