Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов

Published: January 19, 2015 doi: 10.3791/52474
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, University of Padova, 2The RNA Institute, SUNY Albany

Abstract

РНК или ДНК складывают стабильной трехмерной складывания интересные цели в разработке противоопухолевых или противовирусных препаратов. В случае ВИЧ-1, вирусные белки, участвующие в регуляции вирусной активности распознать несколько нуклеиновых кислот. Нуклеокапсид белок NCp7 (NC) является ключевой белок регулирования несколько процессов в ходе репликации вируса. NC на самом деле компаньонка дестабилизации вторичных структур РНК и ДНК, и облегчение их отжига. Инактивация ЧПУ новый подход и интересной мишенью для терапии анти-ВИЧ. Н ucleocapsid nnealing- М ediated Е lectrophoresis (имя) был разработан анализ для идентификации молекул, способных ингибировать плавление и отжиг РНК и ДНК, сложенный термодинамически стабильных трехмерный конформации, например, шпильки структур смолы и cTAR элементов ВИЧ, путем нуклеокапсида белков ВИЧ-1. Новый анализ использует либо повторноcombinant или синтетический белок, и олигонуклеотиды, без необходимости их предыдущего маркировки. Анализ результатов достигается за счет стандартного электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с последующим обычным окрашивания нуклеиновой кислоты. Протокол сообщил в этой работе описывается, как выполнить имя анализа с полноразмерного белка или его усеченной версии не хватает основной N-концевой домен, как компетентный, как нуклеиновые кислоты сопровождающих, и как оценить ингибирование шаперонов деятельности НК по резьбы интеркалятора. Кроме того, имя может быть выполнена в двух различных режимах, полезно получить указания на предполагаемого механизма действия определенных ингибиторов с ЧПУ.

Introduction

Нуклеокапсид белок NCp7 (NC) вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) представляет собой небольшой, основной белок, который тесно связанный с геномной РНК в зрелом инфекционного вируса, играя ключевую роль в репликации вируса в качестве кофактора во время обратной транскрипции признание генома, и упаковка. 1-3 NC действует как шаперона нуклеиновых кислот, катализирующего дестабилизации стабильных структур нуклеиновых кислот и отжиг комплементарных последовательностей. Его нуклеиновой кислоты агрегирования активность находится в основном в 11 аминокислот N-концевой домен, а дуплекс дестабилизации активность была отображается на его цинковых пальцев структур (12-55 пептид). 4 положительно заряженный белок снижает электростатический барьер реакции отжига и увеличивает скорость, с которой два отдельных комплементарные последовательности собрались.

Нуклеиновые кислоты сложенные в стабильном конформации требуют сопровождающего деятельность ЧПУ на facilitatе их отжига 5 Это особенно важно в обратном транскрипции, в котором ЧПУ имеет решающее значение в событиях перенос цепи:. в передаче минус нити, минус цепь ДНК, остановки, только retrotranscribed, должны быть переданы, и отожженного с комплементарной последовательностью в области R в 'конце РНК-генома 3 шаблона. 6 Хотя термодинамически выгодным, эта реакция не происходит широко в отсутствие NC-за наличия стабильной структуры транс активации реагировать района (ТАР) РНК в регионах R, которые должны быть связаны с его ДНК-копии (cTAR ДНК). 7 cTAR и TAR, на самом деле, хорошо структурированный регионов с характерным Шпилька конформации. NC белка денатурации эти шпильки, а также способствует минус-нить передачу, увеличивая скорость межмолекулярного отжига между комплементарными нитями нуклеиновых кислот. Механизм НК отжига смолы и cTAR была тщательно исследована и де-описано, как деготь отжига анализа в нескольких научно-исследовательских работ и предложенная схема изображена на отличные отзывы. 8-11 Подводя итог, NC дестабилизирует вторичную структуру стабильной РНК, таких как TAR-РНК, дестабилизирует вторичную структуру ее комплементарной последовательностью, cTAR-ДНК и способствует реакции отжига РНК / ДНК, ведущую к TAR / cTAR гетеродуплексным формирования. 10,11 В результате шаг нити переноса в процессе репликации ВИЧ способствует. 12

NC является привлекательной мишенью для разработки новых противовирусных средств, так как потенциальные помехи, индуцированный небольших молекул по отношению к NC приведет к уменьшению обратной транскрипции вирусного генома, как следствие под угрозу активности НК. 2,13 Такой подход может в конечном счете, привести к развитию успешных анти-ВИЧ агентов. В ходе скрининга для ЧПУ ингибиторы 14 мы разработали анализ, опираясь на хорошо известных свойствнуклеокапсидного эффективно дестабилизировать и отжига комплементарных олигонуклеотидов. 10,11 Мы назвали это N ucleocapsid nnealing- M ediated E lectrophoresis (имя) анализа. НАИМЕНОВАНИЕ анализе используют NC опосредовать отжиг между шаблоном стабильно копий дополнительных нуклеиновых кислот, в нашем случае олигонуклеотида, соответствующего апикальной части последовательности ТАР-РНК с ее комплементарной последовательностью ДНК (cTAR) с получением гибридом смолы / cTAR гетеродуплекс , Анализ TAR cTAR реакции / отжига в присутствии НК могут быть исследованы с помощью электрофореза родной полиакриламидном геле (ПААГ).

Этот протокол показывает, как выполнить имя анализа для быстрого отжига при комнатной температуре олигонуклеотидов сложенными в стабильных шпильки структур, как анализировать результаты реакции и возможного устранения неполадок эксперимента. Радиоактивное мечение нуклеиновой кислоты не требуется, и Детективна олигонуклеотидных полос могут быть выполнены с помощью обычных методов окрашивания. Анализ, который использует либо рекомбинантный белок полной длины или укороченный синтетический вариант NC, позволяет идентифицировать заправки интеркаляторами ингибирующих NC, деятельность коррелирует с сильным связыванием с ДНК и РНК. 14

Protocol

1. Подготовка материала, нуклеиновых кислот и белков

  1. Нуклеиновых кислот
    1. Автоклав трубы 1,5 мл и хранят их в стерильный контейнер. Выполните каждый шаг, используя стерильные наконечники фильтр для устранения загрязняющих агентов, то есть нуклеазы лабораторных расходных материалов.
    2. Подготовка Трис-HCl 10 мМ буфера с рН 7,5 в DEPC обработке воды и профильтровать раствор с размером фильтра 0,22 мкм пор.
    3. Примечание: олигонуклеотид называют "смол" соответствует короткой (29-мер) последовательности РНК 5'-GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC-3 '15, а cTAR является ДНК комплементарна последовательность 5'-GGCAGAGAGCTCCCAGGCTCAGATCTGCC-3'.
      1. Растворения как смолы и cTAR в Трис-буфере вышеупомянутого (1.1.2.), Чтобы сделать 100 мкМ исходных растворов. Магазин cTAR раствор при -20 ° С (аликвоты можно хранить в течение нескольких месяцев в этих условиях). Для долгосрочного хранения РНК, сделать 20 мкл аликвоты гудронаМаточный раствор, высушить Каждую аликвоту с помощью вакуумного концентратора центрифуги и хранить их при температуре -80 ° С. Свежий перед употреблением, ресуспендируют каждый TAR аликвоту в 20 мкл DEPC обработке воды.
        Примечание: Рабочая TAR аликвоты можно хранить при -20 ° С в течение двух недель.
  2. NC белка и (12-55) NC пептид
    1. Подготовка полной длины рекомбинантного белка NC, как сообщалось. 16 магазин раствор в аликвотах при -20 ° С. Определить точную концентрацию белка с UV-VIS спектрофотометр, используя коэффициент экстинкции при 280 нм 6410 М -1 см -1.
    2. Ресуспендируют синтетические (12-55) NC пептид в трис-HCl 10 мМ, рН 7,5 и хранить маточного раствора в аликвотах при -20 ° С. Определение правильной концентрации пептида на UV-VIS спектрофотометра с использованием коэффициента экстинкции при 280 нм 5700 М -1 см -1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (12-55) NC пептид был получен ВЭЖХ очищенный и lyophинвариантны из раствора, содержащего два эквивалента хлорида цинка.
  3. Соединение 1
    1. Весить около 1 мг лиофилизированного соединения 1, с использованием аналитических весов и растворить его в 100 мкл 100% ДМСО, кстати взвешенных, чтобы получить высокую концентрацию (≈10 мМ исходного раствора). Определить точную концентрацию соединения на UV-VIS спектрофотометр, используя его коэффициент поглощения (при 354 нм: 11387 M -1 см -1). Храните маточного раствора в темноте при -20 ° C до использования.

2. Настройка геля аппарата и литья геля

  1. Чтобы настроить гель, промойте две пластины (один длинный и один короткий) с 70% этанола, дайте им высохнуть, а затем поместите два 1 мм проставки вдоль длинных краев долгосрочной пластины; покрыть ее с короткой пластиной и убедитесь, что для выравнивания двух пластин в нижней части.
  2. Чтобы привести гель, следуйте инструкциям, приведенным в суппЛир (различные поставщики используют несколько иной аппаратуры, а также сэндвич-зажимы и стеки, предоставленных каждой литейной машины). Во всех случаях, убедитесь, что зажимы, стеки и прокладки чистые, и удалить следы акриламида, оставленные предыдущими пользователями.
  3. Поместите бутерброд собранный гель в литейной стенде и следуйте инструкциям по от поставщика.
    Примечание: Обычно чистой силиконовой прокладки в нижней части паза литья обеспечивает хорошее уплотнение и помогает избежать утечек при заливке гелем.
  4. Чтобы проверить на герметичность, залить дистиллированную воду с помощью пипетки между стеклянными пластинами. Добавить воду, чтобы бутерброд и подождать несколько минут, чтобы убедиться, что нет утечки не происходит. Если сэндвич собрана правильно, удалить воду и вставить фильтровальную бумагу между двумя стеклами, чтобы высушить очки. Извлеките бумагу и теперь бутерброд готов для литья геля.
  5. Налейте гель при комнатной температуре (RT, 25 ° С). С полиакриламидном очень нейротоксическое, наденьте перчатки. Наме непрерывные 12% полиакриламидном геле в неденатурирующем (родных) условиях для выполнения NAME анализа.
    1. Приготовьте раствор геля 12%: смешать 12 мл 40% акриламида / бис-акриламида (19/1) раствора 4 мл КЭ 10x буфер (10х: Трис-HCl, 890 мМ, 890 мМ борат, ЭДТА, 20 мМ) и 24 мл воды MilliQ , Добавить 400 мкл APS и 50 мкл TEMED непосредственно перед использованием. Смешайте раствор и быстро использовать пипетку, чтобы вылить раствор вниз между стеклянными пластинами. Представьте гребень между стеклянными пластинами, избегая пузырьков. Добавить раствора геля, чтобы полностью заполнить бутерброд.
  6. Пусть гель полимеризации в течение 45 мин до 1 ч. Непосредственно перед загрузкой образца, удалить гребень медленно и промыть лунки тщательно дистиллированной водой.
  7. После стадий полимеризации и промывки скважин, следовать инструкциям поставщиком разместить сэндвич гель в устройстве для электрофореза гель вертикальной. Если система охлаждения присутствует, убедитесь, что для установки системы гель в корпрямоугольник положение охлаждения сердечника.
  8. Если система предназначена для обработки более одного гель, но только один гель должен быть запущен, прикрепить бутерброд с применением гел, как буферной плотины на охлаждающий сердечник с другой стороны, чтобы сформировать полную верхнюю камеру буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: если плотина находится не правильно, верхний буфер будет течь, возможно, остановки гель перспективе.
  9. Подготовьте 2,5 л КЭ работает буфера (1х: Трис-HCl 89 мМ, боратного 89 мМ, ЭДТК 2 мМ) в деионизированной воде. Отделил около 500 мл КЭ буфера для верхней палаты буфера и залить оставшуюся в нижней буферной камеры. Налейте оставшееся 500 мл TBE буфера в верхней палате буфера.
  10. Поместите крышку на верхней части нижней буферной камере, так что анод и катод находятся в соответствующем положении.
  11. Подключите охлаждения активной зоны, если они присутствуют, к водопроводному крану с помощью шлангов. Заполните сердечник с водопроводной водой, которые будут действовать в качестве теплоотвода при электрофорезе, и пусть водопроводная вода циркулирует через активную зону при избранныхrophoresis.

3. нуклеокапсидные отжига опосредованного электрофореза (NAME) Анализ

  1. Подготовка буферов
    1. Подготовка TNMg буфера (1x: Трис-HCl 10 мМ, NaCl, 20 мМ, Mg (ClO 4) 2 1 мМ, рН 7,5) в DEPC-обработанной воды, и фильтруют раствор с размером фильтра 0,22 мкм пор.
      Примечание: TNMg буфера можно хранить при температуре 4 ° С до 7 дней. Для достижения наилучших складных и отжига результатов, мы рекомендуем использовать свежеприготовленные буферов.
    2. Подготовка гель загрузочного буфера, содержащий SDS (SDS GLB: Трис-HCl 100 мМ, ЭДТК 4 мм, 50% вес / объем глицерина, 2% вес / об SDS, 0,05% вес / об бромфенола синего) в DEPC-обработанной воде.
      Примечание: GLB позволяет отслеживать, насколько образцы олигонуклеотиды работает в системе гель и позволяет погружаться образцы в гель. Добавление СДС точная нижняя грань является важным шагом для оптимального успеха NAME анализа. Если этот шаг не следует, это не возможно отличить нуклеиновых кислот полоса в Geл система (рисунок 2).
  2. Управление подготовки
    1. Развести последовательно олигонуклеотидов растворы и использовать свежеприготовленные растворы 10 мкм, чтобы приготовить 10 мкл 1 мкМ раствора ТАР. Подготовьте таким же образом, отдельно, 10 мкл 1 мкМ cTAR в TNMg 1x буфера. Тепло каждую пробирку до 95 ° С в течение 5 мин, а затем дать остыть до комнатной температуры для того, чтобы смолы и cTAR предположить их структуры стволовых выпуклость контура.
    2. Подготовка 1 мкМ раствор гибрид TAR / cTAR в качестве контроля. Смешайте 1 мкл 10 мкМ ТАР с 1 мкл 10 мкМ cTAR в TNMg 1x, в общем объеме 10 мкл. Денатурации олигонуклеотидов путем нагревания пробирки до 95 ° С в течение 5 мин и оставить его медленно охлаждают до комнатной температуры для того, чтобы ТАР для отжига с ее комплементарной последовательностью cTAR и образуют двухцепочечную гибридный смолы / cTAR.
    3. Когда растворы охлаждают до комнатной температуры, выполнить короткого отжима центрифугированием. Добавить 3 мкл GLB SDS, пипетки ВАСч раствор внутри трубки 3 раза и положить трубку на льду. Хранить контрольные образцы устойчивый на льду до шаге нагружения.
  3. Подготовка пробы для анализа NC белка и (12-55) NC пептида деятельность
    1. Использование 2,5 мкл свежеприготовленного 4 мкМ олигонуклеотида раствора для каждого образца. Всегда готовьте немного избыточное количество каждого раствора, чтобы предотвратить ошибки пипетки. Сложите 32,5 мкл 4 мкМ раствора смолы и, отдельно, из cTAR в TNMg 1x буфере, как сообщил по подготовке элементов управления вышеупомянутого (шаг 3.2.1.).
    2. Развести исходного раствора белка, так и NC (12-55) NC пептида 80 мкМ раствора с MilliQ воды.
    3. Когда решения TAR и cTAR охлаждают до комнатной температуры, выполнить короткий спин центрифугирования в обеих трубках и начать подготовку образцов труб.
    4. Подготовка 12 пустых 0,5 мл автоклавного трубы. Поместите 3 строки 4 трубок в стойку для образцов лаборатории. Каждая строка указывает, соответственно, пробы для анализа йе полнометражный NC белка, образцы без белка и образцы для анализа (12-55) NC пептид активностью.
    5. Всегда заменяйте советы в любое время используется отличается реагент.
    6. Добавить в каждую пробирку 2,5 мкл сложенном смолы и 2,5 мкл сложенном cTAR. Добавить 4 мкл DEPC-очищенной воды в образцах для анализа НК и части (12-55) Северная Каролина. Добавить 5 мкл DEPC-обработанной воды в других образцах.
    7. Добавить 1 мкл 80 мкМ ЧПУ или 1 мкл 80 мкМ (12-55) NC к образцам для, соответственно, NC или (12-55) NC анализ.
    8. Добавить сразу 3 мкл SDS GLB к образцам времени 0 мин (зарегистрированных в 0 'на фиг.1), пипетки раствор внутри каждой пробирки 3 раза, и, наконец, положить трубку на льду. Повторите этот шаг для всех образцов и контролей. Хранить образцы устойчивый на льду до шаге нагружения.
    9. Через 15 мин, 30 мин и 1 ч инкубации при комнатной температуре, добавляют 3 мкл SDS GLB, пипетки раствор внутри ВАСч трубка 3 раза и положить трубку на льду. Повторите этот шаг для всех образцов и контролей, соответственно, и не держать на льду пока шаге нагружения.
    10. Удалить крышку устройства гель. Нагрузка 13 мкл каждого образца в лунки, образованные, как описано ранее методом литья гель с хорошо образующей гребня. Загрузите образцы в соответствии с порядком сообщил на рисунке 1.
    11. Заменить крышку устройства гель. Прикрепите провода аппарата гель к источнику питания. Проверьте, что электроды подключены в правильные слоты в блоке питания.
    12. Включить питание и запустить гель в течение 2 ч и 30 мин при постоянном напряжении 200 В, до тех пор, пока краситель мигрировали до 1,5 см выше дна геля.
  4. Подготовка образцов для анализа антрахинона деятельность на НК и (12-55) NC
    1. Развести исходного раствора соединения 1. Подготовка 10 мкл 500 мкМ, 250 мкМ, 50 мкМ, 5 мкМ разбавление соединения <STRONG> 1 в MilliQ воды.
    2. Подготовка контрольных образцов, как сообщалось выше (пункт 3.2.).
    3. Использование 2,5 мкл свежеприготовленного 4 мкМ олигонуклеотида раствора для каждого образца. Всегда готовьте немного избыточное количество каждого раствора, чтобы предотвратить ошибки пипетки. Сложите 27,5 мкл 4 мкМ раствора смолы и, отдельно, из cTAR в TNMg 1x буфере, как выше (шаг 3.2.1.).
    4. Развести исходного раствора белка, так и NC (12-55) NC пептида 80 мкМ раствора в воде.
    5. Когда решения TAR и cTAR охлаждают до комнатной температуры, выполнить короткий спин центрифугирования в обеих трубках и начать подготовку образцов.
    6. Подготовка 20 пустых 0,5 мл автоклавного трубы. Поместите 2 строки по 10 пробирки, каждая в стойке для образцов лаборатории.
    7. Всегда заменяйте советы в любое время используется отличается реагент.
    8. Добавить каждый трубку первой строке с 2,5 мкл сложенном ТАР. Добавьте каждый тюбик втором ряду с 2,5 мкл сложенном cTAR.
      9. 1 разбавления (увеличение концентрации от 5 мкм до разбавления 500 мкм) в Тар и cTAR. Замените соединения с водой в образцах для анализа НК и (12-55) NC в отсутствие соединения. Инкубируйте образцы в течение 15 мин при комнатной температуре.
    9. После 15-минутной инкубации, смешать образцы cTAR (трубы второго ряда) с корреспондентом TAR образцов (трубы первого ряда).
    10. Добавить 1 мкл 80 мкМ ЧПУ или 1 мкл 80 мкМ (12-55) NC к образцам для NC или (12-55) NC анализа, соответственно.
    11. После 15-минутной инкубации, добавить 3 мкл GLB SDS, пипетки в каждую пробирку 3 раза и положить трубку на льду. Повторите этот шаг, соответственно, с использованием образцов для НК и (12-55) NC анализа. Хранить образцы устойчивый на льду до шаге нагружения.
    12. Удалить крышку устройства гель. Загрузка 13 мкл каждого образца в лунки. Загрузите образцы после того, сообщили в рисЮр 3B.
    13. Заменить крышку устройства гель. Прикрепите провода аппарата гель к источнику питания. Проверьте, что электроды подключены в правильные слоты в блоке питания.
    14. Включить питание и запустить гель в течение 2 ч и 30 мин при постоянном напряжении 200 В, до тех пор, пока краситель мигрировали до 1,5 см выше дна геля.
  5. Подготовка образца олиго-инкубация режим против режима NC-преинкубационного
    1. Развести соединение 1 раствор. Подготовка 10 мкл 500 мкМ, 250 мкМ, 50 мкМ, 5 мкМ разбавление соединения 1 в MilliQ воды.
    2. Подготовка контрольных образцов, как сообщалось выше (пункт 3.2.).
    3. Использование 2,5 мкл 4 мкМ раствора олигонуклеотида для каждого образца. Всегда готовьте немного избыточное количество каждого раствора, чтобы предотвратить ошибки пипетки. Сложите 27,5 мкл 4 мкМ раствора смолы и, отдельно, из cTAR в TNMg 1x буфере, как выше (шаг 3.20,1.).
    4. Развести исходного раствора белка, так и NC (12-55) NC пептида 80 мкМ раствора в воде.
    5. Когда решения TAR и cTAR охлаждают до комнатной температуры, выполнить короткий спин центрифугирования в обеих трубках и начать подготовку образцов.
    6. При замене подсказки каждый раз реагенты изменены или любая другая жидкость или раствор, содержащийся в реакционной трубе прикосновении.
    7. С этого шага на убедиться, что четко маркировать и разделять образцы для двух различных процедур предварительной инкубации.
      1. Режим олиго-инкубация
        1. Подготовка 10 пустых 0,5 мл автоклавного трубы. Поместите 2 строки 5 трубок в стойку для образцов лаборатории.
        2. Добавить в каждую пробирку первой строки 2,5 мкл сложенном ТАР. Добавить в каждую пробирку второго ряда 2,5 мкл сложенном cTAR.
        3. Добавить 2 мкл соответствующего соединения 1 разбавления (увеличение концентрации от 5 мкм до разбавления 500 мкм) в Тар и cTAR.Замените соединения с водой в образцах для анализа НК в отсутствие соединения. Инкубируйте образцы в течение 15 мин при комнатной температуре.
        4. После 15-минутной инкубации, взять образцы cTAR (второй ряд) и положить их с образцами корреспондент TAR (первый ряд).
        5. Добавить 1 мкл 80 мкМ NC к каждому образцу и инкубировать образцов в течение 15 мин при комнатной температуре.
        6. После 15-минутной инкубации, добавить 3 мкл GLB SDS, пипетки в каждую пробирку 3 раза и положить трубку на льду. Хранить образцы устойчивый на льду до шаге нагружения.
      2. NC-инкубация режим
        1. Подготовка 5 пустых 0,5 мл автоклавного пробирки и поместите их в стойку для образцов лаборатории.
        2. Добавить в каждую пробирку 4 мкл соответствующего разведения соединения 1 (увеличении концентрации от 5 мкм до разбавления 500 мкМ). Замените соединения с водой в образцах для анализа НК в отсутствие соединения.
        3. Добавить в каждую пробирку 1 мкл 80 μ; М NC и инкубировать образцов в течение 15 мин при комнатной температуре.
        4. Смешайте 15 мкл сложенном ТАР с 15 мкл сложенном cTAR в пробирку и использовать это решение ТАР + cTAR в следующей стадии.
        5. После 15 мин инкубации, добавление каждого образца 5 мкл раствора смеси ТАР + cTAR и инкубировать образцов в течение 15 мин при комнатной температуре.
        6. После 15-минутной инкубации, добавить 3 мкл GLB SDS, пипетки в каждую пробирку 3 раза и положить трубку на льду. Хранить образцы устойчивый на льду до шаге нагружения.
          ПРИМЕЧАНИЕ: С шагом 3.5.8 на, анализ может быть выполнен со всеми образцами (резюме от 3.5.7).
    8. Удалить крышку устройства гель. Загрузка 13 мкл каждого образца в лунки. Загрузите образцы в соответствии с порядком сообщил на рисунке 4.
    9. Заменить крышку устройства гель. Прикрепите провода аппарата гель к источнику питания. Проверьте, что электроды подключены в правильные слоты в электроэнергетике, Supplу.
    10. Включить питание и запустить гель в течение 2 ч и 30 мин при постоянном напряжении 200 В, до тех пор, пока краситель мигрировали до 1,5 см выше дна геля.

4. Удаление геля и гель окрашивание

  1. После электрофореза, выключите питание и отсоедините электрические провода. Выключите водопроводный кран системы охлаждения и отсоединить шланги от ядра.
  2. Снимите крышку, и, если система охлаждают, удалить охлаждения активной зоны и слейте буфер из обеих палат.
  3. Аккуратно разобрать бутерброд гель от устройства и снимите все зажимы из стеклянных пластин. Чтобы удалить гель из пластин, нажать одну из прокладок из-за боковой пластин и крутить его аккуратно вытащить вверх и в сторону верхней стеклянной пластиной. Возьмите два угла геля и поднимите ее осторожно, чтобы удалить его из стекла.
  4. Поместите гель в подходящую емкость с желаемым нуклеиновых кислот окрашивания раствора для30-45 мин при перемешивании.
  5. После окрашивания, поместить гель в системе формирования изображения для обнаружения трансиллюминатор нуклеиновых кислот сигнала флуоресценции в системе гель.

Representative Results

Рисунок 1 показывает характерный результат, нуклеокапсида отжига опосредованного электрофореза (Имя) анализа, выполняется I) с полноразмерным рекомбинантным белком, б) без белка, т.е. смешивания cTAR + TAR и инкубации до 1 часа при комнатной температуре, и III ) тот же анализ проводили с (12-55) NC, синтетического пептида хватает на 11 аминокислот N-концевого домена. Предварительно сложить смолы и cTAR смешивали и формирование отожженном гетеродуплексным ТАР / cTAR был проверен в присутствии полноразмерного рекомбинантного NC (левых полос фиг.1), в отсутствие белка (центральные полосы на фиг.1 ), и в присутствии усеченного (12-55) NC пептид (правых полосах на фиг.1). Органы управления: сложить cTAR, сложил TAR, и отжигают гибридный (TAR / cTAR), полученные в результате термического денатурации стабильно складчатых структур смолы, с cTAR с их последующим медленным annealinг. 14

Способность NC для денатурации два устойчивых последовательностей нуклеиновых кислот в расширенной гетеродуплексным спирали ясно видно: полнометражный NC белок немедленно приводит к образованию смолы / cTAR гибрид: 0 »указывает минимальное время, которое проходит с добавлением NC на Образцы и добавление гель загрузки буфера, который останавливает реакцию; завершение формирования уже достигнута после 15 "время инкубации. Увеличение интенсивности отожженного гетеродуплекса параллельно с уменьшением интенсивности складчатых cTAR и TAR олигонуклеотидов. Гетеродуплексный образование достигается также в присутствии в усеченном виде, то есть (12-55) NC, подтверждающие биологическую активность синтетического пептида. В отсутствие белка или пептида гетеродуплексный образование не наблюдается, и смолы и cTAR олигонуклеотидов не отжига при комнатной температуре в гетеродуплексе (рисунок 1). ВВсе эксперименты, быстрое образование нестабильных промежуточных («промежуточных комплексов" на Рисунке 1), которые с течением времени снижение наблюдается, последовательно с предложенного механизма обмена нити через шпильки cTAR и TAR до правильные нуклеиновые кислоты складывания. 17

Возможно устранение неполадок эксперимента является отсутствие SDS в гель загрузки буфера. При отсутствии паспорта безопасности в GLB результат реакции показана на рисунке 2 и по сравнению с итогами с GLB + SDS. Предварительно сложить смолы и cTAR смешивали и инкубировали в течение 3 ч при комнатной температуре в течение 3 ч при 37 ° С с рекомбинантного полноразмерного белка NC. По окончании инкубации образцы были разделены на две: с одной половины гель загрузочным буфером SDS (без GLB) был добавлен, в то время как в другой половине GLB был с SDS (SDS) GLB. Образцы наносили на гель, и положение нуклеиновых кислот полос визуализировали после гель управляетОкрашивание красителем. При NC присутствовал, но образцы были загружены GLB, все нуклеиновые кислоты полосы сдвигается вверх: это, как ожидается, и показывает сильное связывание между белком и нуклеиновыми кислотами. Результаты с GLB SDS показаны в крайнем правом геля: добавление SDS денатурации белка и высвобождает нуклеиновых кислот из стабильного комплекса с белком, позволяя сравнению с контролем.

НАИМЕНОВАНИЕ анализ используют для оценки способности резьбы интеркаляторы для стабилизации динамических структур нуклеиновых кислот и ингибируют активность шаперона NC. 14 с потоками интеркаляторы собой плоские ароматические молекулы, замещенные громоздких боковых цепей, расположенных на противоположных участках кольцевой системы, такие как антрахинон показано на рисунке 3А. 18 Эти интеркаляторы способны нить через двойной спирали нуклеиновых кислот, наконец, размещения их в боковые цепи в каждом пазу дваждыспираль. 19,20

3В показывает результат Имени анализа в присутствии соединения 1, известного резьбы интеркалятора, 18 в присутствии полноразмерного NC или усеченного пептида. В обоих случаях, образование гибрида ТАР / cTAR НК уменьшается при увеличении концентрации интеркалятора, в то время как, в то же время, количество свободного смолы и cTAR возрастает. Укороченная форма белка, лишенного N-концевой хвост (12-55NC) является более чувствительным к ингибированию ее активности: эта разница была проверена с всех протестированных соединений до сих пор.

НАИМЕНОВАНИЕ анализ может быть выполнен двумя способами, либо путем предварительного инкубирования испытуемое соединение с ЧПУ, с последующим добавлением сложенных олигонуклеотидов (режим NC-инкубация), или путем предварительной инкубации испытуемое соединение в течение 15 мин при сложенных субстратов нуклеиновых кислот , с последующим добавлением NC и дальнейшей инкубации в течение 15 мин (олиго-PRРежим eincubation). Хотя общее время инкубации такой же в двух различных режимах, предварительная инкубация с сложенными олигонуклеотидов перед добавлением NC позволяет больше времени для резьбы из интеркаляторов в сложенном нуклеиновой кислоты. Это приводит к более сильной стабилизации их динамических структур и в более легкой ингибирование шаперонов деятельности NC. Анализ имя анализа в двух режимах, поэтому повышает различия в механизме действия ингибиторов ЧПУ, как показано на рисунке 4: когда соединение 1 анализировали по названию В режиме олиго-преинкубационного (рис 4, полосы слева) он показывает сильное ингибирование в NC-опосредованной отжига, в то время как гораздо меньше ингибирования наблюдается в режиме NC-преинкубационного (рис 4, дорожки справа). Пожалуйста, обратите внимание, что для определения ингибирующих концентраций в то время как скрининг наборы родственных соединений данного анализа, и в этих условиях каждый экспери-ния должны быть выполнены, по крайней мере в трех экземплярах с использованием близко расположенных концентрации (особенно вокруг значения IC 50). 14

Рисунок 1
Рисунок 1:. НАЗВАНИЕ анализ с полнометражным NC и с укороченным (12-55) NC сложенном смолы и cTAR, каждый 1 мкМ, инкубировали с рекомбинантным NC или (12-55) NC (олиго / NC = 1 / 8) при 0 мин, 15 мин, 30 мин и 1 ч. Смолы и cTAR инкубировали в отсутствие белка (0 мин, 15 мин, 30 мин и 1 ч) были использованы в качестве отрицательного контроля. Сложенный ТАР, сложенный cTAR и гибридные смолы / cTAR, полученный после тепловой денатурации с последующим отжигом в пробирке использовали в качестве контролей. Реакции то перестали использовать Glb SDS. Образцы были решены на 12% полиакриламидном геле в КЭ 1x; После электрофореза нуклеиновых кислот на геле и окрашивали обнаружено на просвечивания.

Фиг.2
Рисунок 2:. Влияние SDS в гель загрузки буфера (GLB) при анализе TAR / cTAR отжиг НК смолы и cTAR, сложенные в TNMg 1x, инкубировали с полнометражных рекомбинантных NC (олиго / NC = 1/8) в течение 3 ч при комнатной температуре или при температуре 37 ° С. GLB GLB или SDS затем добавляли к образцам, инкубированных с ЧПУ. Управление: TAR, cTAR и отжигают гибридный TAR / cTAR (каждый 1 мкм). Электрофорез проводили с использованием 12% полиакриламидном геле в ТВЕ 1x; После электрофореза нуклеиновых кислот на геле и окрашивали обнаружено на просвечивания. Эта цифра была изменена из рисунка S4 в:. Sosic А. и др Проектирование, MedChemComm 4, 1388-1393 синтез и биологическая оценка смолы и cTAR связующих ВИЧ-1 ингибиторов нуклеокапсидных, DOI:. 10.1039 / c3md00212h (2013) ,

"> Рисунок 3
Рисунок 3: () Химическая структура резьбы интеркалятором 1. (б) Влияние многопоточности интеркалятора 1 оцениваться по имени анализа. Сложенные смолы и cTAR, каждый 1 мкм, инкубировали в присутствии указанных концентраций соединения 1 с полноразмерной NC или с (12-55) NC, каждый 8 мкм. Сложенные TAR, сложить cTAR и расширен гетеродуплексный TAR / cTAR были использованы в качестве контроля. Реакции то перестали использовать Glb SDS. Образцы были решены на 12% полиакриламидном геле в КЭ 1x; После электрофореза нуклеиновых кислот на геле и окрашивали обнаружено на просвечивания.

Рисунок 4
Рисунок 4: олиго-инкубация против режимов NC-предварительной инкубации: влияние на имени анализе олиго-инкубация мод.E: сложенном смолы и сложить cTAR, каждый 1 мкМ, предварительно инкубировали с указанными концентрациями резьбы интеркалятора 1 в течение 15 мин, а затем в течение еще ​​15 мин в присутствии полной длины NC (8 мкМ) NC-предварительной инкубации. Режим: указанных концентраций резьбы интеркалятора 1 предварительно инкубируют с полной длины NC (8 мкМ) в течение 15 мин, а затем в течение еще ​​15 мин в присутствии сложенном ТАР и сложить cTAR, каждый 1 мкм. Сложенные TAR, сложить cTAR и расширен гетеродуплексный TAR / cTAR были использованы в качестве контроля. Все реакции были, наконец, перестали использовать Glb SDS. Образцы были решены на 12% полиакриламидном геле в КЭ 1x; После электрофореза нуклеиновых кислот на геле и окрашивали обнаружено на просвечивания.

Discussion

NAME является анализ, который позволяет быстро оценить ингибирование шаперонов деятельности нуклеокапсидного белка ВИЧ-1, интересным объектом в поисках новых лекарств против ВИЧ. NC отжигов быстро и при комнатной температуре в нуклеиновых кислот которых стабильно складывающиеся в противном случае требуют термической денатурации при высокой температуре с последующим тщательным отжигом. Анализ может быть выполнен либо с полной длины NC или усеченной (12-55) NC: в обоих случаях два нуклеиновые кислоты (РНК и ее комплементарной копии ДНК) быстро отжигу. Это согласуется с наблюдением литературы с укороченной NC пептида: отжига инициируют эффективного плавления ствола cTAR последующим взаимодействием ее комплементарной апикальной петли, которая является слабым NC сайт связывания с комплементарной последовательностью смолы апикальной петли, в конечном итоге через несколько нестабильных промежуточных к расширенному отожженном гибрид. 21

NC является очень стабильным протEin и некоторые проблемы при выполнении название могло произойти. Это очень важно, однако, чтобы добавить свежеприготовленные SDS в геле Загрузка буфер, используемый для остановки реакции: если это не достигнуто, гель не будет показывать полосы нуклеиновых кислот в правильной позиции. В самом деле, NC представляет собой белок, нуклеиновая кислота связывания, таким образом, чтобы правильно визуализировать смолы / cTAR гетеродуплекс с помощью гель-электрофореза SDS должен присутствовать в геле загрузочным буфером для денатурации белка и освободить ее из плотного комплекса с нуклеиновыми кислотами. Это также возможность устранения ошибок эксперимента, т.е. формирование сдвинутых полос в течение гель перспективе. Этот эффект особенно очевиден, когда был использован в полный рост НК, как показано на рисунке 2, и связан с наличием высокой базовой N-концевой хвост, имеющий сильное влияние на сводной нуклеиновых кислот.

Наличие терминала основного хвоста делает реакцию отжига труднее быть подавлено, как показанон на рисунке 3 с использованием соединения 1, представитель резьбы интеркалятором, т.е. интеркалятором особенно эффективны при стабилизации Шпилька структуры смолы и о cTAR. На самом деле, этот тип взаимодействия с нуклеиновыми кислотами способствует при выпуклости и петли прерывания непрерывности двойной спирали, что обеспечивает более простой резьбы из объемных заместителей в пар оснований. Стабилизация смолы и cTAR этими связующими нуклеиновых кислот была ранее анализировали с помощью определения повышения температуры плавления двух олигонуклеотидов. 14 Кроме того, увеличение температуры плавления коррелирует с ингибированием отжига, катализируемой ВИЧ-1 NC, что приводит к снижению образования гетеродуплекса TAR / cTAR и о том, что резьбы интеркаляторы являются интересным классом связующих для динамических структур РНК, таких как TAR элемента. 14

Механизм действия вызывается для этих компоunds может быть дополнительно подтверждено путем выполнения анализа названием в различных альтернативных форматов, как показано на рисунке 4: в случае интеркаляторов ингибирование отожженного гетеродуплексе усиливается, когда препарат инкубируют с двух сложенных олигонуклеотидов. Соединения, действующие с разным механизмом действия, такие как прямое связующих белка НК, будет меньше, зависит от различных режима предварительной инкубации. ИМЯ анализ выполняется в двух методов, поэтому могут быть использованы для скрининга библиотек соединений для выявления ингибиторов ЧПУ, а также для оценки Вероятный механизм действия положительных хитов, ища анти-ВИЧ препаратов, направленных на NC. Очевидно, что использование только этих методов при обращении к конкретным механизмом действия, определенных ингибиторов с ЧПУ не является достаточным, и другие подходящие биохимические анализы необходимы, чтобы поддерживать рабочую гипотезу. 14

Наконец, следует подчеркнуть, что имя используется в высшей степениОчищенные ферменты, либо рекомбинантные или синтетические, давая ценную информацию о "в пробирке" ингибирования NC тестируемыми соединениями. Это "сила и слабость" анализа: имя может также дополнить виртуального скрининга и молекулярного моделирования подходы в предварительных шагов программы обнаружения наркотиков, что позволяет быстро создавать и анализировать отношения структура-активность и в конечном итоге перенаправления синтеза и наркотиков дизайн. Однако, как и другие биохимические анализы используются в проектах по разработке лекарственных средств в области ВИЧ, NAME не даст информацию о последствиях предполагаемых ингибиторов в инфицированных вирусом клеток.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cTAR, 29-mer DNA oligo. Desalted. HPLC purified. Metabion International AG Store the stock  solution at -20 °C 
TAR, 29-mer RNA oligo. Desalted. HPLC purified.   Metabion International AG Store the stock aliquot at -80 °C 
(12-55)NC peptide EspiKem srl Store the stock solution at -20 °C
1.5 ml tubes Eppendorf 0030 120 086 Autoclave before use
0.5 ml tubes Eppendorf 0030 121 023 Autoclave before use
Biosphere Filter Tips 0.1-10 µl Sarstedt 701,130,210
Biosphere Filter Tips 2-20 µl Sarstedt 70,760,213
Biosphere Filter Tips 200 µl Sarstedt 70,760,213
Syringe Filter 0.22 µm Biosigma srl 51,798
Ethanol Carlo Erba 414631
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich 71725-50G
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8418-1L
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71376-1KG
Boric Acid Sigma-Aldrich B0252-2.5KG
Ethylenediaminetetraacetic Acid Sigma-Aldrich E5134-500G
Magnesium Perchlorate Sigma-Aldrich 222283-100G Store the 1 M solution at -20 °C
Glycerol Sigma-Aldrich 49770-1L
Bromophenol Blue GE Healthcare Life Sciences 17-1329-01
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine Sigma-Aldrich T9281-100ML
Ammonium Persulfate Sigma-Aldrich A7460-500G Prepare the 10% solution freshly before use
Acrylamide-bis ready-to-use solution 40% (19:1) Merck Millipore 1006401000 Polyacrylamide is highly neurotoxic: wear gloves during the gel casting
Tris ultrapure Applichem A1086,1000
DEPC-treated water Ambion AM9922
Centrifuge 5415R Eppendorf 22,621,408
NanoDrop 1000 spectrometer Thermo Scientific
UV-VIS spectrometer Lambda 20 Perkin Elmer
Protean II xi Cell Bio-Rad 165-1803
PowerPac Basic Power Supply Bio-Rad 164-5050
SybrGreen II RNA Gel Staining Lonza 50523 Make the 1/10,000 dilution in TBE 1x. Store it in the dark at 4 °C for two weeks.
Geliance 600 Imaging System Perkin Elmer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Druillennec, S., et al. A mimic of HIV-1 nucleocapsid protein impairs reverse transcription and displays antiviral activity. Proc Natl Acad Sci USA. 96, 4886-4891 (1999).
  2. Darlix, J. L., Garrido, J. L., Morellet, N., Mely, Y., de Rocquigny, H. Properties, functions, and drug targeting of the multifunctional nucleocapsid protein of the human immunodeficiency virus. Adv Pharmacol. 55, 299-346 (2007).
  3. Thomas, J. A., Gorelick, R. J. Nucleocapsid protein function in early infection processes. Virus Res. 134, 39-63 (2008).
  4. Mirambeau, G., Lyonnais, S., Gorelick, R. J. Features, processing states, and heterologous protein interactions in the modulation of the retroviral nucleocapsid protein function. RNA Biol. 7, 724-734 (2010).
  5. Zeng, Y., et al. Probing nucleation, reverse annealing, and chaperone function along the reaction path of HIV-1 single-strand transfer. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 12651-12656 (2007).
  6. Basu, V. P., et al. Strand transfer events during HIV-1 reverse transcription. Virus Res. 134, 19-38 (2008).
  7. Guo, J., Henderson, L. E., Bess, J., Kane, B., Levin, J. G. Human immunodeficiency virus type 1 nucleocapsid protein promotes efficient strand transfer and specific viral DNA synthesis by inhibiting TAR-dependent self-priming from minus-strand strong-stop DNA. J Virol. 71, 5178-5188 (1997).
  8. Godet, J., Mely, Y. Biophysical studies of the nucleic acid chaperone properties of the HIV-1 nucleocapsid protein. RNA Biol. 7, 687-699 (2010).
  9. Darlix, J. L., et al. Flexible nature and specific functions of the HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 410, 565-581 (2011).
  10. Lapadat-Tapolsky, M., Pernelle, C., Borie, C., Darlix, J. L. Analysis of the nucleic acid annealing activities of nucleocapsid protein from HIV-1. Nucleic Acids Res. 23, 2434-2441 (1995).
  11. Vo, M. -N., Barany, G., Rouzina, I., Musier-Forsyth, K. Mechanistic studies of mini-TAR RNA/DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. J Mol Biol. 363, 244-261 (2006).
  12. Beltz, H., et al. Structural determinants of HIV-1 nucleocapsid protein for cTAR DNA binding and destabilization, and correlation with inhibition of self-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 348, 1113-1126 (2005).
  13. Mori, M., et al. Nucleocapsid Protein: a Desirable Target for Future Therapies against HIV-1. Curr Top Microbiol Immunol. , Forthcoming Forthcoming.
  14. Sosic, A., et al. Design, synthesis and biological evaluation of TAR and cTAR binders as HIV-1 nucleocapsid inhibitors. MedChemComm. 4, 1388-1393 (2013).
  15. Tabarrini, O., et al. Studies of Anti-HIV Transcription Inhibitor Quinolones: Identification of Potent N1-Vinyl Derivatives. Chemmedchem. 5, 1880-1892 (2010).
  16. Hagan, N., Fabris, D. Direct mass spectrometric determination of the stoichiometry and binding affinity of the complexes between nucleocapsid protein and RNA stem-loop hairpins of the HIV-1 Psi-recognition element. Biochemistry. 42, 10736-10745 (2003).
  17. Ivanyi-Nagy, R., Davidovic, L., Khandjian, E. W., Darlix, J. L. Disordered RNA chaperone proteins: from functions to disease. Cell Mol Life Sciences: CMLS. 62, 1409-1417 (2005).
  18. Zagotto, G., et al. Tuning G-quadruplex vs double-stranded DNA recognition in regioisomeric lysyl-peptidyl-anthraquinone conjugates. Bioconjug Chem. 22, 2126-2135 (2011).
  19. Carlson, C. B., Vuyisich, M., Gooch, B. D., Beal, P. A. Preferred RNA binding sites for a threading intercalator revealed by in vitro evolution. Chem Biol. 10, 663-672 (2003).
  20. Gooch, B. D., Beal, P. A. Recognition of duplex RNA by helix-threading peptides. J Am Chem Soc. 126, 10603-10610 (2004).
  21. Kanevsky, I., et al. Structural determinants of TAR RNA-DNA annealing in the absence and presence of HIV-1 nucleocapsid protein. Nucleic Acids Res. 39, 8148-8162 (2011).

Tags

Иммунологии выпуск 95 ВИЧ-1 нуклеокапсида белков NCp7 ТАР-РНК ДНК олигонуклеотиды отжиг гель-электрофорез ИМЯ
Нуклеокапсидные отжига опосредованная электрофореза (NAME) Анализ позволяет быстро выявлять ВИЧ-1 нуклеокапсидные ингибиторов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sosic, A., Cappellini, M.,… More

Sosic, A., Cappellini, M., Scalabrin, M., Gatto, B. Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors. J. Vis. Exp. (95), e52474, doi:10.3791/52474 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter